陳中偉，孫 俊，王力坤，吳其飛，徐 斌※

適宜無機鹽及濃度抑制麥胚脂肪酶存在時油水界面張力

陳中偉1,2，孫 俊1，王力坤1，吳其飛2，徐 斌1※

（1. 江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學農產品加工工程研究院，鎮(zhèn)江 212013）

為了探明無機鹽穩(wěn)定化脂肪酶的潛在機理，該文以小麥胚芽脂肪酶為研究對象，基于界面酶學的分析方法，研究添加濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+的氯化物對小麥胚芽脂肪酶存在的油-水界面特性的影響。結果表明，當小麥胚芽脂肪酶體系濃度為1.7×10-6mol/L時，一價金屬中Na+更有利于抑制油-水界面的表面張力（P＜0.05），對麥胚脂肪酶存在時的油水界面特性影響也較大；二價金屬離子Ca2+對界面張力的影響趨勢與一價離子不同，在高濃度時反而增加界面張力；當油水界面上存在脂肪酶的催化底物（三油酸甘油酯）和產物（油酸）時，添加濃度分別為10-6、10-6、10-4和10-9mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+均可一定程度上降低油水界面張力，從而降低麥胚脂肪酶的作用效果，三油酸甘油酯存在時Mg2+的作用效果最明顯（P＜0.05），油酸存在時Na+的作用效果最明顯（P＜0.05）。綜上，無機鹽金屬離子主要通過影響麥胚脂肪酶在油水界面的聚集行為及底物結構狀態(tài)起到鈍化麥胚脂肪酶的作用，該結果可為麥胚脂肪酶存在時界面的活性調控及麥胚的穩(wěn)定化處理提供參考。

氯化物；脂肪酶；界面能；無機鹽；小麥胚芽

陳中偉，孫 俊，王力坤，吳其飛，徐 斌. 適宜無機鹽及濃度抑制麥胚脂肪酶存在時油水界面張力[J]. 農業(yè)工程學報，2017，33(15)：308－314. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.15.039 http://www.tcsae.org

Chen Zhongwei, Sun Jun, Wang Likun, Wu Qifei, Xu Bin. Suitable inorganic salt and its content inhibiting tension of oil-water interface with wheat germ lipase[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(15): 308－314. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.15.039 http://www.tcsae.org

0 引 言

小麥胚芽是小麥加工的主要副產物之一，約占整個小麥籽粒的2.5%～3.0%[1]。小麥胚芽營養(yǎng)豐富，被譽為“人類營養(yǎng)的天然寶庫”[2-3]。全球每年5.5億t小麥產量中，大約可產出100萬t功能性油脂和300萬t蛋白質，但目前有效利用率卻不足10%[4]，主要是因為小麥胚芽中含有豐富的脂肪酶，在其作用下脂肪極易水解，導致小麥胚芽的酸敗變質[5-6]，為此，小麥胚芽穩(wěn)定化是當前備受關注的課題[7]。

小麥胚芽脂肪酶（LA，lipase A）是一種兩親性且具有界面活性的蛋白分子，只能作用于油水界面[8]，該界面不僅是LA催化反應的關鍵場所，也是調控LA催化活性的合適位點[9]。多年來，學界關于油水界面的理解一直局限于所謂“界面性質”的模糊認識，并推測脂肪酶與底物之間的相互作用可能包括靜電吸引，底物的取向性和水合作用等。直到最近，Reis應用生物物理學理論，才首次揭開了界面微環(huán)境與脂肪酶催化活性的內在關聯(lián)[10]。事實上，脂類酶促水解是典型的多相催化反應，其反應速率和方向取決于界面微環(huán)境的所有組成成分[9]。界面組成所呈現(xiàn)出的特征及其與酶催化效率的關聯(lián)性，不僅為今后研究脂肪酶界面催化反應提供了新方法，也為研究麥胚脂肪酶的鈍化方法開辟了新的途徑。

研究表明，全麥粉中添加一定量Na+，可抑制76.7%脂肪酶活力[11]；Na+對膜結合脂肪酶活力抑制率達55%[12]，由此可見，加入金屬離子抑制劑可作為鈍化LA的輔助手段[13]。此外，LA本身并不能決定酶促反應的平衡常數(shù)，其催化水解效率依賴于LA的界面活性以及底物、產物以及抑制劑在界面的擴散速率與動態(tài)分布[14]。Torcello-Gómez等[15]研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子可與離子化脂肪酸特異性形成某種復合物，改變脂肪酸溶解性和油水界面的某些性質，進而影響脂肪酶催化活性。因此，在無機鹽作用下，LA所處微環(huán)境發(fā)生改變，勢必影響界面層（水相）對LA的吸附[16]和底物在界面層（油相）的定位[15]。此外，各種界面活性分子也會在界面層產生競爭[15]，如甘油三酯水解產生具有界面活性的二酰甘油、單酰甘油等會占據(jù)界面層與LA分子發(fā)生競爭，或者通過分子間相互作用使LA構象發(fā)生變化。上述兩種作用機制都可能對LA的催化效果產生影響[17-18]。因此，對油水界面特性的深入研究與充分認識，將有助于發(fā)現(xiàn)新的LA活力調控方式。

