張 淼，賀海燕，李 晶，王 平，王 婧，吳 濤，金哲宇，2，樸文花，3

·論 著·

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中BCL-2等蛋白表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性研究

張 淼1，賀海燕1，李 晶1，王 平1，王 婧1，吳 濤1，金哲宇1，2，樸文花1，3

目的探討彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表達(dá)特點(diǎn)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)法技術(shù)及熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，對(duì)59例確診為DLBCL樣本進(jìn)行檢測，了解其表達(dá)情況，同時(shí)探討與臨床預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)生BCL-2基因易位2例，BCL-6基因重排15例；BCL-2蛋白表達(dá)40例(67.8%)，BCL-6蛋白表達(dá)36例(61%)，C-myc蛋白表達(dá)44例(74.6%)，F(xiàn)OXP1蛋白表達(dá)26例(44.1%)，CD44V6蛋白表達(dá)21例(35.6%)。單因素、多因素相關(guān)分析顯示，BCL-6基因易位，BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表達(dá)均對(duì)患者的總生存期(OS)有顯著影響，是OS獨(dú)立的預(yù)測因素。結(jié)論BCL-2蛋白及基因表達(dá)提示預(yù)后不良；BCL-2、C-myc蛋白共同表達(dá)者，預(yù)后更差。BCL-6蛋白及基因表達(dá)提示預(yù)后良好。聯(lián)合應(yīng)用生物標(biāo)記物能在一定程度上反映DLBCL腫瘤的異質(zhì)性及預(yù)后。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；蛋白標(biāo)記物；免疫組織化學(xué)方法；臨床預(yù)后

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一型，腫瘤具有高度的異質(zhì)性，在蛋白表達(dá)、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、治療反應(yīng)及預(yù)后均存在差異[1]。捕捉反映腫瘤異質(zhì)性的預(yù)測因子，能夠更好的幫助臨床調(diào)整治療策略和評(píng)估預(yù)后[2]。本研究選取了5種可能與DLBCL預(yù)后相關(guān)的蛋白標(biāo)記物，通過隨訪分析，了解其表達(dá)特征及與臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源:所有DLBCL標(biāo)本均來自于寧夏人民醫(yī)院，收集2010年1月-2015年10月初次診斷的、臨床實(shí)驗(yàn)室資料完整的DLBCL病例。按照WHO2016版進(jìn)行組織學(xué)分型，所有患者術(shù)前均未接受過治療。

1.2 臨床資料:本組DLBCL患者共59例，其中GCB組20例，non-GCB組39例；男性34例，女性25例；中位年齡54歲(26～81)，≥60歲26例；結(jié)內(nèi)34例(57.6%)，結(jié)外25例(42.3%)。同時(shí)收集59例患者的常規(guī)臨床資料及臨床分期(AnnArbor分期，胃腸道為Lugano分期)、有無B癥狀、血清乳酸脫氫酶(LDH)有無升高、結(jié)外病種累及數(shù)量等，進(jìn)行IPI評(píng)分、ECOG評(píng)分。給予患者蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，選擇CHOP或CHOP樣方案，部分患者聯(lián)合放射治療或給予利妥昔單抗注射治療。

1.3 免疫組化法染色:所用一抗抗體(BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6)及SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司，標(biāo)本均使用Dako全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，采用兩步法，進(jìn)行陰性陽性及空白切片對(duì)照，DAB顯色。

1.4 免疫組化的結(jié)果判讀:采用定性判斷，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)定位清晰的棕褐或棕黃色著色，且>30%腫瘤細(xì)胞著色判讀為陽性。

1.5 熒光原位雜交(FISH)檢測:BCL-6雙色斷裂分離探針和BCL-2/IGH雙色融合易位探針均購自北京金菩嘉醫(yī)療科技公司，操作及判讀方法參見說明。染色結(jié)果見圖1-圖6(目錄后)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，各因素對(duì)預(yù)后生存時(shí)間的影響采用Kaplan-meier檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)：59例患者中出現(xiàn)癥狀32例，血清LDH升高(>220 U/L)29例，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期29例，IPI評(píng)分≥3分29例，ECOG評(píng)分≥2分25例，結(jié)外受累病灶≥1灶25例；59例患者均接受以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。本組隨訪時(shí)間(22.7±11.9)個(gè)月，中位總生存期33.367 6個(gè)月；隨訪期間死亡30例，總死亡率50.8%，3年死亡率56.91%，5年生存率69.78%。

