楊繼華 陳 冰 黃燕華 曹俊明* 王國霞 孫育平 陳曉瑛

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣州510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣州510642；3.廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；4.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能、體成分、抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響

楊繼華1,2,3,4陳 冰1,3,4黃燕華1,3,4曹俊明1,3,4*王國霞1,3,4孫育平1,3,4陳曉瑛1,3,4

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣州510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣州510642；3.廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；4.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

本試驗(yàn)旨在研究飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚生長性能、體成分、血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響。選取初始體重為(1.51±0.02) g的吉富羅非魚840尾，隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾魚。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼料中添加50、100、300、500和1 000 mg/kg的桑葉黃酮。飼養(yǎng)期56 d。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，各組采用亞硝酸鈉進(jìn)行72 h應(yīng)激試驗(yàn)。結(jié)果表明：1)各組間吉富羅非魚增重率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率均差異不顯著(P>0.05)。各組間吉富羅非魚魚體水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均差異不顯著(P>0.05)。2)試驗(yàn)組血清超氧化歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)均高于對照組，其中100、300、500和1 000 mg/kg桑葉黃酮組血清SOD活性，50、500、1 000 mg/kg桑葉黃酮組血清GSH-Px活性及100、500 mg/kg桑葉黃酮組血清T-AOC顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，試驗(yàn)組血清丙二醛(MDA)含量均顯著降低(P<0.05)。100、300和500 mg/kg桑葉黃酮組肝臟過氧化氫酶(CAT)、SOD活性和T-AOC顯著高于對照組(P<0.05)；肝臟GSH-Px活性以500 mg/kg桑葉黃酮組最高，顯著高于1 000 mg/kg桑葉黃酮組(P<0.05)。3)亞硝酸鹽氮應(yīng)激48和72 h，50、100、500 mg/kg桑葉黃酮組的累計(jì)死亡率顯著低于對照組(P<0.05)。由此可見，飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能沒有顯著影響，但提高了血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力。本試驗(yàn)條件下，通過回歸方程分析，以血清SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)，得出吉富羅非魚幼魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為100 mg/kg；以肝臟SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)，得出吉富羅非魚幼魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為371.00～441.75 mg/kg。

桑葉黃酮；吉富羅非魚；生長性能；抗氧化；亞硝酸鹽

桑葉在我國種植廣泛，其含有多種天然活性物質(zhì)。黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一，占桑葉干重的1%～3%[1]，而黃酮類化合物具有廣泛的生理功能，具有抗腫瘤、降壓、降血糖、抗氧化、抗衰老等生理功能[2]。一些研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮化合物能顯著清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[3-4]。潘劍用等[5]發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮對3種氧中心自由基——羥基自由基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)和超氧陰離子自由基(O-2·)具有較強(qiáng)的清除活性。桑葉黃酮能提高大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性[6]，也能增強(qiáng)偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)和銅離子(Cu2+)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)抗氧化能力[4]。然而，目前關(guān)于桑葉黃酮在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

羅非魚是世界上一種重要的養(yǎng)殖魚類，吉富羅非魚(genetic improvement of farmed tilapia, GIFT,Oreochromisniloticus)是遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚，其生長速度快、出肉率高、遺傳性狀穩(wěn)定[7]。隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高，各種氧化應(yīng)激因素不斷增加，對羅非魚的生長、抗病等性能產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，因而利用天然植物生物活性物質(zhì)提高魚體的抗氧化性能，對羅非魚健康養(yǎng)殖具有重要意義。為此，本試驗(yàn)以吉富羅非魚為研究對象，在飼料中分別添加不同水平的桑葉黃酮，觀察其對吉富羅非魚生長性能、體成分、血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響，以期為桑葉黃酮在羅非魚飼料中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)飼料

桑葉黃酮由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工所提供(純度77.9%)。以魚粉、豆粕和菜籽粕為蛋白質(zhì)源，高筋面粉為糖源，豆油和磷脂油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼料中添加50、100、300、500和1 000 mg/kg的桑葉黃酮。飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩，微量成分采取逐級擴(kuò)大法添加，桑葉黃酮先溶于水，然后混入各組飼料中。用混合機(jī)混合，混合均勻后，加適量水在攪拌機(jī)中攪拌均勻，用SLX-80型雙螺桿擠壓機(jī)(華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠生產(chǎn))、G-500型造粒機(jī)(華南理工大學(xué)科技實(shí)業(yè)總廠生產(chǎn))制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，55 ℃烘干，自然冷卻后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)魚和養(yǎng)殖管理

