高瑋岐++董玉瑛++汪皓琦++鄒學(xué)軍

摘要：以明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）為受試生物，研究3種水體常見的喹諾酮類抗生素（QNs）對其的單一毒性和聯(lián)合毒性作用，并基于毒性單位法、相加指數(shù)法和混合毒性指數(shù)法等聯(lián)合作用評價方法，對混合體系的聯(lián)合毒性作用類型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同的評價方法對3種QNs的聯(lián)合效應(yīng)評價結(jié)果具有較好的一致性，聯(lián)合毒性作用類型均表現(xiàn)為不同程度的拮抗作用。根據(jù)發(fā)光菌發(fā)光原理和QNs分子結(jié)構(gòu)不同，可對聯(lián)合毒性作用的機(jī)理進(jìn)行初步探討。多種QNs混合體系的聯(lián)合毒性作用呈現(xiàn)出以拮抗效應(yīng)為主，揭示了此類醫(yī)藥品在環(huán)境中聯(lián)合使用時可導(dǎo)致藥效的降低或引發(fā)微生物耐藥性的傳播。

關(guān)鍵詞：單一毒性；聯(lián)合毒性；明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）；喹諾酮類抗生素；評價

中圖分類號：X503.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3074-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.018

The Toxicity of the Common Quinolones in Water Body to Photobacterium phosphoreum

GAO Wei-qi， DONG Yu-ying， WANG Hao-qi， ZOU Xue-jun

（College of Environment and Resource，Dalian Nationalities University， Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract： The single toxicity and joint toxicity of three quinolones common detected in the aquatic environment were studied on Photobacterium phosphoreum. The joint toxicity was evaluated by toxicity unit，additive index and mixtures toxicity index. The results of three evaluating methods had good consistency. It suggested that the antagonisms of various extents appeared among the mixture systems. Mechanisms of joint toxicity were preliminary analyzed by luminescence principle of P. phosphoreum and the characteristics of quinolones molecular structure. The facts that mixture systems showed almost antagonism could reveal that joint toxicity in the environment may increase pharmaceutical action or induce the spread of antibiotic resistance.

Key words： single toxicity； joint toxicity； Photobacterium phosphoreum； quinolones； evaluation

喹諾酮類抗生素（QNs）在治療人和動物細(xì)菌性感染方面具有良好的臨床效果，應(yīng)用廣泛，其需求及使用量大，據(jù)統(tǒng)計，2010年氟喹諾酮類藥物占據(jù)全球抗生素15%的市場份額[1]，而抗生素進(jìn)入人或動物體內(nèi)后40%～90%以母體或代謝物的形式隨排泄物進(jìn)入環(huán)境[2]，其環(huán)境殘留對水生生物、植物生長發(fā)育等產(chǎn)生明顯的危害或潛在的負(fù)面影響，當(dāng)前水體已成為環(huán)境中抗生素重要的歸宿地，多種QNs具有較高的檢出水平[3-5]。環(huán)境中抗生素的暴露特征體現(xiàn)在混合、持久和低劑量等方面，因其產(chǎn)生的聯(lián)合毒性對水生生物及水環(huán)境系統(tǒng)會帶來很大風(fēng)險[6]。單一QNs的生物學(xué)效應(yīng)研究顯然不能滿足現(xiàn)實中水體的特點，QNs生態(tài)毒性機(jī)理的研究以及與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應(yīng)值得重視[7，8]。

結(jié)合生物發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、相關(guān)性好、反應(yīng)速度快等優(yōu)點[9]，本試驗以加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星3種喹諾酮類抗生素為研究對象，將明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）作為指示物，測定3種抗生素對發(fā)光菌發(fā)光抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）和不同混合體系的EC50，并采用毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法等聯(lián)合毒性評價方法對聯(lián)合毒性作用類型進(jìn)行評價。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

加替沙星片和鹽酸左氧氟沙星膠囊（江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）、鹽酸洛美沙星片（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司），用3%NaCl溶液配制相應(yīng)的系列濃度梯度，待用。試驗所用試劑均為分析純。

DXY22型生物毒性測試儀（中國科學(xué)院南京土壤研究所）、8522型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）、THZ282氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇儀器廠）、DHP29082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、LDZX240CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、不同量程的精密移液器（Thermo公司）、SJH型潔凈工作臺（沈陽市凈化儀器廠二分廠）、常規(guī)玻璃儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 工作菌液的制備：吸取一定量培養(yǎng)好的搖瓶菌液于3%NaCl溶液中，充分?jǐn)嚢?，稀釋程度以控制空白（? mL的3%NaCl溶液和0.1 mL的工作菌液組成）發(fā)光強(qiáng)度在300～800 lx為宜。明亮發(fā)光桿菌凍干粉購自中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室。有關(guān)發(fā)光菌凍干粉的復(fù)蘇、斜面菌種的培養(yǎng)、搖瓶菌液的培養(yǎng)、工作菌液的制備等操作方法見文獻(xiàn)[10]。endprint