2.2 蛋白表達(dá)情況：依據(jù)Hans分型將患者分為GCB組和Non-GCB組，GCB組隨訪期間死亡率為64.12%，Non-GCB組隨訪期間死亡率為25.00%，GCB組死亡率高于Non-GCB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.088，P<0.05)，見表1。

表1 2組患者死亡情況的比較

2.3 BCL-2、BCL-6蛋白及基因表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性:見表2。BCL-2蛋白表達(dá)與患者死亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.882，P<0.05),BCL-2蛋白表達(dá)提示預(yù)后不良。BCL-2基因表達(dá)與患者預(yù)后無相關(guān)性(P>0.05)，BCL-2蛋白表達(dá)與基因表達(dá)間無相關(guān)性。BCL-6蛋白表達(dá)與患者死亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),BCL-6基因表達(dá)與患者預(yù)后存在相關(guān)性(P<0.05)；BCL-6蛋白及基因表達(dá)提示預(yù)后較好，BCL-6蛋白與基因表達(dá)間存在相關(guān)性。

表2 BCL-2、BCL-6蛋白及基因表達(dá)死亡情況的比較

2.4 C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性:見表3。單因素相關(guān)分析顯示，C-myc蛋白表達(dá)與患者死亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),C-myc蛋白表達(dá)提示預(yù)后不良。FOXP1表達(dá)與患者死亡率有相關(guān)性(P<0.05)，F(xiàn)OXP1蛋白表達(dá)患者死亡率較高。CD44V6蛋白表達(dá)與患者死亡率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD44V6蛋白表達(dá)提示患者預(yù)后不好，死亡率高。同時(shí)IPI評(píng)分較高與死亡率有高度相關(guān)性(P<0.05)。

表3 BCL-2、BCL-6、C-myc蛋白表達(dá)與預(yù)后的比較

2.5 BCL-2、BCL-6、C-myc、FOXP1、CD44V6蛋白對(duì)生存時(shí)間的影響:將上述單因素參數(shù)進(jìn)一步納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，進(jìn)行預(yù)后多因素分析。按照免疫組化染色結(jié)果分為陽性組和陰性組，2組間BCL-2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,χ2=18.603,RR=7.309)；2組間BCL-6比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,χ2=17.597,RR=0.233)；2組間C-myc蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,χ2=16.561,RR=43.567)；2組間FOXP1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,χ2=39.115,RR=10.815)；2組間CD44V6蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，χ2=13.912,RR=3.728)。結(jié)果顯示，BCL-2、C-myc蛋白、FOXP1蛋白、CD44V6蛋白陽性組生存情況均明顯不如陰性組，而BCL-6陽性組患者預(yù)后較好。

3 討論

彌漫大DLBCL至今未明確免疫標(biāo)記物和分子模型，如果能找到更加準(zhǔn)確的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)記物，勢(shì)必會(huì)提高DLBCL患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[3]。

BCL-2基因位于18q21，是抑制細(xì)胞凋亡的基因，BCL-2過表達(dá)為惡性腫瘤患者生存提供了優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能在化療耐藥中起到關(guān)鍵作用[4]。BCL-2基因融合導(dǎo)致了BCL-2蛋白過表達(dá)，擾亂了細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，與淋巴瘤的發(fā)生演變密切相關(guān)[5-6]。C-myc基因是位于8q24的原癌基因，C-myc基因異常表達(dá)是癌變過程中較早出現(xiàn)的分子改變。在DLBCL中，15%的患者中出現(xiàn)C-myc基因的擴(kuò)增，這些患者預(yù)后較差[7]。本組患者中，BCL-2、C-myc蛋白表達(dá)提示為預(yù)后不良的因素，BCL-2、C-myc蛋白共同表達(dá)者預(yù)后更差。本組患者中BCL-6蛋白陽性及基因重排預(yù)后較好，基因重排與蛋白表達(dá)存在相關(guān)性，研究結(jié)果與報(bào)道一致[8]。