吉富羅非魚由廣東羅非魚良種場提供。馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。系統(tǒng)由24個(gè)玻璃纖維桶和2個(gè)過濾池等部分組成，纖維桶容積均為350 L(直徑90 cm，高80 cm，水體容積300 L)，進(jìn)水速率為1.5 L/min；過濾池中鋪有珊瑚石和活性炭。試驗(yàn)開始時(shí)，選取健康、活潑、初始體重為(1.51±0.02) g的吉富羅非魚840尾，隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)35尾魚。每天分別在08:30和18:00投喂2次，飽食投喂。養(yǎng)殖水源為經(jīng)沙濾、消毒后的自來水，水溫25～31 ℃。養(yǎng)殖過程中不斷充氧曝氣，溶氧>7.0 mg/L，pH 7.5～8.0，氨氮濃度≤0.10 mg/L，亞硝酸鹽濃度≤0.01 mg/L。飼養(yǎng)期56 d。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克維生素預(yù)混料含有 One kilogram of multi-vitamin premix contained the following：VA 3 200 000 IU，VD 31 600 000 IU，VE 16 g，VK 4 g，VB14 g，VB28 g，VB64.8 g，VB1216 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 16 g，葉酸 folic acid 1.28 g，生物素 biotin 64 mg，煙酸 nicotinic acid 28 g，肌醇 inositol 40 g，水分 moisture≤10%。

2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有 One kilogram of mineral premix contained the following：Mg 9 g，K 36 g，Met-Cu，1.5 g，F(xiàn)e 10 g，Zn 8 g，Ca 230 g，Co 250 mg，Mn 1.9 g，I 32 mg，Se 50 mg，水分 moisture≤10%。

3)營養(yǎng)水平為實(shí)測值。Nutrient levels were measured values.

1.3樣本采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，魚體饑餓24 h，稱終末體重，統(tǒng)計(jì)存活率。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5尾魚，測定體長與體重，計(jì)算肥滿度。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚，用于測定全魚體成分。隨機(jī)從每個(gè)重復(fù)取10尾魚尾部靜脈采血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，保存于-20 ℃冰箱，用于測定血清抗氧化指標(biāo)。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)另取5尾魚，分離內(nèi)臟和肝臟，稱重，計(jì)算臟體比和肝體比，將肝臟樣品保存于-80 ℃冰柜中備用。

肝臟上清液制備：稱取一定質(zhì)量的肝臟樣品，加9倍體積的0.80%預(yù)冷生理鹽水，在冰水浴中進(jìn)行勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存，用于測定肝臟抗氧化指標(biāo)。

1.4指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能和形態(tài)學(xué)指標(biāo)計(jì)算

存活率(survival rate，SR，%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；增重率(weight gain ratio，WGR，%)=100×[終末平均體重(g)-初始平均體重(g)]/初始平均體重(g)；飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=投飼總量(g)/[終末體重(g)-初始體重(g)]；蛋白質(zhì)效率(protein efficiency rate，PER，%)=100×[終末體重(g)-初始體重(g)]/[飼料干物質(zhì)攝入量(g)×飼料粗蛋白質(zhì)含量(%)]；肥滿度(condition factor，CF，g/cm3)=100×體重(g)/體長(cm)3；臟體比(viscerosomatic index，VSI，%)=100×內(nèi)臟重(g)/體重(g)；肝體比(hepatosomatic index，HSI，%)=100×肝臟重(g)/體重(g)。

1.4.2 飼料及全魚常規(guī)營養(yǎng)成分含量測定

水分含量采用105 ℃烘箱烘干至恒重的方法(GB/T 6435—1986)測定，粗蛋白質(zhì)含量利用半自動凱氏定氮儀采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測定，粗脂肪含量采用乙醚抽提的方法(GB/T 6433—1994)測定，粗灰分含量采用550 ℃灼燒至恒重的方法(GB/T 6438—1992)測定。

