朱曉換， 張杜宇， 鐘守慧， 任秋蓉， 王亞男*

(1. 四川師范大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)研究室， 四川 成都 610101； 2. 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 成都 610064)

土荊芥醇提物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

朱曉換1， 張杜宇2， 鐘守慧1， 任秋蓉1， 王亞男1*

(1. 四川師范大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)研究室， 四川 成都 610101； 2. 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 四川 成都 610064)

為研究土荊芥醇提物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，Hochest染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，分光光度計(jì)法檢測(cè)抗氧化酶相對(duì)活性和丙二醛相對(duì)含量.結(jié)果表明:土荊芥醇提物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且具有時(shí)間和濃度效應(yīng)(P<0.01)，作用12、24、48 h后，其IC50值分別是3.85、3.70和3.28 mg/mL;形態(tài)學(xué)觀察顯示，細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡小體、染色質(zhì)凝集、呈邊緣化分布等典型的凋亡特征;隨土荊芥醇提物濃度增大，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶相對(duì)活性先升高后降低，丙二醛相對(duì)含量先升高，而后保持恒定，在質(zhì)量濃度3.50 mg/mL時(shí)三者均達(dá)到最高值.結(jié)論：土荊芥醇取物抑制MCF-7細(xì)胞增殖是通過擾亂細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.

土荊芥； 醇提物； MCF-7細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 氧化損傷

土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL．) 又名紅澤藍(lán)、臭草等，屬于藜科藜屬，為一年或多年生芳香性草本植物，原產(chǎn)于熱帶美洲，目前在我國廣泛分布[1].土荊芥的藥用價(jià)值始載于《生草藥性備要》，具有除濕、止痛、通經(jīng)等功效，用于治療皮膚濕疹、蛇蟲咬傷、閉經(jīng)等癥[2].近年來一些研究表明土荊芥提取物具有明顯的抗腫瘤作用，如土荊芥揮發(fā)油具有阻滯細(xì)胞周期、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等毒性效應(yīng)，抑制了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖[3]，導(dǎo)致人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴性凋亡[4].許多藥用植物的醇提物也具有抗腫瘤功效，目前有關(guān)土荊芥醇提物的抗腫瘤效應(yīng)的報(bào)道不一致，F(xiàn). R. F. Nascimento等[5]研究表明土荊芥葉醇提物通過抑制腹腔內(nèi)艾氏固體瘤和腹水瘤的形成，顯著提高了荷瘤小鼠存活率；而M. J. Ruffa等[6]研究顯示土荊芥醇提物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖沒有抑制作用，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是不同產(chǎn)地的土荊芥中含有的次生代謝物質(zhì)不同.MCF-7細(xì)胞是從1名69歲的白人女性患者組織樣品中分離得到的乳腺癌細(xì)胞株，常用于研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制.

土荊芥在四川省廣泛分布，具有較大的開發(fā)潛力.本研究以MCF-7細(xì)胞為受試細(xì)胞，以產(chǎn)自四川省成都市的土荊芥為材料，通過MTT法評(píng)價(jià)其醇提物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響，為土荊芥資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 受試細(xì)胞 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 供試植株 實(shí)驗(yàn)所用植株采集于四川省成都市郊區(qū)，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬丹煒教授鑒定確認(rèn)為藜科藜屬土荊芥ChenopodiumambrosioidesL．.

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生牛血清(成都哈里生物工程有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT, Biosharp 生物公司)；Hoechst 33258(碧云天生物技術(shù)研究所，型號(hào)：C1011)；二甲基亞砜(DMSO, Amresco生化公司)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1 法測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所).

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Spectra MaxMZ多功能細(xì)胞分析儀(美國Molecular Devices 公司)；DM300型熒光顯微鏡(德國Leica公司) ；粉碎機(jī)SF-200(泰州市博精制藥機(jī)械有限公司)；真空干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52CS(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)10%的新生牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%的青霉素(質(zhì)量濃度100 U/mL)和鏈霉素(質(zhì)量濃度100 μg/mL)組成的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi).

實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞均于前一天更換新鮮培養(yǎng)液，且處于對(duì)數(shù)生長期，每一實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.

1.5.2 土荊芥醇提物的提取 土荊芥植株于陰涼處晾干，制成干粉，20目篩子過篩，稱取15 g放入錐形瓶中，按3∶40比例加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，超聲波提取30 min，重復(fù)3次，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃恒溫下濃縮，用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥成粉末，即土荊芥醇提物[7].

土荊芥醇提取物得率=

提取物質(zhì)量/土荊芥粉末質(zhì)量×100%.

不同濃度的土荊芥醇提物是將其凍干粉用體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇配制而成.

