李 委 戴祖云 夏偉偉 王雯雯

（1安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥230061）

一種快速提取南瓜大群體基因組DNA的方法

李 委1，2戴祖云1夏偉偉1王雯雯1

（1安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥230061）

基因型鑒定是作物分子標(biāo)記輔助育種和基因功能遺傳分析中十分重要的環(huán)節(jié)，此項技術(shù)的應(yīng)用正日漸頻繁，因而迫切需要一種高通量篩選的方法。本試驗以南瓜中篩選到的互補型SSR引物為驗證手段，在種子階段比較了鉆孔法和萌芽法采用堿煮法提取DNA的效果，并且在成熟植株階段驗證了各組織部位采用堿煮法提取DNA的效果。結(jié)果表明：使用萌芽的南瓜種子根尖以堿煮法提取DNA是可用于種子純度測定的快速方法；成熟植株各部位采用堿煮法提取DNA均可用于植株基因型篩選。

南瓜；基因型鑒定；分子育種；堿煮法

南瓜（Cucurbita moschata Duch. ex Poir.）作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，近年來受到越來越多研究者的重視。早在2009年國際葫蘆科遺傳學(xué)會年報上就發(fā)表了南瓜中的136個性狀或生化控制基因，以及部分性狀的連鎖分子標(biāo)記的研究結(jié)果（Paris & Kabelka，2009）。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，南瓜作物上有越來越多的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，研究者試圖通過分子生物學(xué)手段來完成南瓜的種質(zhì)親緣關(guān)系確立、雜交種純度測定、遺傳圖譜構(gòu)建等工作（Paris et al.，2003；朱海生 等，2015）。而以上種種技術(shù)均依賴于DNA的大批量提取，傳統(tǒng)的CTAB提取法耗時耗力且會使用到有毒試劑（趙茜和徐麗珍，2011；王迎兒 等，2015）。近年來堿煮法被廣泛應(yīng)用于玉米、小麥、大豆等作物的DNA提取（王偉威 等，2008；鄭淑波 等，2015），同時還有研究者嘗試將種子鉆孔法和堿煮法結(jié)合起來，建立一種無損提取DNA的方法（程文 等，2016）。

目前在南瓜上進(jìn)行的分子標(biāo)記工作眾多，但大多采用傳統(tǒng)提取方法（李鶴 等，2014；朱海生 等，2015），尚未有堿煮法提取的報道。本試驗分別在種子和成熟植株兩個階段驗證了堿煮法所提DNA用于SSR-PCR的效果，嘗試解決南瓜植株的高通量篩選問題，以期為分子育種技術(shù)的優(yōu)化提供 參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司提供的南瓜品種江蜜8號及其父本L-817、母本玉-041，種子于2016年10月采集自安徽合肥長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農(nóng)業(yè)示范園區(qū)。

試驗所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 DNA提取

CTAB法提取DNA參照王瑞等（2011）的方法。堿煮法參照鄭淑波等（2015）、程文等（2016）的方法，稍有改動。鉆孔法：采用微型電鉆在南瓜種子上打孔，鉆取出來的子葉粉末落在紙上后，小心移入96孔PCR板中，鉆孔后的種子留存?zhèn)溆?；使?5%乙醇清潔鉆頭，以吸水紙擦拭干凈，然而處理下一個樣品；待收集完后，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液30 μL，置入PCR儀中，99 ℃處理10 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=6.0）30 μL，輕輕混勻后2 500×g離心30 s，吸取上清作為模板進(jìn)行后續(xù)PCR檢測。萌芽法：在種子生出芽根后，截取根尖約1 cm長的組織，放入96孔PCR板中，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液80 μL，置入PCR儀中，99 ℃處理30 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=6.0）80 μL，輕輕混勻后2 500×g離心30 s，吸取上清作為模板進(jìn)行后續(xù)PCR檢測。

1.3 PCR檢測

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：1×PCR Buffer 1 μL，200 μmol·L–1dNTPs 1 μL，0.5 μmol·L–1引物2 μL，1 U Taq DNA Polymerase（康為世紀(jì)公司）0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補足20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液2 μL，于3%瓊脂糖凝膠中電泳。引物序列為CMTm224F：GTGGGTCGCTCCTTAAA，CMTm224R：ATAGCGGATAAAGTGGACTG；引物由Invitrogen公司合成。篩選所用的引物庫為Gong等（2008）公布的200對SSR引物。