1.4.3 抗氧化指標(biāo)測定

血清和肝臟上清液用試劑盒進(jìn)行抗氧化指標(biāo)測定，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體測定方法參照試劑盒所附說明書。SOD活性采用羥胺法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用比色法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光法測定，總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測定，丙二醛(MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)法測定。

1.5亞硝酸鹽應(yīng)激試驗(yàn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，采用亞硝酸鈉進(jìn)行應(yīng)激試驗(yàn)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚。應(yīng)激期間停止循環(huán)水，向水體(體積100 L)中加入亞硝酸鈉溶液，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度達(dá)到16 mg/L。觀察魚發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡尾數(shù)，計(jì)算24、48和72 h內(nèi)累計(jì)死亡率(cumulative mortality rate，CMR)：

累計(jì)死亡率(%)=100×應(yīng)激結(jié)束后死亡魚尾數(shù)/應(yīng)激魚尾數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏均值多重比較法對試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性進(jìn)行分析處理，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能和飼料利用的影響

由表2可知，各組間吉富羅非魚的增重差異不顯著(P>0.05)，其中500 mg/kg桑葉黃酮組的增重率比對照組升高了6.9%。試驗(yàn)組吉富羅非魚的飼料系數(shù)均低于對照組，但與對照組差異不顯著(P>0.05)。各組間吉富羅非魚的蛋白質(zhì)效率差異不顯著(P>0.05)。各組間吉富羅非魚的肥滿度、臟體比差異不顯著(P>0.05)，而1 000 mg/kg桑葉黃酮組的肝體比顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2桑葉黃酮對吉富羅非魚全魚體成分的影響

由表3可知，各組間吉富羅非魚全魚的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量差異不顯著(P>0.05)，其中500和1 000 mg/kg桑葉黃酮組粗蛋白質(zhì)含量比對照組分別升高了5.6%和7.6%。

表2 桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能和飼料利用的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 桑葉黃酮對吉富羅非魚全魚體成分的影響(濕重基礎(chǔ))

2.3桑葉黃酮對吉富羅非魚血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，各組間吉富羅非魚血清CAT活性差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)組吉富羅非魚血清GSH-Px活性均高于對照組，1 000 mg/kg桑葉黃酮組血清GSH-Px活性顯著高于其他各組(P<0.05)，50、500 mg/kg桑葉黃酮組血清GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05)。100、300、500和1 000 mg/kg桑葉黃酮組吉富羅非魚血清SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，其中300 mg/kg桑葉黃酮組最高。試驗(yàn)組吉富羅非魚血清T-AOC均高于對照組，其中100和500 mg/kg桑葉黃酮組顯著高于對照組(P<0.05)。各組吉富羅非魚血清MDA含量隨著桑葉黃酮添加水平的增加呈先降低后升高的趨勢，與對照組相比，試驗(yàn)組血清MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

根據(jù)折線模型，經(jīng)線性回歸分析桑葉黃酮添加水平(Y)與血清SOD活性、T-AOC之間的關(guān)系，以血清SOD活性(X)為評價(jià)指標(biāo)，獲得折線方程Y=41.31-0.043(100.00-X) (R2=0.735 2)，得出吉富羅非魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為100.00 mg/kg；以血清T-AOC(X)為評價(jià)指標(biāo)，作回歸直線可到方程Y=0.011 7X+8.355 0 (R2=0.735 2)，Y=-0.000 8X+9.431 4 (R2=0.989 4)，通過折線法求得吉富羅非魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為98.75 mg/kg。

由表5可知，100、300、500和1 000 mg/kg桑葉黃酮組吉富羅非魚肝臟CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)，其中500 mg/kg桑葉黃酮組最高。吉富羅非魚肝臟GSH-Px活性以500 mg/kg桑葉黃酮組最高，顯著高于1 000 mg/kg桑葉黃酮組(P<0.05)，與其他各組差異不顯著(P>0.05)。吉富羅非魚肝臟SOD活性、T-AOC隨著桑葉黃酮添加水平的增加呈先升高后降低的趨勢，100、300和500 mg/kg桑葉黃酮組肝臟SOD活性和T-AOC較對照組均顯著升高(P<0.05)。各組間吉富羅非魚肝臟MDA含量差異不顯著(P>0.05)。

