張玉榮，徐 丹，李子孟

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山 316021）

三種海洋微藻對石油烴的降解技術(shù)研究

張玉榮，徐 丹，李子孟

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部重點漁場漁業(yè)資源科學(xué)觀測實驗站，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江舟山 316021）

為了篩選出可以降解石油類的海洋微藻，將微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻在不同濃度的石油烴溶液中培養(yǎng)后測定細(xì)胞密度，葉綠素a和SOD酶變化以及結(jié)束石油烴的剩余量，結(jié)果表明微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻濃度在低于2 mg/L的石油烴中能夠較好的生長，可以用來利用降解一定含有一定濃度石油烴的污染海水。

石油烴；海洋微藻；生物降解

石油類是成分復(fù)雜的混合物，含有多種難以被生物降解的有害物質(zhì)[1,2]。水中較高濃度的石油類不僅影響動植物的攝食、生長和繁殖，導(dǎo)致不可逆的組織損傷，而且可以在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈傳遞，影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，進而危害人類健康[3-5]。海洋是石油類污染物的最終匯聚地，隨著開采、加工以及使用石油類化合物總量的增加，通過各種途徑進入海洋的石油類化合物總量日益增加，導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失衡，生物多樣性指數(shù)減小，漁業(yè)資源的產(chǎn)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降[6-7]，據(jù)統(tǒng)計，從20世紀(jì)70年代到21世紀(jì)初，全球排入海洋中的石油大約有565 900 t，我國每年直接排入近海的石油約10×104t，僅漁業(yè)損失每年就達數(shù)億元[8]。就浙江省而言，海洋石油污染狀況同樣嚴(yán)重，2014年浙江省重點海灣海水質(zhì)量調(diào)查報告顯示，杭州灣、象山港（灣）、三門灣、臺州灣、樂清灣、溫州灣幾乎都屬于劣四類水質(zhì)海域，石油類是海洋污染的主要要素之一[9]。因此，入海石油類的治理事關(guān)海洋經(jīng)濟能否持續(xù)健康發(fā)展。

我國自上世紀(jì)90年代以來開始了石油生物修復(fù)研究并取得進展，中國海洋大學(xué)白潔等[10]系統(tǒng)開展了優(yōu)勢石油降解菌的最適生長條件、對石油烴的降解作用和在污染環(huán)境修復(fù)中的作用等研究，培育的混合菌株在實驗室條件下對石油烴的降解率可達90%[11]；楊仕美等采用分子生物學(xué)和生理生化等方法進行高效生物菌株篩選、馴化和培養(yǎng)，優(yōu)育出多種適用于海洋石油污染治理的生物菌群；暨南大學(xué)在近海石油污染環(huán)境中篩選出高效、耐酸、耐高鹽、適用范圍廣的菌株，構(gòu)建了石油降解菌群，實現(xiàn)了吸油材料聚氨酯泡沫（PUF）對石油降解菌的固定化，提高了降解率[12]；王佳楠等[13]對4株芽胞桿菌屬菌株構(gòu)建微生物組進行石油降解實驗，實驗表明同菌屬微生物種間對石油的降解同時存在協(xié)同促進和拮抗抑制作用。

經(jīng)過多年的努力，生物修復(fù)技術(shù)得到快速發(fā)展并進入實踐應(yīng)用階段，成為一種經(jīng)濟效益與環(huán)境效益俱佳的石油污染治理手段。但是，單靠微生物難以完全去除海洋石油污染、修復(fù)生態(tài)環(huán)境[14]。開發(fā)篩選更豐富、更有效的降解石油的生物資源，已經(jīng)成為國際上該領(lǐng)域的研究熱點。本文通過篩選多種可以降解石油類的微藻，為海洋石油污染的治理提供新的思路和方法，將對海洋生態(tài)的修復(fù)和保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 微藻的培養(yǎng)

微綠球藻Nannochloris oculata、中肋骨條藻Skeletonema costatum和塔瑪亞力山大藻Alexandrium tamarense均購買于中科院海洋所海藻種質(zhì)庫，將天然海水（鹽度27，pH 8.1）用0.45 μm濾膜過濾，高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后備用，將微藻藻種加入2 L的培養(yǎng)瓶，加入f/2培養(yǎng)基。置于光照培養(yǎng)架上擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度20±1℃，每日搖瓶3～4次，

1.2 石油烴的制備

將0號柴油與經(jīng)過濾滅菌的海水按照體積比1：9混合，室溫下用超聲波處理6 h，然后將混合液倒入分液漏斗中靜置5 h，分離出的下層水相為石油烴母液，制備全程避光，用紫外分光光度法測定石油烴母液濃度，石油烴母液4℃避光保存，使用時根據(jù)需要濃度稀釋。