FOXP1蛋白屬于FOXP家族，在不同分化階段的B細(xì)胞中均有表達(dá)，但不表達(dá)漿細(xì)胞，是B細(xì)胞發(fā)育過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[9]。本組病例中，F(xiàn)OXP1蛋白高表達(dá)的患者死亡率較高，預(yù)后不良，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。FOXP1表達(dá)失調(diào)可能在DLBCL中起著重要作用，F(xiàn)OXP1高表達(dá)是DLBCL預(yù)后不良的指標(biāo)。本組患者中，F(xiàn)OXP1陰性表達(dá)預(yù)后明顯好于陽性表達(dá)者，陽性表達(dá)率為44.1%，略高于國外文獻(xiàn)報(bào)道的18%～40%[10]。多因素回歸分析顯示，F(xiàn)OXP1高表達(dá)是DLBCL的獨(dú)立預(yù)后因素。

CD44V6基因定位于人類11號(hào)染色體短臂上，它是CD44分子中包含外顯子6的拼接異構(gòu)體。在免疫體統(tǒng)中，CD44被稱為“歸巢受體”，外周血淋巴細(xì)胞利用CD44粘附到毛細(xì)血管壁，達(dá)到回歸淋巴組織的目的。CD44V6參與淋巴細(xì)胞活化增殖，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[11]。本組患者中，CD44V6在non-GCB組表達(dá)高于GCB組，單因素、多因素分析，提示CD44V6表達(dá)是預(yù)后不良的因素。有報(bào)道顯示，DLBCL患者外周血中淋巴與單核細(xì)胞比例降低(<2.6)，是R-CHOP治療后預(yù)后不良的表現(xiàn)。CD44V6作為“歸巢受體”，可以降低non-GCB組外周淋巴細(xì)胞增高，從而影響患者預(yù)后[12]，在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。

本研究通過臨床隨訪，統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素、多因素分析顯示，BCL-2基因重排提示預(yù)后不良，BCL-6基因重排提示預(yù)后良好。BCL-2蛋白、C-myc蛋白、FOXP1蛋白、CD44V6蛋白表達(dá)均是患者OS的獨(dú)立預(yù)測因子，是反映患者預(yù)后不良的指標(biāo)。以上研究為DLBCL的預(yù)后提供了一些有價(jià)值的蛋白標(biāo)記物，希望這些標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用能為臨床判斷DLBCL患者的預(yù)后提供幫助。

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ExpressioncharacteristicsofBCL-2,BCL-6,C-myc,FOXP1andCD44v6indiffuselargeBcelllymphomaanditsrelationshipwithclinicalprognosis

ZHANGMiao1,HEHaiyan1,LIJing1,WANGPing1,WANGJing1,WUTao1,JINZheyu1,2,PIAOWenhua1,3

1.DepartmentofAnatomyPathology,NingxiaPeople'sHospital,Yinchuan750002,China；2.MedicalCollegeofSoochowUniversity,Suzhou215123,China；3.DepartmentofClinicalPathology,FirstAffiliateHospitalofMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China

Correspondingauthor:PIAOWenhua,Email:wenhuapiao@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of BCL-2,BCL-6,C-myc,FOXP1,CD44V6 in diffuse large B cell lymphoma and research the relationship of these protein’s expression with clinical prognosis.MethodsDLBCL samples were detected by immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.ResultsBCL-2 gene translocation occurred in 2 cases; BCL-6 gene rearrangement in 15 cases.BCL-2 protein expression in 40 cases (67.8%),BCL-6 protein expression in 36 cases (61%),C-myc protein expression in 44 cases (74.6%),FOXP1 protein expression in 26 cases (44.1%),CD44v6 protein expression in 21 cases (35.6%).Univariate correlation analysis showed that BCL-2 gene translocation,BCL-6,C-myc,FOXP1,CD44V6 protein expression were closely correlated with the overall survival of patients (survival overall,OS),they were independent predictors of OS.ConclusionBCL-2 protein and gene expression suggest poor prognosis; BCL-2,C-myc protein co-expression,prognosis is even worse.The expression of C-myc,FOXP1 and CD44v6 are all suggested that the prognosis of the patients are poor.

DiffuselargeBcelllymphoma;Proteinmarker;IHC;Clinicalprognosis

寧夏科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012ZYS208)；寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ16184)

1.寧夏人民醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750002 2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123 3.西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750002

張淼(1976-)，女，山東籍，副主任醫(yī)師，碩士研究生，從事臨床病理診斷工作。

樸文花，Email:wenhuapiao@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170814.1453.006.html

10.13621/j.1001-5949.2017.08.0673

R735

A

2017-02-14 [責(zé)任編輯]王凱榮