采用拋物線模型擬合回歸方程分析桑葉黃酮添加量(Y)與肝臟SOD、T-AOC之間的關(guān)系，以肝臟SOD活性(X)為評價(jià)指標(biāo)，得到方程Y=-0.000 3X2+0.222 6X+168.423 4 (R2=0.953 5)，得出吉富羅非魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為371.00 mg/kg；以肝臟T-AOC(X)為評價(jià)指標(biāo)，得到方程Y=-0.000 002X2+0.001 767X+0.366 188 (R2=0.952 6)，得出吉富羅非魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為441.75 mg/kg。

表4 桑葉黃酮對吉富羅非魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

表5 桑葉黃酮對吉富羅非魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.4桑葉黃酮對吉富羅非魚抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響

亞硝酸鹽應(yīng)激24、48和72 h內(nèi)各組吉富羅非魚的累積死亡率如表6所示。24 h時(shí)，各組間累計(jì)死亡率差異不顯著(P>0.05)，其中對照組最高,為22.7%，試驗(yàn)組在7.5%～17.7%之間。48 h時(shí)，對照組累計(jì)死亡率為41.3%，顯著高于50、100、500 mg/kg桑葉黃酮組(P<0.05)，而且該3組的累計(jì)死亡率均在20%左右，與24 h對照組的數(shù)據(jù)相當(dāng)。72 h時(shí)，試驗(yàn)組累計(jì)死亡率均低于對照組，其中50、100、500 mg/kg桑葉黃酮組顯著低于對照組(P<0.05)。

表6 桑葉黃酮對吉富羅非魚抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響

3 討 論

3.1桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能和飼料利用的影響

目前，桑葉資源在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用主要是作為飼料原料替代魚粉。一些研究發(fā)現(xiàn)，桑葉替代飼料中部分魚粉不降低消化率，反而能提高魚類的特定生長率，這表明桑葉中含有一些能促進(jìn)魚類生長的活性成分[8-9]。而黃酮類化合物是桑葉中含量非常豐富的活性成分。曲培濱[10]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮能顯著提高斷奶犢牛的體長指數(shù)和增重。一些天然黃酮類化合物也能影響動物生長，槲皮素類似物二氫楊梅素以2 400 mg/kg水平添加到飼料中能顯著提高羅非魚的增重率和特定生長率[11]，槐屬植物黃酮以200 mg/kg水平添加到飼料中也能顯著提高羅非魚增重率[12]。Shin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%槲皮素能顯著提高牙鲆(Paralichthysolivaceus)的增重率。本試驗(yàn)中，飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚增重率和飼料系數(shù)均無顯著影響，表明一定添加水平的桑葉黃酮不影響吉富羅非魚的生長性能。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道不一致，這可能與本試驗(yàn)中吉富羅非魚生長性能受存活率不一致的影響有關(guān)，也可能是因?yàn)樯Ｈ~黃酮并不具備促進(jìn)吉富羅非生長的作用。目前黃酮類化合物對動物的生長作用并沒有統(tǒng)一的結(jié)論。在綿羊[14]、崇仁麻雞[15]的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加苜蓿黃酮對生長性能沒有顯著影響。趙偉等[16]研究表明，沙棘葉黃酮對肉雞的平均日增重和料重比的影響不顯著。大豆黃酮能顯著促進(jìn)羅非魚[17]、鯉魚(Cyprinuscarpio)生長[18]，其原理是大豆黃酮屬于異黃酮類植物雌激素，能促進(jìn)垂體生長激素(GH)的生成和釋放[17]。桑葉黃酮類化合物中目前并沒有發(fā)現(xiàn)異黃酮類植物激素，這說明桑葉黃酮和大豆黃酮促進(jìn)動物生長的作用機(jī)制可能不一樣。營養(yǎng)物質(zhì)的代謝是影響動物生長的重要因素，桑葉黃酮可以提高斷奶前犢牛飼糧代謝能和氮的生物學(xué)價(jià)值，提高斷奶后犢?？偰艽x率和氮的利用率[19]。推測這是桑葉黃酮能提高羅非魚生長的原因之一。目前相關(guān)研究較少，關(guān)于桑葉黃酮促進(jìn)羅非魚生長的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，飼料添加桑葉黃酮對吉富羅非魚肥滿度、臟體比沒有顯著影響，1 000 mg/kg桑葉黃酮組肝體比顯著低于其他組，這與槐屬植物黃酮可以顯著提高羅非魚肥滿度的發(fā)現(xiàn)[12]并不一致。這些差異可能與黃酮的來源、動物的生長階段有關(guān)。也有研究表明，飼料中添加大豆黃酮對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的肝體比、肥滿度、臟體比無顯著影響[20-21]，添加芒果葉黃酮對鯉魚肥滿度、肝胰指數(shù)和臟體比無顯著影響[22]。