目前，有關金屬離子對LA影響作用的研究中，一般涉及無機鹽對LA活性、結構等影響方面的研究[19-20]，而金屬離子是否會對麥胚LA存在時油水界面特性產生影響，進而影響LA的催化活性尚停留在推斷階段?；谏鲜霈F(xiàn)狀，本研究基于界面酶學分析方法，研究不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對麥胚LA、麥胚LA+三油酸甘油酯和麥胚LA+油酸3種不同油水界面模型的影響，以期從界面特性角度分析Na+、K+、Ca2+、Mg2+4種金屬離子對麥胚LA催化功能的影響機制，為小麥胚芽穩(wěn)定化方法的建立提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥胚LA（產品編號L3001）、單油酸甘油酯，購自美國Sigma有限公司；癸烷，純度99%，購自英國Alfa Aesar A Johnson Matthey公司；油酸、三油酸甘油酯、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2均為分析純，購自上海國藥化學試劑有限公司。

DCAT11界面張力儀，德國Dataphysics公司；AR-G2旋轉流變儀，美國TA Instruments公司；ED-F12標準型加熱水浴槽循環(huán)器，德國Julabo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 界面張力測定

采用吊片法測定麥胚LA油水界面的張力[21]。界面張力結果為3次測量的平均值，試驗溫度為25.0±0.1 ℃。計算公式如下：

F=mg+2γ(L+d)cosθ （1）

式中F為鉑片所受拉力，N，m為鉑片質量，kg；g為重力加速度，m/s2；L為鉑片長度，m；d為鉑片厚度，m；γ為表面張力，N/m；θ為接觸角，(°)。由于d＜＜L，所以F=mg+2γLcosθ。

1.2.2 界面流變性質的測定

利用配有Du Nouy環(huán)系統(tǒng)的AR-G2旋轉流變儀進行測定，具體操作如下：1）將20 mL磷酸鹽緩沖溶液加入樣品杯；2）把盤放置在珀爾貼平板上的定位環(huán)內；3）降下機頭直至環(huán)定位與液體上表面的平面；4）將約5 mL癸烷均勻地加入到水樣表面，至完全浸沒Du Nouy環(huán)；5）在振蕩模式下，選擇“Strain sweep step”，測試頻率為1Hz時，油水界面的流變性質，選擇G'（儲能模量）和G''（損耗模量）呈線性變化區(qū)間內的應變（strain）值，進行后續(xù)測定。選擇“Frequency sweep step”，測試25 ℃、特定Strain下、頻率0.1～3 Hz區(qū)間內16個點的界面流變性質；6）程序設定完成后，測定界面剪切彈性模量和界面剪切黏度等。

1.2.3 不同濃度麥胚LA存在的界面模型構建

以癸烷為油相、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值=7.0）為水相，建立油水界面模型，同時分別添加1.70×10-8～1.70×10-6mol/L的麥胚LA到水相，研究不同濃度的麥胚LA對油水界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.4 不同種類與濃度的無機鹽對麥胚LA界面特性的影響

以NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無機鹽的形式向油水界面模型水相中分別添加4種金屬離子，研究濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L間的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.5 不同濃度三油酸甘油酯對界面組成與結構的影響

根據(jù)1.2.3的試驗結果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設定油水界面模型油相中三油酸甘油酯的濃度分別為1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3和1×10-2mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度三油酸甘油酯對油水界面組成與結構的影響。

1.2.6 不同濃度水解產物（油酸）對界面組成與結構的影響

根據(jù)1.2.3的試驗結果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設定油水界面模型油相中油酸的濃度為5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2和5×10-1mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度水解產物對油水界面組成與結構的影響。

1.2.7 底物或產物存在時，無機鹽對麥胚LA界面特性的影響

參考1.2.3的試驗結果，在每種無機鹽的不同研究濃度范圍內，選取對麥胚LA界面張力和界面流變性質影響較大的某一濃度，同時按照1.2.5、1.2.6的試驗結果，選取對界面特性影響最大時的三油酸甘油酯和油酸的濃度，研究有底物或產物存在時，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無機鹽對麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.3 統(tǒng)計方法

