侯文思，李玉潔，王媛媛，陶 虎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

東方粘蟲中腸V-ATP酶A亞基突變體TSCA的原核表達及復(fù)性純化

侯文思1，李玉潔1，王媛媛2，陶 虎1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

根據(jù)得到的東方粘蟲[Mythimnaseparate(Walker)]中腸V-ATPase A亞基(VHA-A)基因(VATPA)，預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建定點突變并復(fù)性。利用Swiss-Model在線預(yù)測VHA-A三維結(jié)構(gòu)，確定突變位點，通過重折疊PCR(Overlap-PCR)技術(shù)構(gòu)建突變基因并將其整合到pET-22b(+)載體上，得到重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中表達，最后通過親和層析純化包涵體蛋白質(zhì)并進行透析復(fù)性。結(jié)果表明，成功構(gòu)建突變基因和融合表達載體，融合蛋白質(zhì)以包涵體形式表達，并得到大量純化的可溶性蛋白。

V-ATP酶A亞基；定點突變；原核表達；包涵體復(fù)性

液泡型ATP酶(V-ATPase)是由14個不同亞基組成的復(fù)合體，作為持家基因廣泛分布于細胞膜系統(tǒng)中[1]。V-ATPase利用水解ATP釋放能量將H+轉(zhuǎn)運到囊泡或胞外，從而維持胞質(zhì)pH的平衡，形成跨膜電化學(xué)勢梯度，為細胞活動的正常進行及各種離子和代謝物的轉(zhuǎn)運提供必不可少的條件[2]。在昆蟲中腸，V-ATPase存在于上皮杯狀柱細胞，是唯一的離子運輸啟動器，嚴格調(diào)控昆蟲中腸的離子運輸[3]。V-ATPase的缺失會導(dǎo)致昆蟲出現(xiàn)病理變化甚至死亡[4]。近年來越來越多的學(xué)者將V-ATP酶作為藥物靶標來研究[5]。已有學(xué)者利用Western雜交和質(zhì)譜等方法鑒定出多種昆蟲中腸的V-ATP酶A亞基可以和蘇云金芽孢桿菌[Bacillusthuringiensis(Bt)]毒素結(jié)合。徐麗娜[6]通過雙向凝膠電泳、配體雜交等方法發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]幼蟲刷狀緣膜囊(Brush border membrane vesicles，BBMV )的V-ATP酶A亞基是Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah、Cry1Ie蛋白的結(jié)合位點。V-ATPase A 亞基是高度保守的催化亞基[7]，研究表明A亞基上walker A motif (GXXXXGKT) 特定殘基具有重要作用：將極端嗜熱桿菌V-ATPase A亞基第232位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔?35位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸能夠降低ADP反饋抑制，提高全酶催化活性[8]。目前，V-ATPase A亞基的重組表達已有文獻報道，如靳婷婷等[9]構(gòu)建原核表達載體在大腸桿菌中表達玉米螟幼蟲中腸A亞基。已有的文獻[10-11]均顯示，原核表達的V-ATPase A亞基在大腸桿菌中均以包涵體形式存在，而利用真核系統(tǒng)表達蛋白質(zhì)代價昂貴。本研究通過分析東方粘蟲[Mythimnaseparata(Walker)]中腸V-ATP酶A亞基核酸結(jié)合區(qū)域，篩選可能提高酶活力的氨基酸位點，進行基因定點突變，通過原核表達、包涵體復(fù)性等方法獲得大量可溶性蛋白質(zhì)，為進一步研究東方粘蟲A亞基的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)，也為相關(guān)抑制劑的開發(fā)和篩選新農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 表達載體pET-22b(+)和大腸桿菌Turbo、BL21(DE3) 為西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究實驗室保存；克隆載體pMD 19-T-Simple購自TaKaRa公司；質(zhì)粒pET-22b(+)-VATPA由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥所提供。