3.2桑葉黃酮對吉富羅非魚體成分的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚全魚粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、水分含量沒有產(chǎn)生顯著影響，但一定程度提高了粗蛋白質(zhì)含量。黃酮類物質(zhì)對動物體成分的影響作用并不完全一致。大豆黃酮顯著降低了大菱鲆幼魚魚體的粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量[20-21]。而在美洲鰻(Anguillarostrata)研究中發(fā)現(xiàn)，向飼料中添加的大豆黃素對魚體成分沒有顯著影響[23]。槲皮素能降低高血脂大鼠體內(nèi)脂肪的累積[24]。沙棘葉黃酮可以提高肉雞肌肉脂肪含量[16]。這可能是由于動物的種類、生長階段、黃酮類化合物的來源及添加水平的不同等所導(dǎo)致的。

3.3桑葉黃酮對吉富羅非魚血清和肝臟抗氧化能力的影響

動物機(jī)體會因細(xì)胞活動和各種應(yīng)激產(chǎn)生許多自由基，過多的氧自由基會破壞細(xì)胞膜的完整性，進(jìn)而對生物體造成一種氧化脅迫狀態(tài)。當(dāng)氧化脅迫超出了生物體抗氧化防御系統(tǒng)的保護(hù)能力的時(shí)候，就會引起組織和細(xì)胞氧化損傷[25-26]。活性氧(ROS)是細(xì)胞信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖調(diào)控的胞內(nèi)信使，而過多的活性氧也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化[27-28]。廣泛存在于各種組織細(xì)胞中SOD，可催化氧自由基形成過氧化氫(H2O2)。而H2O2在CAT、GSH-Px的作用下分解為H2O，從而達(dá)到消除自由基的作用。GSH-Px中的巰基也能與活性氧結(jié)合，抑制脂質(zhì)過氧化物的生成[29]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能異常，其含量既可以衡量機(jī)體的抗氧化狀態(tài)又間接反映細(xì)胞損傷水平。本試驗(yàn)中，100、300、500和1 000 mg/kg桑葉黃酮組吉富羅非魚血清SOD活性高于對照組，100、300和500 mg/kg桑葉黃酮組肝臟SOD活性和T-AOC均高于對照組，表明桑葉黃酮具有提高清除羅非魚體內(nèi)過多活性氧的作用，這也可以從相應(yīng)添加組魚體內(nèi)MDA含量的降低得到進(jìn)一步證實(shí)。通過回歸方程分析，以血清SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)得出吉富羅非魚幼魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為100 mg/kg，以肝臟SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)得出吉富羅非魚幼魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為371.00～441.75 mg/kg。有研究報(bào)道，對四氧嘧啶糖尿病小鼠模型灌胃桑葉黃酮能提高肝臟SOD活性，降低血清MDA含量[6,30]。體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桑葉水提物中的黃酮類化合物槲皮素能增強(qiáng)AAPH和Cu2+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞抗氧化能力[4]，從桑葉甲醇提取物中分離出的3種黃酮(槲皮素、山奈酚、蕓香苷)對AAPH誘導(dǎo)人紅細(xì)胞氧化溶解的抑制呈時(shí)效和量效關(guān)系，其中蕓香苷能顯著降低人紅細(xì)胞中谷胱甘肽的損耗[31]。由此可知，桑葉黃酮不僅依賴自身具有還原活性的羥基參與機(jī)體中自由基的清除，而且還能通過調(diào)節(jié)機(jī)體中抗氧化酶的活性起到抗氧化作用。在關(guān)于黃酮類化合物的作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能使轉(zhuǎn)錄因子DAF-16轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，進(jìn)而通過信號通路對線蟲(Caenorhabditiselegans)的氧化應(yīng)激、衰老等進(jìn)行調(diào)控[32]?？梢酝茰y桑葉黃酮有可能通過影響吉富羅非魚的相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力，但尚需要更深入的研究。

