林海燕 于佳寧 翟佳麗 趙 巖
(濱州醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264003)
萎胃康對(duì)萎縮性胃炎大鼠TFF3和Bcl-2表達(dá)的影響
林海燕 于佳寧1翟佳麗 趙 巖
(濱州醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264003)
目的以腸三葉因子(TFF3)和B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)兩種蛋白為切入點(diǎn),探討萎胃康治療慢性萎縮性胃炎(CAG)的可能機(jī)制。方法SD大鼠84只隨機(jī)分為造模組70只,正常對(duì)照組14只。采用復(fù)合造模法制備CAG大鼠模型,經(jīng)6 w造模成功后,將造模組剩余的60只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組及萎胃康高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥物組(12只/組)。各組給予相應(yīng)的藥物,每天灌胃1次,連續(xù)治療30 d后,分別用Real-time PCR法和Western印跡法檢測(cè)各組大鼠胃黏膜TFF3和Bcl-2兩種蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,各治療組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達(dá)和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05);其中以萎胃康高劑量組降低最明顯,較萎胃康中、低劑量組有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2表達(dá)是萎胃康顆粒治療CAG的機(jī)制之一。
萎胃康;萎縮性胃炎
慢性萎縮性胃炎(CAG)為消化系統(tǒng)的一種難治疾病,若伴有腸上皮化生或不典型增生,被稱為癌前病變。萎胃康顆粒系本課題組經(jīng)多年臨床觀察研制出的一種治療CAG的有效方劑。經(jīng)臨床研究及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)對(duì)CAG有確切療效。本文以B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和腸三葉因子(TFF3)兩種蛋白為切入點(diǎn),研究萎胃康對(duì)CAG大鼠治療的機(jī)制。
1.1材料 SD大鼠(體重180~200 g,溫度25℃,濕度50%)。萎胃康顆粒,組方為西洋參、白術(shù)、白芍、三七粉、延胡索、熊膽、甘草,由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供;使用當(dāng)日,配制成300、150和75 mg生藥/ml 3種不同濃度的藥液。維霉素糖衣片(湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):100903)使用當(dāng)日去糖衣,放入研缽中研為細(xì)末,用蒸餾水制成30 mg/ml懸濁液。水楊酸鈉(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):T20100125)配成濃度為2%的水楊酸鈉溶液。TRIzol試劑盒(TaKaRa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Gene Copoeia.inc)、RNA-free and DNA-free(Bioteke CorporationTaq)、熒光定量試劑盒(Gene Copoeia.inc)。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
1.2方法
1.2.1造模與分組 從84只SD大鼠中隨機(jī)取出70只為造模組,參照文獻(xiàn)〔1〕采用復(fù)合造模法制作大鼠CAG模型,即2%水楊酸鈉溶液,1次/d,每次灌胃2 ml,連續(xù)灌胃6 w,且灌胃前、后1 h禁食、禁水;術(shù)前3 w自由進(jìn)食、進(jìn)水;術(shù)后3 w單日禁食、不禁水,雙日足量喂食,自由進(jìn)水,且進(jìn)食后立即于溫水中游泳1次,時(shí)間為10 min。剩下的14只為正常對(duì)照組,正常飼養(yǎng)。6 w后,從造模組隨機(jī)取出10只、正常對(duì)照組隨機(jī)取出2只做常規(guī)病理。經(jīng)病理確認(rèn)造模成功后,將造模組余下60只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、萎胃康高、中、低劑量組和陽(yáng)性藥物組。除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水1 ml/100 g體重外,其余各治療組分別給予300、150、75 mg生藥/ml的萎胃康水溶液和30 mg/ml的維酶素混懸液,均按1 ml/100 g體重,1次/d。持續(xù)治療30 d。
1.2.2取材與標(biāo)本制備 末次給藥24 h后,以2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射。麻醉后,剖腹,摘取全胃,沿胃大彎側(cè)剪開(kāi),冷生理鹽水漂洗內(nèi)容物。取胃小彎側(cè)胃竇部黏膜裝入凍存管中,封口膜封口后,放入液氮中保存。
1.2.3Real-time PCR法檢測(cè)TTF3 mRNA表達(dá)量 提取胃總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃,5 min;變性,95℃,30 s;退火,58℃,30s;延伸,72℃,30 s;共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增,72℃后延伸5 min。實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行內(nèi)參基因β-actin的定量檢測(cè),以目的基因與內(nèi)參基因相對(duì)濃度比作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增反應(yīng)在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行,各樣品的熒光信號(hào)值由熒光定量PCR 儀的支持軟件ABI Prism7000SDS software 實(shí)時(shí)產(chǎn)生并自動(dòng)計(jì)算定量數(shù)值。