1.1.2 主要生化試劑TaqDNA Polymerase、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ、DNA Marker、核酸酶均購于TaKaRa公司；Pfu DNA Polymerase、蛋白質(zhì)Markers購于Thermo公司；膠回收試劑盒、廣譜蛋白Markers購于康為世紀公司；Bradford試劑盒購于天根生化科技有限公司；Ni-NTA agarose柱購于GE公司；其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自楊凌三力化玻站。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 以嗜熱桿菌(Thermusthermophiles,PDB:3GQ)A亞基氨基酸序列及其突變體TSSA為模板，利用NCBI Blast軟件，與東方粘蟲中腸V-ATPase酶A亞基序列比較，確定東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基突變位點。根據(jù)選定的突變點C254突變?yōu)锳254，T257突變?yōu)镾257，設(shè)計引物(小寫部分為突變位點氨基酸對應(yīng)密碼子)(表1)。

表1 重折疊PCR引物序列Table 1 Primers for Overlap-PCR

利用overlap PCR方法構(gòu)建定點突變基因[12]，以pET-22b(+)-VATPA質(zhì)粒為模板，引物F、RM，F(xiàn)M、R進行PCR擴增，分別擴增出上下游片段A、B；以等量的A、B基因為模板，引物F、R進行PCR擴增并回收。將回收的PCR產(chǎn)物加A尾后與pMD19-T-Simple連接，轉(zhuǎn)化至E.coliTurbo，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與pET-22b(+)載體均進行NdeⅠ、HindⅢ雙酶切并連接，得到表達載體pET-22b(+)-TSCA，轉(zhuǎn)入E.coliTurbo，挑取單克隆進行PCR驗證后測序。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序結(jié)果正確的表達載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，并將其涂布于含氨芐青霉(Amp)的LB平板，過夜培養(yǎng)。挑取陽性單克隆于5 mL含100 mg/L Amp的新鮮LB培養(yǎng)液中37 ℃過夜培養(yǎng)。次日以1% 接種量接種至50 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600≈ 0.6時，將培養(yǎng)物以每管5 mL分裝于4個無菌15 mL EP管中，分別加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1、0.2、0.5和1 mmol/L，于37 ℃誘導(dǎo)表達4 h。 6 000 r/min、4 ℃離心5 min 收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎，于12 000 r/min、4 ℃離心30 min，分別取37 ℃誘導(dǎo)上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.2.3 蛋白質(zhì)復(fù)性與純化 參照文獻[13]，在37 ℃ 條件下以0.2 mmol/L的IPTG終濃度大量誘導(dǎo)(1 L液體LB培養(yǎng)基) pET-22b(+)-TSCA在大腸桿菌BL21中表達5 h，離心取菌體，用Lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl , 150 mmol/L NaCl pH 7.0)重懸，加溶菌酶至150 μg/mL，冰浴30 min，超聲破碎，加入0.5倍體積含15 g/L Triton X-100的洗滌液(100 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)攪拌混勻，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。將沉淀用35 mL含5 g/L Triton X-100的洗滌液重懸，再用勻漿器研磨15 min，12 000 r/min、4 ℃ 離心30 min，棄上清。用不含Triton X-100的洗滌液重復(fù)上述步驟2次。洗滌后將包涵體溶解于35 mL溶解液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)中，室溫攪拌2～3 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，取上清，用0.22 μm濾膜過濾后溶液即為包涵體蛋白液。pET-22b(+)表達的融合蛋白C端含有一個His-tag，可使用Ni-NTA親和層析純化變性后包涵體蛋白。用結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 8.0)平衡Ni-NTA層析柱，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)樣品pH至8.0，以1.5 mL/min流速上樣，用洗滌緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH=6.3)洗去雜蛋白，用洗脫緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，8 mol/L 尿素，pH 4.5)洗脫目的蛋白。收集的洗脫液用Bradford試劑盒測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度后于-80 ℃ 凍存。取適當體積Ni-NTA純化后蛋白質(zhì)樣品用新鮮溶解液稀釋至終體積100 mL，終質(zhì)量濃度0.1～0.2 mg/mL。稀釋后的蛋白質(zhì)樣品于復(fù)性緩沖液Ⅰ(1 mol/L L-精氨酸，1 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)4 ℃透析24 h，12 000 r/min，4 ℃離心30 min，上清繼續(xù)用復(fù)性緩沖液Ⅱ (20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L 苯甲脒，pH 7.3)透析12 h，換新鮮溶液Ⅱ繼續(xù)透析，12 000 r/min，4 ℃離心 30 min，上清為復(fù)性成功的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模和突變位點的選擇