1.5.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化離心后，以每孔100 μL，密度1×105個(gè)/mL接種于96孔板中.細(xì)胞貼壁后，更換200 μL質(zhì)量濃度分別為 2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mg/mL土荊芥醇提物的新鮮培養(yǎng)液，各濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，以體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇為溶劑對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照.

置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，避光加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL MTT溶液，作用4 h，吸去上清，加入150 μL二甲基亞砜.在波長490 nm處，用多功能細(xì)胞分析儀檢測(cè)吸光度(A)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

1.5.4 Hochest染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 將對(duì)數(shù)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞以每孔2 mL，密度5×104個(gè)/mL接種于放有蓋玻片的六孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁后，更換2 mL質(zhì)量濃度分別為2.50、3.50、5.00 mg/mL土荊芥醇提物的新鮮培養(yǎng)液，以體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇為溶劑對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照.

藥物作用24 h后，加入500 μL 固定液在4 ℃下作用10 min， PBS清洗2次，加入500 μL Hoechst 33258 染色液染色5 min，PBS清洗2次，取10 μL PBS緩沖液于潔凈載玻片上，將長有細(xì)胞的蓋玻片緩慢蓋于載玻片上，立即在暗室內(nèi)熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.5.5 抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定將對(duì)數(shù)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞以每瓶3 mL，密度3×105個(gè)/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁后，更換3 mL質(zhì)量濃度分別為2.50、3.50、4.50、5.00 mg/mL土荊芥醇提物的新鮮培養(yǎng)液，以體積分?jǐn)?shù)25%的乙醇為溶劑對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照.

藥物作用24 h后，按試劑盒說明書操作，分別測(cè)定細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥醇提物得率 15 g土荊芥粉末經(jīng)超聲波提取法得到1.529 g提取物，提取率為10.19%.

2.2 土荊芥醇提物抑制MCF-7細(xì)胞增殖 土荊芥醇提物對(duì)MCF-7細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.

由圖1可知土荊芥醇提物可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長，且具有時(shí)間和濃度效應(yīng)(P<0.01).當(dāng)土荊芥醇提物質(zhì)量濃度達(dá)到5.00 mg/mL，其對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制率接近 80%，表明絕大部分MCF-7細(xì)胞已死亡.

應(yīng)用Microsoft Excel 2010作回歸方程，土荊芥醇提物對(duì)MCF-7細(xì)胞作用時(shí)間為12、24和48 h 時(shí)，其半致死質(zhì)量濃度IC50值分別為3.85、3.70、3.28 mg/mL.

**：P<0.01

2.3 土荊芥醇提物誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 土荊芥醇提物作用MCF-7細(xì)胞24 h后，經(jīng)Hochest 33258染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，結(jié)果見圖2.對(duì)照組中細(xì)胞核染色均勻，呈正常的藍(lán)色(圖2A).土荊芥醇提物處理組細(xì)胞中染色質(zhì)凝集，呈邊緣化，或呈碎塊狀致密濃染，細(xì)胞核周圍出現(xiàn)凋亡小體，表現(xiàn)出典型的凋亡特征(圖2B、C和D箭頭所示).隨著處理濃度的增大，凋亡小體的數(shù)目逐漸增多(圖2C)，呈碎塊狀致密濃染的細(xì)胞核越來越多(圖2D).

A、B、C、D土荊芥醇提物質(zhì)量濃度分別為0、2.50、3.50、5.00 mg/mL

2.4 土荊芥醇提物誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞氧化損傷 不同劑量的土荊芥醇提物作用MCF-7細(xì)胞24 h后，對(duì)SOD、CAT相對(duì)活性和MDA相對(duì)含量的影響見圖3.

土荊芥醇提物可激活SOD、CAT活性，隨處理劑量升高，細(xì)胞中SOD、CAT相對(duì)活性均增高(P<0.01)，在質(zhì)量濃度3.50 mg/mL時(shí)達(dá)到最高值，分別為124.95%、22.39%.隨處理劑量的增加，MDA含量逐漸升高后趨于穩(wěn)定(P<0.01)，在3.50 mg/mL時(shí)達(dá)到最高值，為74.74%.結(jié)果表明，土荊芥醇提物干擾 MCF-7 細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷.