1.2.4Western印跡法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)量 從胃組織中提取蛋白,測(cè)定蛋白的濃度。取40 μg總蛋白與上樣液混合,上樣前煮沸5 min變性,將蛋白加入點(diǎn)樣孔,保證每孔蛋白量相同。電泳初始電壓80 V,溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后電壓提至100 V。濕轉(zhuǎn)法,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA 恒流,90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PVDF 膜取出并用marker筆標(biāo)記膜的方向。將膜完全浸沒(méi)于甲醇2 min,蒸餾水5 min,轉(zhuǎn)膜緩沖液15 min。5%BSA-TBST 稀釋一抗,1∶1 000,4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日,TBST 洗3 次,每次10 min。5% BSATBST稀釋二抗,1∶500,室溫孵育45 min。TBST洗膜3 次,每次10 min。加入顯影液,暗室顯色,掃描膠片,用軟件分析目的條帶灰度,經(jīng)內(nèi)參β-actin 校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS19.0軟件計(jì)量數(shù)據(jù)組間差異采用One-Way ANOVA分析。
2.1各組大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表達(dá)量的比較 模型對(duì)照組TFF3 mRNA表達(dá)(1.211±0.037)較正常對(duì)照組(1.077±0.009)顯著升高(P<0.05);藥物治療后,各治療組較模型對(duì)照組顯著降低,以萎胃康高劑量組(1.096±0.052)降低最明顯,萎胃康中、低劑量組(1.128±0.013,1.156±0.026)較萎胃康高劑量組有顯著差異(P<0.05),陽(yáng)性藥物組為1.117±0.023。
2.2各組大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表達(dá)量比較 模型對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)〔(101.02±4.61)×10-3〕最高,其次是萎胃康低劑量組〔(73.00±3.96)×10-3〕、萎胃康中劑量組〔(64.45±2.87)×10-3〕、陽(yáng)性藥物組〔(56.67±4.08)×10-3〕、萎胃康高劑量組〔(52.15±2.09)×10-3〕(圖1)。正常對(duì)照組〔(54.50±4.60)×10-3〕、各治療組較模型對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05);與萎胃康高劑量組比較,萎胃康中、低劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。
1:正常對(duì)照組;2:模型對(duì)照組;3:萎胃康低劑量組;4:萎胃康中劑量組;5:萎胃康高劑量組;6:陽(yáng)性藥物組圖1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表達(dá)量
CAG在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃脘痛”、“嘈雜”、“胃痞”等范疇。大多由于飲食不節(jié),戕傷中州;或外邪內(nèi)侵,損及脾胃;或憂思郁怒,肝失疏泄,橫逆犯胃;或稟賦不足,脾胃虛弱等。病變初期以濕熱阻滯、氣郁不暢為主,久則脾胃氣陰受損,或脾氣虛弱或胃陰損傷,進(jìn)一步發(fā)展可因氣不行血或陰不榮絡(luò)致胃絡(luò)血瘀。據(jù)此,筆者確立了補(bǔ)脾健胃、益氣養(yǎng)陰、理氣活血解毒之組方原則,創(chuàng)立了臨床經(jīng)驗(yàn)方萎胃康。方中西洋參為君藥,白術(shù)、白芍為臣藥,延胡索、三七、熊膽為佐藥,甘草為佐使藥。諸藥相合,具有陰陽(yáng)平衡、寒熱互制、攻補(bǔ)兼施、升降協(xié)調(diào)的特點(diǎn)。
方中西洋參中多種組分均具有抗腫瘤活性,Murphy等〔2〕研究表明人參皂苷Rg3具有抗癌活性;白術(shù)具體胃黏膜保護(hù)和抗腫瘤作用,沈國(guó)慶等〔3〕將從白術(shù)揮發(fā)油中分離得到的3個(gè)化合物,按不同劑量進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有抑瘤作用;延胡索中的總生物堿是延胡索抗腫瘤的主要活性成分,它可在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用,推測(cè)機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期時(shí)相分布、改變HepG2細(xì)胞mRNA表達(dá)譜有關(guān)〔4〕;以三七總甙為主的中藥提取物能使原癌基因C-myc的表達(dá)減弱,同時(shí)增強(qiáng)抑癌基因P16的表達(dá),可能是三七總甙為主的中藥提取物治療胃癌前病變有效的機(jī)制之一〔5〕;熊膽能有效清除亞硝胺前體物——亞硝酸鈉,并阻斷二甲基亞硝胺在體外的合成,表明熊膽能預(yù)防某些癌癥。
TFF是一組具有特定三葉結(jié)構(gòu)域的小分子多肽,在哺乳動(dòng)物中包括3 個(gè)因子:乳腺癌相關(guān)肽TFF1、解痙多肽TFF2和腸三葉因子TFF3。其中,TFF3 參與受損胃黏膜修復(fù),可保護(hù)胃腸黏膜,其表達(dá)與胃黏膜的損傷程度呈正相關(guān)〔6〕。一旦胃黏膜的修復(fù)得以完成,細(xì)胞停止移走。國(guó)外研究成果表明,在胃黏膜由腸化到不典型增生到胃癌的發(fā)展過(guò)程中,其表達(dá)不斷增強(qiáng)〔7〕。國(guó)內(nèi),黃亞平等〔8〕亦有同樣的報(bào)道。
