劉 琦 魏璐珊 王 穎 楊玉生 魯雅琴

(蘭州大學第一醫(yī)院康復科，甘肅 蘭州 730000)

Notch信號通路在大鼠骨髓間充質干細胞移植后促進腦缺血區(qū)血管新生過程中的作用

劉 琦 魏璐珊 王 穎1楊玉生 魯雅琴1

(蘭州大學第一醫(yī)院康復科，甘肅 蘭州 730000)

目的探討Notch1信號通路在骨髓間充質干細胞(MSCs)移植后促進腦缺血區(qū)血管新生過程中的作用。方法分離、培養(yǎng)SD大鼠MSCs，制作大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，將試驗分為正常組、腦缺血后MSCs移植組、腦缺血后MSCs移植+rhNF-κB組、腦缺血對照組。腦組織冰凍切片行Ⅷ因子免疫組織熒光染色檢測各試驗組MSCs移植1、4、7、14 d后缺血皮質區(qū)微血管數量。Western印跡檢測各試驗組MSCs移植1、4、7、14 d后缺血皮質區(qū)血管內皮生長因子(VEGF)165、Notch1、Hes1蛋白表達。結果缺血對照組、MSCs移植組和MSCs移植+rhNF-κB組在各時間點微血管數量及VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達均顯著高于正常組，從第14天起開始下降，3組的微血管數量及VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達依次上升，差異顯著(P<0.01)。結論MSCs移植可促進缺血區(qū)新生血管的形成，并可通過激活Notch信號通路促進缺血皮質區(qū)VEGF165的表達，從而促進缺血區(qū)的血管新生。

Notch1信號通路；骨髓間充質干細胞；移植；腦缺血；血管新生

骨髓間充質干細胞(MSCs)是存在于骨髓間質中的非造血干細胞，具有很強的增殖能力和多向分化潛能〔1〕。此外，MSCs還能分泌血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF)-2等多種細胞因子和生長因子，對周圍組織和細胞起支持作用〔2〕。研究顯示，將MSCs移植到缺血損傷大鼠體內，缺血區(qū)新生血管的數量增多，并能促進腦缺血損傷神經功能的恢復〔3〕，MSCs對腦缺血具有重要影響。Notch信號通路對血管新生的作用已受到廣泛關注〔4〕，但如何影響MSCs從而使腦缺血區(qū)血管新生的作用尚不清楚。本研究建立大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，研究Notch信號通路在MSCs移植后促進腦缺血區(qū)血管新生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器 SPF級SD雌性大鼠40只，體重240～280 g，用于腦缺血模型的制作；雄性SD大鼠10只，體重90～140 g，用于MSCs的分離培養(yǎng)試驗。由蘭州大學實驗動物中心提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；小鼠抗大鼠Notch1抗體購自美國Chemicon公司；兔抗大鼠VEGF抗體購自上海長嘉生物科技有限公司；兔抗大鼠Hes1抗體購自武漢武士得生物技術有限公司；辣根過氧化物標記的羊抗鼠IgG購自美國Abcam公司；組織蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2MSCs細胞的分離培養(yǎng) 取出用于MSCs分離培養(yǎng)的SD大鼠，分離兩側的股骨，充分暴露出骨髓腔，用DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將骨髓懸液過濾并離心后，棄掉上清，重懸細胞后移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、95%相對濕度、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后去掉未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液，之后每3天換液1次，細胞生長融合度達到80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。取第4代 MSCs用于實驗研究。

1.3MCAO模型的建立 參照改良的Zea Longa制作MCAO模型。簡要步驟：抓取用于制作模型的大鼠，置于天平上稱重，按照1 ml/100 g腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，于固定板上固定頭和四肢，充分暴露頭部，剪掉頸部毛發(fā)，取頸部正中切口，顯微鏡下分離暴露出頸前部肌群，在右側胸鎖乳突肌和頸前部肌群間分離暴露出右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。將頸外動脈遠心端與頸總動脈近心端結扎，動脈夾夾閉頸內動脈。在頸外動脈近心端剪一“V”形切口，將一特制的4～0線栓經頸總動脈順利進入頸內動脈，插入長度約距離頸總動脈18 mm處。固定線栓，用00號線縫合皮下組織，進行簡單的包扎。1 h后拔線，縫合頸部切口。術后喂四環(huán)素水，預防感染。