1.2.2 急性毒性EC50的測定 ①預(yù)試驗。選定濃度梯度進(jìn)行試驗，觀察15 min發(fā)光菌的發(fā)光抑制率，確定試驗濃度范圍。②單一毒性EC50的測定。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，將待測化合物配成適當(dāng)?shù)?個濃度梯度，各取不同梯度的溶液2 mL加入具塞磨口比色管（15 cm，H 6 cm）中，以2 mL 3%NaCl溶液作空白對照，取0.2 mL工作菌液于各比色管中，加塞上下振蕩均勻，去塞，暴露15 min，測定發(fā)光強(qiáng)度。每個濃度梯度設(shè)3組平行，保證標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。③聯(lián)合毒性EC50的測定。按等濃度比（mg/L）配制加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星的二元及三元混合體系，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)6個濃度梯度（半數(shù)抑制率附近），測定混合體系對發(fā)光菌的聯(lián)合毒性EC50，試驗步驟與單一毒性EC50測定相同，控制3組平行的試驗標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 鑒于污染物濃度與其對應(yīng)發(fā)光抑制率的關(guān)系在EC50附近呈良好的線性分布，故本試驗采用Excel繪圖軟件，將化合物濃度（x）和相對抑制率（y）進(jìn)行回歸分析，求得線性回歸方程，y（發(fā)光抑制率）=ax（化合物濃度）+b。根據(jù)線性回歸方程求出發(fā)光抑制率為50%時所對應(yīng)的化合物濃度，即為化合物單獨作用時EC50?；衔餄舛群退劳雎手g的相關(guān)系數(shù)R，經(jīng)顯著水平檢驗，置信區(qū)間范圍大于95%；反之，需重新測定。

發(fā)光抑制率=×100%

1.2.4 聯(lián)合毒性評價方法 當(dāng)多種有害因素危害機(jī)體時，可以產(chǎn)生獨立、相加、協(xié)同和拮抗4種作用類型。常用于聯(lián)合毒性評價的方法有毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法等[11]。各類評價指數(shù)的評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一毒性作用分析

3種QNs（加替沙星、左氧氟沙星和洛美沙星）對發(fā)光細(xì)菌的急性毒性測試曲線見圖1。曲線表征的是典型的毒性濃度—效應(yīng)關(guān)系，其效應(yīng)關(guān)系較為清晰，從圖1可以看出，3種醫(yī)藥品對發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制曲線均呈單調(diào)非線性遞增趨勢。

3種化合物加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星對發(fā)光菌有不同程度的抑制作用，EC50分別為8.4×10-5、13.7×10-5和12.9×10-5 mol/L。根據(jù)其EC50的大小，判斷抑制作用強(qiáng)弱為加替沙星>左氧氟沙星>洛美沙星，即加替沙星的生物毒性最大，環(huán)境風(fēng)險也最大，以下依次是左氧氟沙星和洛美沙星。從結(jié)構(gòu)上看，3種QNs母環(huán)相同，各自取代基的種類和數(shù)量皆不同，可見影響醫(yī)藥品毒性的因素來源于取代基。翟麗華[12]選取17個部分取代苯化合物對發(fā)光菌的急性毒性研究得出取代基對發(fā)光菌的毒性貢獻(xiàn)大小順序為-NO2>-Cl>-CH3>-NH2>-OH。李曉等[13]研究10種苯并噻唑類污染物對青?；【鶴67毒性效應(yīng)得出各取代基對青海弧菌毒性排序為巰基取代>氨基>2羥苯基>羧酸乙酯>溴>氟>甲基>氯>甲硫基>苯并噻唑。上述試驗結(jié)論均是在各同系物取代基單一的情況下取得，對本試驗有借鑒參照的意義。如需獲得各取代基對藥物的毒性貢獻(xiàn)則需要對更多相關(guān)試驗結(jié)果加以分析及分子相互作用機(jī)制的理論支持。

2.2 二元混合體系聯(lián)合毒性分析

將3種化合物按等毒性比例配成二元混合體系，其混合體系的聯(lián)合毒性作用見表2。由表2可知，等毒性比例混合時，3組二元混合體系均表現(xiàn)出拮抗作用。根據(jù)3組二元混合體系的MTI和AI的不同，可判斷其拮抗作用的強(qiáng)度有所不同，由此獲得不同體系拮抗作用的排序為加替沙星+洛美沙星﹥加替沙星+左氧氟沙星﹥左氧氟沙星+洛美沙星。