試驗結果為3次重復測定結果的平均值。采用Minitab進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)間差異性以95%置信區(qū)間（P＜0.05）來說明。

2 結果與分析

2.1 不同濃度麥胚LA對油水界面組成與結構的影響

麥胚LA濃度對油水界面特性的影響見圖1。如圖1a所示，隨著麥胚LA濃度的增加，油水界面張力下降趨勢明顯[22]，當麥胚LA濃度超過1.70×10-6mol/L時，油水界面處分子分布不穩(wěn)定，無法測得穩(wěn)定數(shù)據(jù)。

圖1b是不同濃度麥胚LA對油水界面損耗因子（tanδ）即損耗角正切值的影響。tanδ越大，耗散能量的能力越強；由圖可見，tanδ隨麥胚LA濃度的增加而增加，當麥胚LA濃度為1.70×10-6mol/L，tanδ值達到最大。該變化趨勢與界面張力變化趨勢有一定的相似性，原因可能是，麥胚LA濃度具有兩性特性，易富集在油水界面上。隨著其濃度的增加，導致界面黏度增加，進而影響了因界面形變而耗散的能量[8]。綜上，為了能夠觀察到明顯而準確的試驗結果，在后續(xù)研究中選取麥胚LA的濃度為1.70×10-6mol/L。

2.2 一價金屬離子對油水界面組成與結構的影響

已有研究結果表明，電解質的加入能使溶液內部粒子之間的相互作用強于純水[23]。因此，在一定濃度范圍內，電解質的加入會使油/水溶液界面張力增大。本研究就Na+、K+離子對油水界面組成與結構的影響進行了驗證研究。如圖2所示，Na+、K+對界面張力的影響相似，對麥胚LA界面張力的影響隨其濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[24-25]，但高濃度時K+對油水界面張力的影響不及Na+顯著（P＜0.05）。當離子濃度在1.0×10-9～1.0×10-6mol/L時，Na+、K+均可明顯提高界面張力。當K+濃度高于1.0×10-5mol/L，麥胚LA的油水界面張力開始明顯降低。原因可能是高濃度無機鹽離子將影響麥胚LA在溶液界面上的聚集數(shù)量和穩(wěn)定性。由于麥胚LA具有類似于分子表面活性劑的性質，可以緊密吸附界面上，從而降低界面張力[26]。

圖1 麥胚LA濃度對油水界面特性的影響Fig.1 Effect of wheat germ lipase concentration on oil/water interfacial properties

圖2 NaCl及KCl對麥胚LA濃度為1.7×10-6mol/L的油水界面張力的影響Fig.2 Effect of NaCl and KCl on tension of oil/water interface with LA concentration of 1.7×10-6mol/L

此外，Na+、K+對麥胚LA界面流變性質的影響的結果（見圖3）表明：在所研究的無機鹽濃度范圍內，Na+、K+對界面流變參數(shù)的影響規(guī)律較差，不穩(wěn)定，原因在于NaCl和KCl作為中性無機鹽可通過“鹽溶”和“鹽析”作用對溶液中的表面活性劑的界面溶解度產生影響[21]。同時，Na+、K+表現(xiàn)出的界面惰性物質會阻止表面活性物質等在水中的溶解性，并且Na+、K+與水溶性酸離子結合后生成的酸式鹽可占據(jù)界面，降低有效界面的面積[27]。

圖3 NaCl、KCl濃度對油水界面流變特性的影響Fig.3 Effect of NaCl and KCl concentration on oil/water interfacial rheological properties

2.3 二價金屬離子對油水界面組成與結構的影響

二價金屬子Ca2+、Mg2+對油水界面張力的影響見圖4。由圖可知，低濃度時，Ca2+對油水界面張力的影響較??；當Ca2+濃度達到1.00×10-4mol/L時，界面張力驟然增至18.3 mN/m；而Mg2+對界面張力的影響與Ca2+有相反的趨勢，呈現(xiàn)低濃度促進，高濃度抑制的現(xiàn)象，該結果與于立軍等的研究結果一致[28]。原因在于在所試驗溫度的油水界面上，Ca2+和Mg2+形成不溶物的濃度明顯不同，對油水界面張力產生影響的濃度范圍也不同。

圖4 CaCl2及MgCl2濃度對油水界面張力的影響Fig.4 Effect of CaCl2and MgCl2concentration on oil/waterinterface tension