根據(jù)TFF3 對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用機(jī)制,推測(cè)中藥萎胃康在治療CAG 的過(guò)程中,TFF3 是過(guò)度表達(dá)的。隨著疾病好轉(zhuǎn),TFF3 表達(dá)也隨之下降。TFF3在此過(guò)程中起到了參與損傷黏膜再生和修復(fù)的作用。
正常胃黏膜凋亡細(xì)胞較少,胃黏膜上皮組織依靠維持細(xì)胞凋亡和增殖的平衡來(lái)保持正常狀態(tài)。在胃黏膜的炎癥病理變化中凋亡細(xì)胞明顯增多,這種平衡被打破進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。1984 年,由Tsujimoro等最先分離出來(lái)Bcl-2,其過(guò)度表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的凋亡,使細(xì)胞高速增殖,為向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化提供條件。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖和凋亡異常的疾病。因此,有學(xué)者推測(cè)Bcl-2過(guò)度表達(dá)是胃癌演化過(guò)程中的早期事件〔9〕。
根據(jù)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的作用,推測(cè)胃康在治療CAG 的過(guò)程中,Bcl-2是過(guò)度表達(dá)的。隨著疾病好轉(zhuǎn),Bcl-2表達(dá)也隨之下降,并具有預(yù)防萎縮性胃炎癌變的作用。綜上所述,抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2的表達(dá)是萎胃康顆粒治療CAG的機(jī)制之一。
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〔2016-12-10修回〕
(編輯 曲 莉)
EffectofWeiweikangonTTF3andBcl-2expressionsinchronicatrophicgastritisinrats
LINHai-Yan,YUJia-Ning,ZHAIJia-Li,etal.
BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,Shandong,China
ObjectiveTo observe the effect of Weiweikang on the expressions of intestinal trefoil factor (TTF3) and B cell lymphoma 2 (Bcl-2) in chronic atrophic gastritis (CAG) in rats.Methods84 SD rats were randomly divided into model (n=70) and blank groups(n=14). CAG models were induced by composite molding method. After model induction, 60 remaining rats in model group were equally and randomly divided into model, Weiweikang high, middle and low dose and positive drug groups. Rats of each group were given the corresponding drug once daily. After treatment for 30 days, the expression of TTF3 mRNA was detected by Real-time PCR and the expression of Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsCompared with those of normal group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in model group were significantly increased(P<0.05). Compared with those of model group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in each treatment group were significantly reduced(P<0.05). The expressions of TTF3 and Bcl-2 in Weiweikang high dose group were reduced most obviously compared with those of Weiweikang middle and low dose groups(P<0.05).ConclusionsThe mechanism of Weiweikang treating CAG might be related to inhibiting the expressions of TTF3 and Bcl-2.
Weiweikang;Chronic atrophic gastritis
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273724);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014HL094);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013-249)
趙 巖(1964-),女,教授,碩士,碩士生導(dǎo)師,主要從事中藥復(fù)方治療消化系統(tǒng)疑難雜癥的基礎(chǔ)研究。
林海燕(1978-),女,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事中藥復(fù)方藥理研究。
R285
A
1005-9202(2017)17-4183-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.006
1 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院