圖3 土荊芥醇提物對(duì)抗氧化酶相對(duì)活性和MDA相對(duì)含量的影響

3 討論

許多藥用植物的醇提物具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng).文獻(xiàn)[8]發(fā)現(xiàn)阿魏菇醇提物能顯著抑制人食管癌Eca109細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖.顏晰等[9]研究表明，連翹根醇提物通過JAK/STAT和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)線粒體內(nèi)源途徑誘導(dǎo)食管癌TE-13細(xì)胞凋亡.文獻(xiàn)[10]發(fā)現(xiàn)土荊芥葉醇提物可增強(qiáng)小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞活性，提高機(jī)體免疫力，推測(cè)這可能是其具有抗腫瘤效應(yīng)的原因之一.文獻(xiàn)[5]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 mg/kg土荊芥葉醇提物注射到植入固體瘤或腹水瘤的小鼠體內(nèi)，一定時(shí)間后測(cè)定固體瘤的生長狀況或腹水的體積和癌細(xì)胞數(shù)目，證明土荊芥葉醇提物能有效抑制Ehrlich固體瘤和腹水瘤的形成，從而提高荷瘤小鼠的存活率.本研究采用的土荊芥醇提物是用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇從土荊芥全株制成的干粉中提取、濃縮、冷凍、干燥所得[7]，其主要成分為黃酮類物質(zhì).本研究結(jié)果表明該醇提物顯著抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖，處理24 h時(shí)，其IC50值為3.70 mg/mL，明顯低于土荊芥揮發(fā)油對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值(9.45 μg/mL)[11]，表明土荊芥醇提物的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于其揮發(fā)油的，其原因可能是由于醇提物和揮發(fā)油的有效成分差異較大造成的.

植物的次生代謝物質(zhì)具有明顯的細(xì)胞毒性，當(dāng)受到這些次生代謝物質(zhì)作用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)等活性氧(ROS)[12]，導(dǎo)致質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化生成的MDA，破壞蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)[13]，引起氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞生長受阻.氧化損傷與細(xì)胞凋亡之間存在一定的關(guān)系.文獻(xiàn)[14]發(fā)現(xiàn)，人工半合成的4種大黃素蒽醌衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ROS增加，線粒體膜電位降低，從而抑制人口腔鱗癌KB細(xì)胞及其多藥耐藥株KBv200細(xì)胞生長，這一結(jié)果顯示大黃素蒽醌衍生物可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.化療藥物如長春新堿和順鉑同樣也是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起腫瘤細(xì)胞凋亡[15].本研究結(jié)果表明，在土荊芥醇提物作用下，細(xì)胞的SOD和CAT相對(duì)活性先升高后下降，MDA相對(duì)含量升高，表明土荊芥醇提物引起了MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激，Hochest染色結(jié)果顯示細(xì)胞染色質(zhì)固縮且呈邊緣化、出現(xiàn)凋亡小體等明顯的凋亡特征.由此可見，土荊芥醇提物抑制MCF-7細(xì)胞增殖是通過誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.

致謝 2016大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目和四川師范大學(xué)開放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)本文給予了資助,謹(jǐn)致謝意.

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(編輯 陶志寧)

The Effects of Ethanol Extract fromChenopodiumambrosioideson MCF-7 Cell Proliferation

ZHU Xiaohuan1， ZHANG Duyu2， ZHONG Shouhui1， REN Qiurong1， WANG Yanan1

(1.CellBiologyLaboratory，SichuanNormalUniversity，Chengdu610101，Sichuan； 2.CollegeofLifeScience，SichuanUniversity，Chengdu610064，Sichuan)

To investigate the effects of ethanol extract fromChenopodiumambrosioideson proliferation inhibition of human breast cancer cells MCF-7 and its relative mechanism, MTT assay, Hochest staining and Spectrophotometer method were applied to evaluate the ratio of cell proliferation inhibition, to visualize morphological changes of the nucleus, and the relative activities of cellular superoxide dismutase, catalase and relative content of malondialdehyde inC.ambrosioidesethanol extract treated MCF-7 cells. The results showed that the treatment of ethanol extract fromC.ambrosioidesresulted in the inhibition of MCF-7 cell proliferation in a dose- and time-dependent manner, and its IC50values were 3.85 mg/mL, 3.70 mg/mL, 3.28 mg/mL for 12 h, 24 h, 48 h, respectively. Morphological visualization revealed typical morphologic changes of apoptosis such as the emergence of apoptotic bodies, condensed chromatin and marginalization. With the increasing of the concentration of ethanol extract, relative activities of antioxidant enzymes, superoxide dismutase and catalase, were increased first and then decreased, the relative content of malondialdehyde was increased first and then kept constantly, the highest enzyme activities and MDA content were observed when the concentration of the ethanol extract increased to 3.50 mg/mL. Our results suggested that ethanol extract fromC.ambrosioidesinhibited the proliferation of MCF-7 cells through disrupting cell antioxidant system, inducing cell oxidative damage, and leading to apoptosis.

Chenopodiumambrosioides; ethanol extract; MCF-7 cells; apoptosis; oxidative damage

2016-06-30

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(16ZA0056)

R282

A

1001-8395(2017)04-0531-05

10.3969/j.issn.1001-8395.2017.04.017

*通信作者簡(jiǎn)介：王亞男(1973—),女,副教授,主要從事細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞毒理學(xué)的研究,E-mail：273218760@qq.com