Ca2+、Mg2+對界面流變參數(shù)的影響見圖5。由圖5可知，Ca2+、Mg2+對界面流變參數(shù)的影響規(guī)律性較差，可能是由于同為二價陽離子的Ca2+、Mg2+易與磷酸鹽緩沖溶液中磷酸根結合形成微溶于水的沉淀，造成界面流變參數(shù)變化不穩(wěn)定[29]。

與一價金屬離子相比，較高濃度的二價金屬離子反而會一定程度上增加油水界面的張力，這可能與二價金屬離子在油水界面上的溶解特性有直接關系。本文中選取的二價金屬離子為Ca2+、Mg2+，在水溶液中容易與體系中的磷酸根離子結合，進而破壞原有油水界面的離子狀態(tài)。使得界面的黏度不降反升。該問題會在后續(xù)的研究中進一步驗證。

圖5 CaCl2及MgCl2濃度對油水界面流變特性的影響Fig.5 Effect of CaCl2and MgCl2concentration on oil/water interfacial rheological properties

2.4 不同濃度三油酸甘油酯底物對油水界面組成與結構的影響

三油酸甘油酯濃度對油水界面特性的影響見圖6。由圖6可見，當麥胚LA濃度為1.70×10-6mol/L時，油水界面張力隨癸烷中三油酸甘油酯濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的變化規(guī)律；當三油酸甘油酯濃度介于10-5～10-3mol/L時，相同角頻率時界面損耗因子隨著濃度增加無明顯變化規(guī)律。此外，在試驗過程中，界面張力隨時間延長呈現(xiàn)一定下降趨勢，這說明麥胚LA與三油酸甘油酯的水解過程也會對界面張力產生一定影響。原因在于，在界面體系中，三油酸甘油酯可被麥胚LA水解，產生小分子的油酸等，三油酸甘油酯與麥胚LA組成的界面發(fā)生變化，進而影響界面特性。

2.5 水解產物對油水界面組成與結構的影響

油酸濃度對油水界面特性的影響見圖7，由圖可知：隨著油酸濃度的增加，界面張力呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢，界面流變學參數(shù)的變化規(guī)律與其對界面張力的作用規(guī)律相似。油酸作為麥胚LA的小分子水解產物，更容易分布于油水界面處[30]，與麥胚LA競爭有限的界面面積，顯然油酸與麥胚LA對界面特性的影響不同。當油酸濃度處于5.0×10-6～5.0×10-5mol/L之間時，界面張力與tanδ均處于最大值范圍，即該濃度范圍內界面處油酸與麥胚LA的競爭關系最明顯，可以理解為該濃度范圍油酸的加入，對麥胚LA的抑制效果最好。

圖6 三油酸甘油酯濃度對油水界面特性的影響Fig.6 Effect of glycerol trioleate concentration on oil/water interfacial properties

圖7 油酸濃度對油水界面特性的影響Fig.7 Effect of oleic acid concentration on oil/water interfacial properties

2.6 底物或產物存在時無機鹽對麥胚LA界面特性的影響

如圖8a所示，當癸烷中分別添加1×10-5mol/L三油酸甘油酯（底物）或5×10-6mol/L油酸（產物）時，CaCl2濃度為1.0×10-4mol/L時，油酸存在時界面張力從17.6 mN/m增大至18.2 mN/m（P＜0.05）。此外，不同種類及濃度無機鹽的加入均降低了三油酸甘油酯或油酸存在時的油水界面張力（P＜0.05）。其中，三油酸甘油酯存在時，Mg2+的作用效果最明顯；油酸存在時，Na+的作用效果最明顯，界面張力從17.8 mN/m降低至16.2 mN/m，差異顯著（P＜0.05)。

圖8 底物（三油酸甘油酯1×10-5mol·L-1）和產物（油酸5×10-6mol·L-1）存在條件下無機鹽對界面特性的影響Fig.8 Effect of inorganic salts on interfacial properties with the exist of substrate (1×10-5mol·L-1glycerol trioleate) or product (5×10-6mol·L-1oleic acid)

從圖8b和圖8c可以看出，三油酸甘油酯或油酸存在時，無機鹽對tanδ的影響規(guī)律性較差，出現(xiàn)上述情況的原因可能是因為無機鹽離子降低了麥胚LA在油水界面的溶解度，從而為三油酸甘油酯或油酸保留了更多的界面面積，有利于更多的三油酸甘油酯或油酸占據(jù)有效界面，以至于降低了底物或產物存在時的油水界面張力[16]。