3.4桑葉黃酮對吉富羅非魚抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力的影響

亞硝酸鹽是造成魚類氧化應(yīng)激的一種常見應(yīng)激因子，其毒害作用主要表現(xiàn)為影響魚類的正常呼吸和代謝以及對魚體生理指標(biāo)和組織器官造成嚴(yán)重影響[33]。目前，關(guān)于桑葉黃酮對魚類抗亞硝酸鹽應(yīng)激的影響還未見報(bào)道。在本試驗(yàn)結(jié)果中，亞硝酸鹽應(yīng)激后24、48和72 h時(shí)，飼料添加桑葉黃酮各組吉富羅非魚的死亡率均低于對照組，其中50、100、500 mg/kg桑葉黃酮組在后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別顯著降低；進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)累計(jì)死亡率達(dá)到20%左右時(shí)，對照組出現(xiàn)在24 h，而試驗(yàn)組則延遲到48 h。這說明，桑葉黃酮能夠提高吉富羅非魚幼魚抗亞硝酸鹽的應(yīng)激能力，不僅能夠降低高濃度亞硝酸鹽應(yīng)激后一定時(shí)間內(nèi)吉富羅非魚的死亡率，而且能夠延緩吉富羅非魚發(fā)生死亡的時(shí)間。桑葉黃酮能降低亞硝酸鹽應(yīng)激下羅非魚的死亡率作用機(jī)理可能是：亞硝酸鹽會導(dǎo)致血細(xì)胞活性氧含量過度上升[34]，而桑葉黃酮能夠清除活性氧[4]；桑葉黃酮利用自身具有還原活性的羥基清除機(jī)體的自由基，以及通過調(diào)節(jié)機(jī)體中抗氧化酶的活性清除機(jī)體的自由基。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加桑葉黃酮對吉富羅非魚生長性能沒有顯著影響，但提高吉富羅非魚血清和肝臟抗氧化指標(biāo)及抗亞硝酸鹽應(yīng)激能力。

② 本試驗(yàn)條件下，通過回歸方程分析，以血清SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)得出吉富羅非魚幼魚飼料中桑葉黃酮適宜添加水平為100 mg/kg，以肝臟SOD活性、T-AOC為評價(jià)指標(biāo)得出其適宜添加水平為371.00～441.75 mg/kg。

[1] 廖森泰,肖更生.桑樹活性物質(zhì)研究[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2012:13.

[2] 朱丹,袁芳,孟坤,等.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007,22(6):387-389.

[3] KIM S Y,GAO J J,LEE W C,et al.Antioxidative flavonoids from the leaves ofMorusalba[J].Archives of Pharmacal Research,1999,22(1):81-85.

[4] KIM G N,JANG H D.Flavonol content in the water extract of the mulberry (MorusalbaL.) leaf and their antioxidant capacities[J].Journal of Food Science,2011,76(6):C869-C873.

[5] 潘劍用,汪志平,黨江波,等.夏桑葉的體外抗氧化活性及其主要功能成分研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2011,25(4):754-759.

[6] 李向榮,方曉,俞靈鶯.桑葉黃酮抗氧化及抑制蛋白糖基化作用[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2005,31(2):203-206.

[7] DEY M M,GUPTA M V.Socioeconomics of disseminating genetically improved Nile tilapia in Asia:an introduction[J].Aquaculture Economics & Management,2000,4(4):5-11.

[8] MONDAL K,KAVIRAJ A,MUKHOPADHYAY P K.Effects of partial replacement of fishmeal in the diet by mulberry leaf meal on growth performance and digestive enzyme activities of Indian minor carpLabeobata[J].International Journal of Aquatic Science,2012,3(1):72-83.

[9] KAVIRAJ A,MONDAL K,MUKHOPADHYAY P K,et al.Impact of fermented mulberry leaf and fish offal in diet formulation of Indian major carp (Labeorohita)[J].Proceedings of the Zoological Society,2013,66(1):64-73.

[10] 曲培濱.桑葉黃酮和熱帶假絲酵母對犢牛生長性能、屠宰性能、肉品質(zhì)及血清指標(biāo)的影響[D].碩士學(xué)位論文.邯鄲:河北工程大學(xué),2015.