1.3 微藻對石油烴的降解

石油烴對微藻的毒性脅迫實驗在250 mL的三角瓶中進行。將處于對數(shù)生長期的微藻接入不同石油烴濃度梯度的培養(yǎng)瓶中，微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻的WAF的濃度梯度為0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L 和 6 mg/L，分別設(shè)置 3 個平行，分別于接種后 1 d、2 d、3 d、4 d、12 d、19 d、26 d、33 d、40 d、47 d、54 d取樣測定細(xì)胞密度，測定實驗起始和結(jié)束時微藻的葉綠素a和SOD酶變化以及實驗結(jié)束時海水中石油烴的剩余量。

1.4 葉綠素a的測定

葉綠素a含量采用Jeffrey-Humphrey（1975）的改進公式計算：

Chl a=11.85×（E664-E750）-1.54×（E647-E750）-0.08×（E630-E750）v/VL

其中，Chla為葉綠素a濃度，μg/L；v為樣品提取液體積，mL；V為海水樣品實際用量，L；L為測定池光程，cm；E750、E664、E647、E630分別為 750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 波長處的吸光值。

1.5 SOD的測定

SOD采用試劑盒測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 密度變化

從圖1可以看出，微綠球藻在培養(yǎng)周期內(nèi)，空白對照組的細(xì)胞密度呈指數(shù)增長，40 d之后到達平臺期，在12 d之前，2 mg/L處理組的細(xì)胞密度增長緩慢，12 d之后呈指數(shù)增長，33 d之后進入平臺期，4 mg/L和6 mg/L處理組培養(yǎng)期間增長緩慢。

從圖2可以看出，中肋骨條藻在培養(yǎng)期間，空白對照組的細(xì)胞密度呈現(xiàn)指數(shù)增長，培養(yǎng)33 d之后到達平臺期，在前4 d之前，2 mg/L處理組的細(xì)胞密度增長緩慢，4 d之后呈現(xiàn)指數(shù)增長，54 d之后進入平臺期，但平臺期的密度卻高于空白對照組的密度，4 mg/L處理組的細(xì)胞密度有一定程度的增長，6 mg/L處理組的細(xì)胞密度幾乎未增長。

從圖3可以看出，塔瑪亞歷山大藻在培養(yǎng)期間，在12 d之前，空白對照組的細(xì)胞密度培養(yǎng)增長緩慢，12 d之后呈現(xiàn)指數(shù)增長，47 d之后進入平臺期，2 mg/L處理組細(xì)胞增長情況和空白對照組的較為一致，也是47 d之后進入平臺期，但進入平臺期的密度高于空白對照組。4 mg/L和6 mg/L處理組增長緩慢。

結(jié)果表明，低于2 mg/L得到石油烴條件下，微綠球藻和中肋骨跳蚤和塔瑪亞歷山大藻生長狀態(tài)良好，實驗結(jié)束時的微綠球藻的最終濃度甚至高于對照組（圖1），中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻的最終濃度稍低于對照組（圖2和圖3），4 mg/L和6 mg/L處理組的三種微藻的生長均受到抑制，6 mg/L處理組的微綠球藻和塔瑪亞力山大藻幾乎未增長（圖1～3）。

圖1 不同石油烴濃度培養(yǎng)期間微濾球藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of Nannochloris oculata during the incubation period of different hydrocarbon concentrations

圖2 不同石油烴濃度培養(yǎng)期間中肋骨條藻的生長曲線Fig.2 Growth curve of Skeletonema costatum during the incubation period of different hydrocarbon concentrations

圖3 不同石油烴濃度培養(yǎng)期間塔瑪亞力山大藻的生長曲線Fig.3 Growth curve of Alexandrium tamarense during the incubation period of different hydrocarbon concentrations

2.2 葉綠素a濃度

微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞力山大藻在0、2、4和6 mg/L的WAF中培養(yǎng)2個月之后，葉綠素a濃度和起始相比的變化情況如圖4、5和6所示，三種實驗微藻在不同石油烴溶液中培養(yǎng)2個月之后，2 mg/L處理的微綠球藻和中肋骨條藻的葉綠素a濃度比對著高，塔瑪亞力山大藻的葉綠素a濃度稍低于對照組，4 mg/L和6 mg/L處理組的葉綠素a均高于起始濃度，但低于對著組。結(jié)果表明，低于2 mg/L得到石油烴條件下，微綠球藻和中肋骨跳蚤和塔瑪亞歷山大藻的葉綠素a濃度和對照組無差異，4 mg/L和6 mg/L處理組的三種微藻的葉綠素a濃度均小于對照組和2 mg/L處理組（圖4、5和6）