1.4MCAO癱瘓程度評分 動物麻醉清醒后，參照經典的Zea Longa法(5級4分法)進行神經功能缺損評分。0分：無神經缺損癥狀；1分：不能伸展對側前爪；2分：行走時向左轉圈；3分：行走時向左側跌倒；4分：不能自發(fā)行走或意識喪失。1～3分者為研究對象。神經損傷太重或太輕的老鼠舍去。

1.5試驗分組 (1)正常組；(2)腦缺血后MSCs移植組：模型制作24 h后，將培養(yǎng)至第4代 MSCs細胞通過股靜脈勻速注入。MSCs移植組又分為移植1、4、7、14 d；(3)腦缺血后MSCs移植組+rhNF-κB組：細胞生長至80%～90%時，向細胞中加入1 μg/ml rhNF-κB，再按(2)的方法移植；(4)腦缺血對照組。按MSCs移植組操作方法注入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.6微血管密度(MVD)檢測 隨機選擇各實驗組各時間點每只腦組織冰凍切片5張，用免疫組織熒光染色法行Ⅷ因子檢測。MVD計數按照每單個內皮細胞或內皮簇為一個血管計數，每個標本取2～3張切片，每張切片在低倍顯微鏡下選擇同一皮質缺血區(qū)的5個血管內皮細胞染色密集區(qū)，在200倍顯微鏡下對微血管進行計數，取均值作為微血管密度。

1.7Western印跡檢測VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達 按照組織蛋白提取試劑盒提取大鼠缺血區(qū)腦組織中的總蛋白，按照BCA試劑盒說明測定提取的蛋白濃度。將各組蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶1的比例充分混勻，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳分離，4℃轉膜過夜。取出聚偏氟丙稀(PVDF)膜用5 %脫脂奶粉封閉1 h后，以VEGF165、Notch1、Hes1抗體作為一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育2 h，TBST清洗后加入增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參，分析蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組不同時間點大鼠缺血皮質區(qū)微血管計數 缺血對照組、MSCs移植組和MSCs移植+rhNF-κB組在1、4、7、14 d微血管數均顯著高于正常組，從第14天起3個組微血管數開始下降，且在各個時間點依次上升，差異顯著(P<0.01)。見表1。

2.2MSCs移植及Notch1信號通路對缺血皮質區(qū)VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達的影響 缺血對照組、MSCs移植組和MSCs移植+rhNF-κB組在各時間點VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達均顯著高于正常組，從第14天起開始下降，3組在各個時間點依次上升，差異顯著(P<0.01)。見圖1，表2～表4。

A:MSCs移植+rhNF-κB組；B:MSCs移植組；C:缺血對照組；D:正常對照組；E:GAPDH圖1 MSCs移植及Notch1信號通路對缺血皮質區(qū)VEGF165、Notch1、Hes1蛋白表達的影響

組別1d4d7d14d正常組2 45±0 182 46±0 202 49±0 262 52±0 25缺血對照組3 48±0 621)4 84±0 411)5 42±0 691)4 78±0 471)MSCs移植組4 63±0 641)2)5 56±0 681)2)8 48±0 841)2)6 87±0 561)2)MSCs移植+rhNF?κB組6 26±0 721)2)3)7 43±0 761)2)3)11 84±0 751)2)3)7 83±0 611)2)3)

與正常組比較：1)P<0.05；與缺血對照組比較：2)P<0.05；與MSCs移植組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組不同時間點VEGF165蛋白表達

表3 各組不同時間點Notch1蛋白表達

表4 各組不同時間點Hes1蛋白表達

3 討 論

MSCs移植后促進腦缺血新生血管生成的作用機制尚不清楚。Notch信號通路的激活對胚胎、成體腫瘤等組織的血管新生有調控作用〔5〕。MSCs移植后是否激活了Notch信號通路從而影響腦缺血血管新生的作用還有待進一步探討。