[11] 蔡英華,舒緒剛,張磊.二氫楊梅素對羅非魚生長、免疫和抗氧化機(jī)能的影響[J].廣東飼料,2010,19(12):19-21.

[12] 劉淑蘭.不同水平槐屬植物黃酮對羅非魚生長及肝胰臟抗氧化能力的影響[D].碩士學(xué)位論文.廈門:集美大學(xué),2012.

[13] SHIN H S,YOO J H,MIN T S,et al.Effect of quercetin on the activity and mRNA expression of antioxidant enzymes and physiological responses in olive flounder (Paralichthysolivaceus) exposed to cadmium[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2010,23(6):742-749.

[14] 王夢竹,劉艷豐,王文奇,等.苜蓿黃酮對綿羊生長性能和血清指標(biāo)的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2015,42(9):2345-2351.

[15] 歐陽克蕙,熊小文,王文君,等.苜蓿黃酮對崇仁麻雞生長性能及肌肉化學(xué)成分的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(4):340-345.

[16] 趙偉,陳鑫,劉紅南,等.沙棘葉黃酮對肉雞生長性能及胴體品質(zhì)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2012,24(1):117-123.

[17] 余祖功,夏德全,吳婷婷.大豆黃酮對奧利亞羅非魚生長及相關(guān)激素水平、血液生化指標(biāo)的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,26(2):183-185.

[18] 徐增洪.大豆黃酮在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究[J].淡水漁業(yè),2005,35(6):41-43.

[19] 楊春濤,刁其玉,曲培濱,等.熱帶假絲酵母菌與桑葉黃酮對犢牛營養(yǎng)物質(zhì)代謝和瘤胃發(fā)酵的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(1):224-234.

[20] 郭海燕,張彥嬌,麥康森,等.染料木黃酮對大菱鲆生長、消化酶活力和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,40(9):30-36.

[21] 胡海濱,劉金桃,李彥先,等.飼料中大豆黃酮對大菱鲆生長、消化酶活力、抗氧化力及腸道結(jié)構(gòu)的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2014,38(9):1503-1513.

[22] 呂小文,郝倩,陳業(yè)淵,等.飼料添加芒果葉黃酮浸膏促進(jìn)魚類生長[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2013,29(18):277-283.

[23] 葉繼丹,陳學(xué)豪.大豆黃素對美洲鰻生長及肝、腸組織中幾種代謝酶活性的影響[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然版,2008,13(1):1-6.

[24] 周玉生,陽學(xué)風(fēng).槲皮素對大鼠酒精性脂肪肝的治療作用[J].中國處方藥,2005(10):80-81.

[25] RITOLA O,LYYTIKINEN T,PYLKK? P,et al.Glutathione-dependent defence system and monooxygenase enzyme activities in Arctic charrSalvelinusalpinus(L.) exposed to ozone[J].Aquaculture,2000,185(3/4):219-233.

[26] BHOR V M,RAGHURAM N,SIVAKAMI S.Oxidative damage and altered antioxidant enzyme activities in the small intestine of streptozotocin-induced diabetic rats[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2004,36(1):89-97.

[27] SOHN J H,HAN K L,LEE S H,et al.Protective effects of panduratin a against oxidative damage of tert-butylhydroperoxide in human HepG2 cells[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2005,28(12):1083-1086.

[28] 李建喜,楊志強(qiáng),王學(xué)智.活性氧自由基在動物機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)作用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(10):33-36.

[29] 李勇,孔令青,高洪,等.自由基與疾病研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(4):85-88.

[30] HONG H C,LI S L,ZHANG X Q,et al.Flavonoids with α-glucosidase inhibitory activities and their contents in the leaves ofMorusatropurpurea[J].Chinese Medicine,2013,8:19.

[31] CHOI J,KANG H J,KIMS Z,et al.Antioxidant effect of astragalin isolated from the leaves ofMorusalbaL. against free radical-induced oxidative hemolysis of human red blood cells[J].Archives of Pharmacal Research,2013,36(7):912-917.

[32] KAMPK?TTER A,TIMPEL C,ZURAWSKI R F,et al.Increase of stress resistance and lifespan ofCaenorhabditiselegansby quercetin[J].Comparative Biochemistry and Physiology,Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2008,149(2):314-323.