1.4 發(fā)芽試驗

隨機取鉆孔后的種子和完整種子各100粒，浸種4 h后置于30 ℃催芽箱內(nèi)，3 d后統(tǒng)計出芽率；3次重復(fù)。同時，取根長約3 cm的種子播于基質(zhì) 〔每立方米基質(zhì)含草炭0.75 m3，蛭石0.13 m3，珍珠巖0.12 m3，石灰石3.0 kg，過磷酸鈣（20% P2O5）1.0 kg，三元復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶1）1.5 kg，消毒干雞糞10 kg〕中，出苗10 d后測定株高，每處理隨機測定20株，取平均值；3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及序列比對

以江蜜8號及其父母本為試材，首先采用傳統(tǒng)CTAB法提取DNA為模板，經(jīng)過篩選，確定CMTm224為雙親互補型引物對。如圖1所示，CMTm224引物對在父本中可擴增出1條141 bp大小的條帶；在母本中可擴增出1條123 bp大小的條帶；在一代雜種中可擴增出2條條帶，大小分別為141 bp和123 bp。經(jīng)過測序比對（圖2），父、母本在該位點的重復(fù)基序均為CT（n），且除重復(fù)基序的長度不同外，其余序列十分相似。經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對，父、母本序列的相似度為96%。

圖1 江蜜8號及其父母本PCR檢測結(jié)果

圖2 江蜜8號父、母本序列比對結(jié)果

2.2 兩種取材方法的比較

參照程文等（2016）的方法，從單粒南瓜種子上以鉆孔法獲取組織材料；另外，從萌芽的南瓜種子上取根尖材料。采用堿煮法提取DNA，以CMTm224為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果如圖3所 示，采用鉆孔法提取DNA，父本和母本均可擴增出清晰的條帶，而一代雜種的條帶較模糊；采用萌芽法提取DNA，父母本與一代雜種均可擴增出清晰的條帶。

圖3 鉆孔法與萌芽法提取DNA的PCR檢測結(jié)果

從表1可以看出，不同取材方法對南瓜種子的發(fā)芽率無顯著影響，但株高和簡易活力指數(shù)兩處理間差異達(dá)顯著水平。

表1 不同取材方法對南瓜種子活力的影響

2.3 不同體積Tris-HCl緩沖液對DNA提取的影響

為驗證堿煮法中所加Tris-HCl緩沖液的作用，設(shè)加入80、40、4 μL Tris-HCl緩沖液3個處理，分別提取DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測。如圖4所示，80 μL 和40 μL Tris-HCl緩沖液處理的DNA模板均擴增出清晰條帶，而4 μL Tris-HCl緩沖液處理的DNA模板未能擴增出條帶。由表2可知，這3組DNA的濃度分別為479、711、886 ng·μL-1；OD260/OD280的比值從1.60遞減至1.51，OD260/OD230的比值處于0.7～0.8區(qū)間內(nèi)，表明隨著加入Tris-HCl緩沖液體積的減少，所得DNA中的蛋白質(zhì)、糖類及鹽類等雜質(zhì)逐漸增多；pH值的變化最為明顯，80 μL Tris-HCl緩沖液處理和40 μL Tris-HCl緩沖液處理的pH值分別為7.0和7.4，而4 μL Tris-HCl緩沖液處理則達(dá)到了9.8。

圖4 不同體積Tris-HCl緩沖液提取DNA的PCR檢測結(jié)果

表2 不同體積Tris-HCl緩沖液對提取DNA質(zhì)量的影響

2.4 成熟植株各組織部位所提DNA的PCR檢測結(jié)果

為驗證成熟植株各組織部位對于堿煮法提取DNA的適應(yīng)性，分別切取江蜜8號及其父母本植株根、莖、葉、花瓣、花蕊、果實，采用堿煮法提取DNA，以CMTm224為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果如圖5所示，南瓜成熟植株各組織部位所提DNA均可擴增出清晰條帶。可見在成熟植株的基因型鑒定中亦可選取易于得到的組織部位，使用堿煮法完成DNA提取。