2.3 三元混合體系聯(lián)合毒性分析

將3種化合物按等毒性比例配成三元混合體系，其混合體系對發(fā)光菌的EC50及聯(lián)合毒性作用類型見表3。二元混合體系聯(lián)合毒性類型均表現(xiàn)為拮抗作用，由此分析，3種喹諾酮類抗生素分子間的相互作用導(dǎo)致體系聯(lián)合毒性降低，多個二元拮抗體系累加，分子間相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致多元混合體系呈拮抗作用。由表3可知，等毒性比例混合時，三元混合體系表現(xiàn)出拮抗作用，且拮抗作用較強(qiáng)，試驗結(jié)果符合分析，多元混合體系聯(lián)合毒性作用類型表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)是各拮抗體系累加的結(jié)果。方章順等[14]研究典型抗生素與群體感應(yīng)抑制劑對費氏弧菌的三元慢性聯(lián)合毒性時證明混合體系為拮抗效應(yīng)，是其中兩個較強(qiáng)的拮抗體系疊加的結(jié)果。任皓等[15]研究鹽酸吉他霉素與金霉素、鹽霉素、黃霉素對發(fā)光細(xì)菌聯(lián)合毒性作用時，在多個混合體系得到相似結(jié)論，表明體系中拮抗作用表現(xiàn)較強(qiáng)的分子混合體系起主導(dǎo)作用。此外試驗得多元混合體系均表現(xiàn)為拮抗作用，可見醫(yī)藥品在環(huán)境中，經(jīng)過各途徑混合后，其相互作用可能導(dǎo)致毒性減弱，以及微生物耐藥性的產(chǎn)生和傳播，致使微生態(tài)平衡遭到破壞。

3種評價方法對二元或多元混合體系的聯(lián)合毒性評價結(jié)論一致，均為拮抗作用，表明3種評價方法具有良好的一致性，其中相加指數(shù)法所得數(shù)值絕對值最大，參數(shù)物理意義較明確，評價結(jié)果便于理解。孟慶俊等[11]對苯胺及硝基苯胺的二元混合體系運用毒性單位法、相加指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法等進(jìn)行聯(lián)合毒性的評價，結(jié)果具有良好的一致性，均為較強(qiáng)的拮抗作用。董玉瑛等[10]采用毒性單位法、加和指數(shù)法、混合毒性指數(shù)法和相似性參數(shù)法4種評價方法對SDS、苯酚、甲苯、硝基苯的多元混合體系進(jìn)行聯(lián)合毒性作用類型評價，結(jié)果較為一致，均為協(xié)同作用，且聯(lián)合毒性強(qiáng)弱評價結(jié)果呈現(xiàn)出一致的順序。

2.4 毒性作用機(jī)制的初步探討

二元及三元混合體系聯(lián)合毒性作用皆為拮抗效應(yīng)，對于呈現(xiàn)的聯(lián)合毒性作用效應(yīng)，可從喹諾酮類抗生素不同取代基的特性及其相互作用、發(fā)光桿菌發(fā)光原理進(jìn)行初步的聯(lián)合毒性機(jī)理分析。

大部分發(fā)光細(xì)菌發(fā)光機(jī)制是基本相同的，都必須有細(xì)菌熒光素酶（LE）、還原性的黃素單核苷酸（FMNH2）、氧氣（O2）、長鏈脂肪醛（RCHO）的參與，大體發(fā)光反應(yīng)過程如下[10]：

試驗中3種藥品存在較大電負(fù)性、含孤電子對的元素（F、O、N），他們所在的基團(tuán)氨基（-NH2）、羥基（-OH）等都易與黃素單核苷酸結(jié)合形成氫鍵，阻礙或阻止FMNH2在氧化和還原形式之間的氫傳遞，抑制發(fā)光[10]。結(jié)合本試驗3種QNs聯(lián)合毒性作用類型，拮抗作用引起發(fā)光桿菌發(fā)光變化是由于在反應(yīng)中，還原態(tài)的黃素單核甘酸（FMNH2）被氧化成黃素單核甘酸（FMN）的過程中起到了傳遞氫的作用，加替沙星、洛美沙星和左氧氟沙星的分子中均含有N元素，對于FMNH2而言是一種營養(yǎng)元素，可在一定程度上促進(jìn)氫的傳遞，進(jìn)而降低發(fā)光的抑制程度，表現(xiàn)為拮抗作用。進(jìn)一步結(jié)論還需要對藥物聯(lián)合毒性作用機(jī)制以及發(fā)光菌生理生化反應(yīng)等進(jìn)行深入研究。在此基礎(chǔ)上可開展QNs四元及以上多元混合體系的聯(lián)合毒性作用類型的研究，同時運用建模等手段輔助研究。endprint

3 小結(jié)

本試驗主要研究了3種QNs對發(fā)光菌的急性單一及聯(lián)合毒性。①3種QNs單一毒性由強(qiáng)到弱的順序依次為加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星。由此推斷其單一毒性可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。②二元、三元體系QNs聯(lián)合毒性皆呈現(xiàn)出不同程度的拮抗作用，此類醫(yī)藥品在環(huán)境中的聯(lián)合使用可能導(dǎo)致混合毒性減弱，造成微生物耐藥性的產(chǎn)生和傳播，影響微生態(tài)的平衡。③3種評價方法表現(xiàn)出良好的一致性，都是評價聯(lián)合毒性可行的方法，其中以相加指數(shù)法獲得參數(shù)絕對值較直觀，判定靈敏度較高。

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