3 結 論

1）當無機鹽濃度在10-6～10-9mol/L范圍內時，界面張力變化具有明顯規(guī)律，而界面流變參數(shù)變化規(guī)律性較差。界面處僅有小麥胚芽脂肪酶存在時，一價金屬中Na+更有利于抑制油-水界面的表面張力，對麥胚脂肪酶存在時的油水界面特性影響也較大；二價金屬離子Ca2+對界面張力的影響趨勢與一價離子不同，在高濃度時反而增加界面張力，可能是受到試驗體系中磷酸根離子的影響；

2）在麥胚脂肪酶的作用底物，即三油酸甘油酯（10-5mol/L）存在時，添加濃度分別為10-6、10-6、10-4和10-9mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+均可一定程度上降低油水界面張力的加入降低了三油酸甘油酯存在時的油水界面張力，其中，Mg2+的作用效果最明顯（P＜0.05）。當麥胚脂肪酶的作用產物油酸（5×10-4mol/L）存在時，添加NaCl和KCl可降低油水界面張力。添加CaCl2和MgCl2可升高油水界面張力，其中Na+的作用效果最顯著（P＜0.05）。

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Suitable inorganic salt and its content inhibiting tension of oil-water interface with wheat germ lipase

Chen Zhongwei1,2, Sun Jun1, Wang Likun1, Wu Qifei2, Xu Bin1※
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. College of Food Process Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

The stabilization of lipase is an important means to control the rancidity of highly oil-containing agricultural products, such as wheat germ. In this paper, the effects of different concentrations of Na+, K+, Ca2+and Mg2+on the oil-water interface characteristics of wheat germ lipase A (LA) were examined, based on the interfacial enzymatic analysis methods using interfacial tension meter and rotary rheometer. Firstly, the influence of the different concentrations of wheat germ LA on the interfacial tension of oil-water was studied to determine the concentration of LA system for the subsequent investigation about the effects of inorganic salts on the oil-water interface. Then, the interface tension and rheological properties of the oil-water after adding monovalent and divalent metal salt were studied to explore the effects of species and concentration on the oil-water interface. Next, the effects of different kinds of inorganic salts on the surface tension and rheological properties of oil-water interface, where there were lipase-acting substrate and product, namely, glycerol trioleate and oleic acid, were studied. Finally, the potential mechanism of inhibiting the catalytic activity of metal ions of inorganic salt in inhibiting wheat germ LA activity was discussed. The results showed that, when the concentration of LA was 1.70×10-6mol/L, the monovalent metal ions Na+and K+were more favorable to decrease the interfacial activity of oil-water and the interfacial activity of wheat germ LA, than other divalent metal ions, i.e. Mg2+and Ca2+. And the effect of Na+was higher than that of K+. In the divalent metal ions, Ca2+could decrease the interfacial tension at a low concentration and increase interfacial tension at a high concentration, while Mg2+was opposite to Ca2+. At the same time, the decrease effect of Ca2+on the interfacial tension was more obvious than Mg2+. Besides, the effects of glycerol trioleate and oleic acid on the interfacial properties of wheat germ LA were studied; the effect extent was glycerol trioleate ＞ oleic acid, and the concentration of these 2 compounds was 1.0×10-5and 5.0×10-6mol/L, respectively. Under the 2 concentrations of glycerol trioleate and oleic acid, adding Na+(10-6mol/L), K+(10-6mol/L), Ca2+(10-4mol/L), and Mg2+(10-9mol/L)to the oil-water system, could reduce the interfacial tension of oil and water, and then reduce the effect of wheat germ lipase. In summary, inorganic salts play an important role in the inhibition of interfacial activity of wheat germ LA mainly by reducing the catalytic effect through affecting the aggregation behavior of wheat germ LA in oil-water interface and the structure of substrate, and play a role of passivating wheat germ LA. The results of this paper can provide theoretical support for the regulation of lipase activity and wheat germ stabilization in wheat germ industry.

chloride minerals; lipase; interfacial energy; inorganic salt; wheat germ

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.15.039

TS21

A

1002-6819(2017)-15-0308-07

2017-04-14

2017-07-25

國家自然科學基金面上項目（31371877），江蘇大學高級人才引進（15JDG168）

陳中偉，男（漢），河北邯鄲人，助理研究員，博士，主要從事糧油精深加工技術研究。鎮(zhèn)江 江蘇大學食品與生物工程學院，212013。Email：zwchen@ujs.edu.cn.

※通信作者：徐 斌，男（漢），江蘇高郵人，博士，博士生導師，2013年赴美國堪薩斯州立大學研修，主要從事糧食加工過中品質變化規(guī)律與調控策略。鎮(zhèn)江 江蘇大學食品與生物工程學院，212013。Email：xubin@ujs.edu.cn.