圖5 成熟植株各組織部位所提DNA的PCR檢測結(jié)果

2.5 南瓜幼苗SSR-PCR鑒定結(jié)果

為驗證堿煮法在批量鑒定中的應(yīng)用情況，從田間隨機選取100株江蜜8號植株進(jìn)行順序編號，采用堿煮法提取DNA，進(jìn)行SSR-PCR檢測。結(jié)果如圖6所示，21號、27號和77號均被鑒定為母本植株。經(jīng)田間表型觀察，21號、27號和77號這3株植株葉型小、始終短蔓簇生，為母本植株的表型性狀；除這3株外，其余植株葉型偏大、近根處為短蔓簇生、5節(jié)左右以后變?yōu)殚L蔓，為一代雜種的表型性狀。由此可以驗證堿煮法適用于大批量的成熟植株基因型篩選。

圖6 南瓜幼苗SSR-PCR鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來，以南瓜為研究對象，采用集團(tuán)分離分析法、近等基因系法與SSR、ISSR等標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，篩選出了一系列與功能性狀相連鎖的分子標(biāo)記（王瑞 等，2011；王冬杰 等，2014）。其中王瑞等（2011）報道了1個AFLP標(biāo)記，該標(biāo)記與南瓜短蔓基因之間存在連鎖關(guān)系。而本試驗中所用江蜜8號的母本即為短蔓，至于采用的CMTm224標(biāo)記是否也與短蔓基因存在連鎖關(guān)系，尚需更深入的研究。另外，進(jìn)一步擴大引物的篩選范圍，或者使用更高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行篩選，均是下一步可能的工作計劃。

近年來，關(guān)于從南瓜中提取DNA進(jìn)行后續(xù)研究的報道很多，但多為使用傳統(tǒng)CTAB或SDS方法，其弊端為使用到氯仿等有毒試劑或是操作步驟較繁瑣，難以應(yīng)對大批量篩選。與此同時，一種快速有效的堿裂解法正被越來越多的應(yīng)用到花生、玉米、小麥和水稻等作物的轉(zhuǎn)基因植株鑒定和分子標(biāo)記輔助育種上（Xu et al.，2005；Collard et al.，2007）。采用堿裂解法提取的DNA含有蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)，且有可能造成長片段斷裂等問題；但是由于SSR等分子標(biāo)記技術(shù)所涉及到的片段一般很小，大多在200 bp左右，且對于PCR模板的質(zhì)量要求也不嚴(yán)苛，因此反而適宜使用快捷的堿煮法。本試驗以萌發(fā)種子的根尖和成熟植株的各組織器官作為材料，進(jìn)行了堿煮法提取DNA效果的對比測試，證實了使用各部位的植物材料，配以堿煮法進(jìn)行提取，所得到的DNA完全能夠滿足分子標(biāo)記的擴增要求，同時整個操作的成功率高、效 率好。

另外，在堿煮法的基礎(chǔ)上，近年來許多研究者嘗試建立各種植物種子的無損基因型鑒定技術(shù)（鄭淑波 等，2015；程文 等，2016）。本試驗證實，通過鉆孔小心獲取子葉的少量材料，所提取的父母本DNA可通過后續(xù)PCR產(chǎn)生清晰條帶，但一代雜種所產(chǎn)生的條帶稍顯模糊，推測這可能與操作中材料污染有關(guān)。同時鉆孔后種子的萌發(fā)率與未鉆孔相比，沒有顯著差異，因而總體上可以認(rèn)為鉆孔法基本能滿足基因型鑒定和種子后續(xù)萌發(fā)的雙重需求。試驗過程中南瓜種子在被鉆取后進(jìn)行催芽，有一部分出現(xiàn)了發(fā)霉的現(xiàn)象。鄭淑波等（2015）曾對切除胚乳的玉米種子進(jìn)行包衣以提高其活力，取得了成功，因此這一問題也許可以通過對種子進(jìn)行包衣得到解決。

但是，上述方法也存在無法應(yīng)用高通量篩選的問題，譬如獲取子葉材料的過程中，由于種皮來源于母體，故需先用砂紙磨掉一塊種皮后再鉆孔取樣，以防母體DNA的污染。再加上每取完一粒種子后鉆頭需徹底清潔掉其上的粉末，否則也極易污染其他樣品，因此該方法在速度上無法得到提升，并不適用于大批量鑒定的情況。因此建議在測定種子純度時，使用萌芽法取根尖組織以堿煮法提取DNA后配合SSR-PCR來進(jìn)行純度測定。而在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株篩選的時候，從幼苗上取嫩葉以堿煮法提取DNA可能會是比較便捷的 途徑。