2.3 SOD

由表1可知，微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻的起始SOD分別為21.02×10-8U/cell、33.6×10-8U/cell和45.8×10-8U/cell，結(jié)束時，微綠球藻的對照組和2.0 mg/L的SOD分別增加7.3和2.4%，4.0 mg/L降低21.5%，6.0 mg/L降低51.1%，中肋骨條藻的對照組和和2.0 mg/L的SOD分別增加1.5和2.7%，4.0 mg/L降低15.5%，6.0 mg/L降低38.1%，塔瑪亞力山大藻的對照組和和2.0 mg/L的SOD分別降低了0.7和7.6%，4.0 mg/L降低29.3%，6.0 mg/L降低57.4%。結(jié)果表明，三種微藻的對照組和2.0 mg/L處理組起始和結(jié)束時的SOD差異不大，4.0 mg/L和6.0 mg/L處理組結(jié)束時的SOD顯著降低，說明三種微藻受到高濃度石油烴的傷害。

圖4 在不同濃度石油烴培養(yǎng)條件下微綠球藻起始和結(jié)束的葉綠素a濃度Fig.4 The beginning and the end chlorophyll a concentration of N.oculata in different culture conditions of petroleum hydrocarbon

圖5 在不同濃度石油烴培養(yǎng)條件下中肋骨條藻起始和結(jié)束的葉綠素a濃度Fig.5 The beginning and the end chlorophyll a concentration of S.costatum in different culture conditions of petroleum hydrocarbon

圖6 在不同濃度石油烴培養(yǎng)條件下塔瑪亞力山大藻起始和結(jié)束的葉綠素a濃度Fig.6 The beginning and the end chlorophyll a concentration of A.tamarense in different culture conditions of petroleum hydrocarbon

表1 3種微藻培養(yǎng)起始和結(jié)束SOD（×10-8U/cell）變化Tab.1 Initiation and end of SOD(×10-8U/cell)changes in cultures of three microalgae

2.4 石油烴剩余量

由表2可知，實驗起始和終止，三種實驗微藻的各濃度組的石油烴降低的幅度都很大，均在99%以上，其中微綠球藻起始2.0 mg/L降低到0.001，降解率為99.95%，塔瑪亞力山大藻4.0 mg/L降低到0.13，降解率為99.75%，微綠球藻6.0 mg/L，降低到0.050，降解率為99.16%。結(jié)果表明，三種微藻對一定濃度的石油烴均有較理想的降解效果。

表2 微藻在不同濃度石油烴培養(yǎng)后石油烴的剩余量（mg/L）及降幅（%）Tab.2 The beginning and end WAF concentrations of three microalgae cultured

3 結(jié)論

將微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻在不同濃度的石油烴溶液中培養(yǎng)后，通過測定細(xì)胞密度，葉綠素a和SOD酶變化以及結(jié)束石油烴的剩余量，表明微綠球藻、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻濃度在低于2 mg/L的石油烴中能夠較好的生長，許多室內(nèi)和室外的實驗結(jié)果表明，一定濃度的石油烴濃度可以促進浮游植物的大量生長[14]，可以用來利用降解一定含有一定濃度石油烴的污染海水。

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Study on the Degradation of Petroleum Hydrocarbons by Three Kinds of Marine Microalgae

ZHANG Yu-rong,XU Dan,LI Zi-meng
(Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds,Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

In order to filter out marine microalgae can degrade petroleum,three species of marine microalgaes including Nannochloris oculata,Skeletonema costatum and Alexandrium tamarense were cultured in different concentrations of petroleum hydrocarbons.By measuring cell density,changes in chlorophyll a and SOD enzymes,and the end of residual petroleum hydrocarbons,the results showed that the Noculata,Scostatum and Atamarense in the petroleum hydrocarbon below 2 mg/L can growed well,can be used to water pollution by degradation must contain a certain concentration of petroleum hydrocarbon.

petroleum hydrocarbons;marine microalgae;biodegradation

X55

A

1008－830X(2017)03－0253－04

2017-02-16

浙江省科技計劃項目（2016F30023）

張玉榮（1982-），女，江蘇徐州人，工程師，研究方向：海洋環(huán)境影響評價及海域使用論證.E-mail:yurongzhang2008@163.com