血管新生是血管內皮細胞通過分裂增殖形成血管的過程，是主要的形成血管的方式。目前發(fā)現的促血管生成因子有VEGF家族、FGF家族、血管新生素等。研究顯示，慢性心肌缺血后VEGF的表達水平明顯上調，從而促進缺血區(qū)新生血管的形成〔6〕。將MSCs移植到腦缺血大鼠體內后，可發(fā)現VEGF的表達水平明顯高于對照組，且微血管的數量及血液灌輸量明顯增多〔6〕。VEGF對血管新生具有重要調控作用，其中的VEGF165作用最為明顯〔7〕。本研究結果這說明移植MSCs能通過上調VEGF165表達促進新生血管的形成。隨著對血管新生有關的信號通路研究的不斷深入，研究者發(fā)現Notch、JAK/STAT、WNT等信號通路均能調控血管新生，其中Notch信號通路的調控作用最明顯〔8〕。Notch信號通路是一個高度保守的信號調節(jié)系統(tǒng)，對細胞的增殖、分化和成熟有重要作用，該信號系統(tǒng)由Notch配體、Notch和CSL等組成。Notch的配體包括Jagged-1、Jagged-2、Deltalike-1、Deltalike-2、Deltalike-3、Deltalike-4。Notch受體與Jagged-1配體結合后，Notch蛋白被γ-分泌酶切割，釋放出胞內的活性片段NICD，NICD進入細胞核后可與Maml家族的激活因子及DNA結合蛋白CSL結合從而形成起始轉錄復合物，啟動Hes、Hey基因家族靶基因的轉錄，作為下游基因Math-1等的阻遏子發(fā)揮作用〔9，10〕。在小鼠缺血模型中過表達Notch1，發(fā)現缺血區(qū)微血管數量及血液灌輸量明顯高于單純性損傷組〔11～13〕。這說明調控Notch信號通路可促進缺血區(qū)微血管增加。本研究結果說明移植MSCs能通過上調Notch1和Hes1蛋白表達促進血管新生，同時移植MSCs和rhNF- κB作用更明顯。

1Zhao Q,Gregory CA,Lee RH,etal.MSCs derived from iPSCs with a modified protocol are tumor-tropic but have much less potential to promote tumors than bone marrow MSCs〔J〕.Proc Nat Acad Sci,2015;112(2):530-5.

2Bhoj M,Zhang C,Green DW.A first step in de novo synthesis of a living pulp tissue replacement using dental pulp MSCs and tissue growth factors,encapsulated within a bioinspired alginate hydrogel〔J〕.J Endod,2015;41(7):1100-7.

3Chang HK,Kim PH,Cho HM,etal.Inducible HGF-secreting human umbilical cord blood-derived MSCs produced via TALEN-mediated genome editing promoted angiogenesis〔J〕.Mol Ther,2016;24(9):1644-54.

4Kerr G,Sheldon H,Chaikuad A,etal.A small molecule targeting ALK1 prevents Notch cooperativity and inhibits functional angiogenesis〔J〕.Angiogenesis,2015,18(2):209-17.

5Nedvetsky PI,Zhao X,Mathivet T,etal.cAMP-dependent protein kinase A(PKA)regulates angiogenesis by modulating tip cell behavior in a Notch-independent manner〔J〕.Development,2016;143(19):3582-90.

6Yu K,Wu S,Li H.A chitosan-graft-PEI-eprosartan conjugate for cardiomyocyte-targeted VEGF plasmid delivery in myocardial ischemia gene therapy〔J〕.J Exp Nanosci,2016;11(2):81-96.

7Yang J,Gao F,Zhang Y,etal.Buyang huanwu decoction(BYHWD)enhances angiogenic effect of mesenchymal stem cell by upregulating VEGF expression after focal cerebral ischemia〔J〕.J Mol Neurosci,2015;56(4):898-906.

8Tsai JL,Lee YM,Pan CY,etal.The Novel VEGF121-VEGF165 fusion attenuates angiogenesis and drug resistance via targeting VEGFR2-HIF-1α-VEGF165/Lon signaling through PI3K-AKT-mTOR pathway〔J〕.Curr Cancer Drug Targ,2016;16(3):275-86.

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13Cui D,Dai J,Keller JM,etal.Notch pathway inhibition using PF-03084014,a γ-secretase inhibitor(GSI),enhances the antitumor effect of docetaxel in prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2015;21(20):4619-29.

〔2017-01-05修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研項目(No.GSWST2012-3)

魯雅琴(1972-)，女，副教授，主任醫(yī)師，主要從事急性腦血管病及康復治療研究。

劉 琦(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事卒中后康復治療研究。

R318.06

A

1005-9202(2017)17-4185-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.007

1 蘭州大學第一醫(yī)院神經內科