程文，夏正俊，馮獻(xiàn)忠，楊素欣．2016．一種快速、無損大豆種子DNA提取方法的建立和應(yīng)用．植物學(xué)報，51（1）：68-73．

李鶴，郭世榮，束勝，徐揚，孫錦．2014．砧用南瓜種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)性狀與SSR標(biāo)記分析．園藝學(xué)報，41（7）：1379- 1390．

王冬杰，葛宇，劉超，李雪，徐文龍，崔崇士，屈淑平．2014．美洲南瓜（Cucurbit pepo）WMV-2抗性遺傳及分子標(biāo)記研究．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（1）：79-83．

王瑞，黃河勛，林毓娥，梁肇均，陳清華．2011．與南瓜短蔓基因連鎖的分子標(biāo)記．園藝學(xué)報，38（s）：2593．

王偉威，孟慶虹，張瑞英，關(guān)海濤，陳凱新，高鋒，趙琳，姚鑫 淼．2008．5種主要農(nóng)作物DNA快速提取方法研究．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，（5）：1-2．

王迎兒，高旭，王毓洪，宋慧，應(yīng)泉盛，張香琴，嚴(yán)蕾艷，張宴 瑜．2015．南瓜耐鹽種質(zhì)的篩選鑒定及耐鹽基因的標(biāo)記．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，27（3）：372-379．

趙茜，徐麗珍．2011．快速提取籽用南瓜基因組DNA方法的研 究．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，（10）：14-15．

鄭淑波，劉宏偉，王敏，張志軍，趙萬慶，劉文國，路明．2015．適用于分子育種的玉米種子無損基因型鑒定技術(shù)優(yōu)化．分子植物育種，13（12）：2865-2870．

朱海生，盧麗芳，陳敏氡．2015．南瓜種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性的ISSR分析．分子植物育種，13（6）：1302-1308．

Collard B C Y，Das A，Virk P S，Mackill D J．2007．Evaluation of quick and dirty DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice（Oryza sativa L．）．Plant Breeding，126（1）：47-50．

Gong L，Stift G，Kofler R，Pachner M，Lelley T．2008．Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L．Theoretical and Applied Genetics，117（1）：37-48．

Paris H S，Yonash N，Portnoy V，Mozes-Daube N，Tzuri G，Katzir N．2003．Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo（Cucurbitaceae）using DNA markers．Theoretical and Applied Genetics，106（6）：971-978．

Paris H S，Kabelka E．2009．Cucurbi genetics cooperative gene list for squash．CGC Report，31-32：44-69．

Xu X，Kawasaki S，F(xiàn)ujimura T，Wang C．2005．A protocol for highthroughput extraction of DNA from rice leaves．Plant Molecular Biology Reporter，23（3）：291-295．

A Rapid DNA Extraction Method for Large Squash Population

LI Wei1，2，DAI Zu-yun1，XIA Wei-wei1，WANG Wen-wen1

（1Anhui Jianghuai Horticulture Seed Co. Ltd.，Hefei 230031，Anhui，China；2College of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230061，Anhui，China）

Genotype identification is an important link in molecular-marker-assisted breeding and genetic analysis of gene function．Since this method is used more and more frequently，researchers need a high-throughput technique．This experiment took a pair of SSR primers of complementary type as the method，and compared the effect of extracting DNA from cotyledon and root during seedling stage．The effect of extracting DNA from each tissue of the plant by NaOH-boiling method during maturing stage was also verified．The results indicated that extracting DNA from root with NaOH-boiling method was a rapid way to measure seed purity．Therefore，extracting DNA with NaOH-boiling method from all tissues of the matured plant could be used for screening plant genotype．

Squash；Genotype identification；Molecular breeding；NaOH-boiling method

李委，男，博士，講師，專業(yè)方向：分子遺傳學(xué)，E-mail：childelee@126.com

2017-02-04；接受日期：2017-07-03

安徽省科技攻關(guān)計劃項目（1501142220）