選用與蛋白一級序列相似度最高(一致性65.24%)且已獲得3D蛋白結(jié)構(gòu)的酵母V-ATP酶A亞基( PBD:3J9T )為模板，利用Swiss-Model( http://swissmodel.expasy.org/interactive )軟件進行同源建模，獲得東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基三維結(jié)構(gòu)模型(圖1)。

圖1 東方粘蟲中腸V-ATPase A亞基三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.1 Simulative tertiary structure ofMythimna separata subunit A

2.2 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定

提取重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA轉(zhuǎn)入E.coliTurbo后，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，進行PCR驗證，電泳條帶與預(yù)期大小一致(圖2)，且質(zhì)粒測序結(jié)果正確，重組質(zhì)粒pET-22b(+)-TSCA構(gòu)建成功。

M. DM 2000 DNA marker；1. pET-22b(+)-TSCA的PCR結(jié)果 Result of pET-22b(+)-TSCA gene by PCR

圖2 PCR驗證pET-22b(+)-TSCA表達載體

Fig.2 Identification of pET-22b(+)-TSCA expression vector by PCR

2.3 融合蛋白的表達

將測序驗證正確的pET-22b(+)-TSCA表達載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達菌株中，在37 ℃不同IPTG終濃度誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)表達。融合蛋白分子質(zhì)量理論值約為69.7 ku，目的蛋白與廣譜蛋白標準比對條帶位置正確(圖3)。且不同誘導(dǎo)劑濃度下，菌體超聲破碎后的上清液中均沒有明顯的目的條帶，沉淀中有明顯的目的蛋白條帶。這表明絕大多數(shù)的蛋白以包涵體形式存在，且IPTG終濃度為0.2 mmol/L時沉淀中目的蛋白含量最大。

M. 蛋白質(zhì)標準分子質(zhì)量 Protein molecular weight marker; 1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins without induced by IPTG；2-9:不同濃度IPTG誘導(dǎo)后的上清液和沉淀，IPTG濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L Supernatant and pellet induced by IPTG，and the inducer concentrations were 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1 mmol/L

圖3 37 ℃下不同濃度IPTG表達蛋白的鑒定

Fig.3 Identification of TSCA expression at 37 ℃ under different IPTG concentration

2.4 包涵體的純化與復(fù)性

細胞裂解后的包涵體蛋白質(zhì)用Triton X-100處理，再利用Ni-NTA層析柱純化，上樣后用洗雜蛋白液洗去部分雜蛋白(圖4-A、4-B)。透析液Ⅱ透析后的蛋白質(zhì)為復(fù)性好的可溶性蛋白質(zhì)，經(jīng)10% SDS-PAGE檢測為一條帶，且條帶位置與理論分子質(zhì)量一致(圖4-C)。包涵體用8 mmol/L尿素溶解后，用bradford試劑盒測粗蛋白質(zhì)樣品，其質(zhì)量濃度為4.13 mg/mL，體積約為35 mL。復(fù)性好的蛋白質(zhì)經(jīng)Bradford蛋白質(zhì)點定量試劑盒測得質(zhì)量濃度約為48 μg/mL，體積約為110 mL，一次復(fù)性效率約53%。培養(yǎng)1 L菌體最終可獲得純蛋白質(zhì)約67 mg。

A. pET-22b(+)-TSCA融合蛋白表達分析 Analysis of the expression of pET-22b(+)-TSCA (M.蛋白質(zhì)標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins without induced by IPTG ; 2.IPTG誘導(dǎo)的細胞總蛋白質(zhì) Total cell proteins induced by IPTG ; 3.細胞裂解后上清 Supernatant proteins of cell disruption ; 4.細胞裂解后沉淀 Pellet of cell disruption；5.洗滌后包涵體 Washed inclusion bodies); B.目的蛋白的純化檢測 SDS-PAGE of the purified proteins (M.蛋白質(zhì)標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.Ni-NTA純化后蛋白質(zhì) Recombinant protein purified by Ni-NTA ); C.復(fù)性蛋白質(zhì)的檢測 Analysis of the refolded proteins (M.蛋白質(zhì)標準分子量 Protein molecular weight marker ; 1.重折疊蛋白質(zhì) Refolded proteins)

圖4 TSCA誘導(dǎo)表達與純化檢測

Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression and the purification of recombinant proteins