[33] 李波.氨氮和亞硝酸鹽對黃顙魚的毒性研究[D].碩士學(xué)位論文.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[34] XIAN J A,WANG A L,CHEN X D,et al.Cytotoxicity of nitrite on haemocytes of the tiger shrimp,Penaeusmonodon,using flow cytometric analysis [J].Aquaculture,2011,317:240-244.

*Corresponding author, professor, E-mail: junmcao@163.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Mulberry Leaf Flavonoids on Growth Performance, Body Composition, Antioxidant Indices and Resistance to Nitrite Exposure of Genetic Improvement of Farmed Tilapia (Oreochromis niloticus)

YANG Jihua1,2,3,4CHEN Bing1,3,4HUANG Yanhua1,3,4CAO Junming1,3,4*WANG Guoxia1,3,4SUN Yuping1,3,4CHEN Xiaoying1,3,4

(1. Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. College of Marine Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3. Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China; 4. Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangzhou 510640, China)

This experiment was conducted to investigate the effects of dietary mulberry leaf flavonoids (MLF) on growth performance, body composition, serum and liver antioxidant indices and resistance to nitrite exposure of juvenile genetic improvement of farmed tilapia (GIFT,Oreochromisniloticus). A total of 840 GIFT with an initial body weight of (1.51±0.02) g were randomly divided into 6 groups with 4 replicates per group and 35 fish per replicate. Fish in the control group were fed a basal diet, and the others in the experimental groups were fed basal diets supplemented with 50, 100, 300, 500 and 1 000 mg/kg MLF, respectively. The feeding trial lasted for 56 days. After the feeding trial, sodium nitrite was used to conduct a nitrite exposure trial in each group for 72 h. The results showed as follows: 1) there were no significant differences on the weight gain ratio (WGR), feed conversion ratio (FCR) and protein efficiency rate (PER) of GIFT among all groups. (P>0.05). There were no significant differences in the crude protein, crude lipid, ash and moisture contents of GIFT whole body among all groups (P>0.05). 2) The serum superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) activities and total antioxidant (T-AOC) in experimental groups were higher than in control group. The serum SOD activities in 100, 300, 500, and 1 000 mg/kg MLF groups were significantly higher than those in control group (P<0.05), the serum GSH-Px activities in 50, 500 and 1 000 mg/kg MLF groups were significantly higher than those in control group (P<0.05), the serum T-AOC in 100 and 500 mg/kg MLF groups were significantly higher than those in control group (P<0.05). Compared with the control group, the serum malondialdehyde (MDA) contents in experimental groups were significantly decreased (P<0.05). The liver SOD, catalase (CAT) activities and T-AOC in 100, 300 and 500 mg/kg MLF groups were significantly higher than those in control group (P<0.05). The highest value of liver SOD activity was observed in 500 mg/kg MLF group, and significantly higher than that in 1 000 mg/kg MLF group (P<0.05). 3) After 48 and 72 h nitrite exposure, the cumulative mortality rates in 50, 100 and 500 mg/kg MLF groups were significant lower than those in control group (P<0.05). In conclusion, dietary MLF do not significantly affect the growth performance, but improve the serum and liver antioxidant indices and resistance to nitrite exposure of GIFT. Under the experimental conditions, by analysis of the regression equation, the optimal supplemental level of MLF in the diet of juvenile GIFT is 100 mg/kg basis of SOD activity and T-AOC in serum; the optimal supplemental level of MLF in the diet of juvenile GIFT is 371.00 to 441.75 mg/kg basis of SOD activity and T-AOC in liver.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3403-3412]

mulberry leaf flavonoids;Oreochromisniloticus; growth performance; antioxidant; nitrite

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.046

2017-03-01

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項(xiàng)目(201520)；廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行經(jīng)費(fèi)(2014B030301054)；廣東省水產(chǎn)飼料和飼料添加劑效價(jià)評估公共服務(wù)平臺建設(shè)(2015A040404033)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201707010355)；2016年省級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)(2016LM082，2016LM083)

楊繼華(1992—)，男，湖南衡陽人，碩士研究生，從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料的研究。E-mail： 553842026@qq.com

*通信作者：曹俊明，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： junmcao@163.com

S963.16

：A

：1006-267X(2017)09-3403-10