3 結(jié)論與討論

V-ATPase廣泛存在于真核細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上，由胞內(nèi)的V1結(jié)構(gòu)域和鑲嵌在膜上的V0結(jié)構(gòu)域組成[14]。V 1由A～H 8個亞基組成，具有ATP水解作用；V0由a、d、e、c和c′′亞基組成，負責(zé)質(zhì)子運輸。酵母包含1個額外的亞基c′[15]，更高級的真核生物則有額外的蛋白質(zhì)Ac45[16]。V-ATPase A亞基是催化亞基[17]，由4個結(jié)構(gòu)域組成：N端的β桶狀結(jié)構(gòu)域，包含凸起的非同源結(jié)構(gòu)域；中心的α/β結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域[18]。C端結(jié)構(gòu)域包含Walker A motif、Walker B motif。Walker A motif與核酸結(jié)合有關(guān)，而Walker B motif與天冬氨酸介導(dǎo)的Mg2+反應(yīng)有關(guān)[19-20]。

本試驗通過預(yù)測V-ATPase A亞基蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，同源比對確定突變位點，利用over-lap PCR等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建突變工程菌。在前期，對誘導(dǎo)溫度、時間和IPTG濃度進行摸索，期望能得到更多的可溶性蛋白質(zhì)，但結(jié)果目的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)以包涵體形式存在?？赡苁且驗樵吮磉_系統(tǒng)缺乏引導(dǎo)多肽正確折疊的分子伴侶或者調(diào)解機制，使得蛋白質(zhì)無法正確折疊，失去原有特性和功能，最終以包涵體形式存在。本試驗最終決定通過復(fù)性獲得可溶性目的蛋白，考慮到純化方法和復(fù)性步驟，選用pET-22b(+)構(gòu)建表達載體，采取一步透析法，在透析液pH 8.0，添加終濃度為1 mol/L的L-精氨酸，獲得高收率的可溶性蛋白質(zhì)。本試驗1 L菌體最終可得到67 mg左右較純的可溶性蛋白質(zhì)，復(fù)性效率為53%，為后續(xù)研究V-ATP酶活性，A亞基的功能和結(jié)構(gòu)，利用突變體TSCA篩選ATP酶抑制劑提供條件。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Prokaryotic Expression, Refolding and Purification of V-ATPase Subunit A Mutant TSCA in the Midgut ofMythimnaseparate

HOU Wensi1, LI Yujie1, WANG Yuanyuan2and TAO Hu1

(1.College of Science, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China;2.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100,China)

Based on V-ATPase A subunit gene(VATPA) in the midgut ofMythimnaseparate, three-dimensional structure was predicted, site-directed mutant was built and recombinant protein was obtained after renaturing.The protein structure of VHA-A was analyzed, three-dimensional structure was predicted by Swiss-Model online,and the mutation site was designed.The mutant gene was constructed with overlap PCR, and inserted into pET-22b(+) vector. The recombinant plasmid pET-22b(+)-TSCA was transformed intoE.coliBL21(DE3) for expression. After purified by Ni-NTA column, the inclusion body was renatured. The results showed the recombinant plasmid was successfully built, the fusion proteins were expressed as inclusion bodies, and the soluble proteins were successfully obtained in large scale.The study will facilitate the investigation of structure and function of V-ATPase subunit A and creation of environmental friendly pesticides.

V-ATPase subunit A; Designated mutation; Protein prokaryotic expression; Refolding of inclusion body

2016-05-29 Returned 2016-06-15

Special Talent Recruitment Fund of Northwest A&F University(No.Z111021101); the National Natural Science Foundation of China(No.21403168 )

HOU Wensi, female, master student. Research area:protein expression and purification. E-mail:956850986@qq.com

TAO Hu, male, professor, master supervisor.Research area:protein-protein interaction and structural resolution. E-mail:taohu@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-08-18

2016-05-29

2016-06-15

西北農(nóng)林科技大學(xué)引進人才專項資金(Z111021101 )；國家自然科學(xué)基金(21403168)。 第一作者：侯文思，女，碩士研究生，從事蛋白質(zhì)表達和純化研究。E-mail:956850986@qq.com

陶 虎，男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)研究。E-mail：taohu@nwsuaf.edu.cn

Q786

A

1004-1389(2017)08-1248-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170818.0939.040.html