沈泓　李玨　沈穎　曹煒　吳鑫

摘 要：生物指示劑是一類特定微生物經(jīng)過特定方法制備的生物制品，它的孢子數(shù)量是衡量滅菌工藝生物滅殺力的重要參數(shù)。本文通過對(duì)不同的稀釋劑及前處理方法的研究，改進(jìn)操作環(huán)節(jié)來提高回收菌數(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物指示劑孢子的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

關(guān)鍵詞：環(huán)氧乙烷；生物指示劑；孢子計(jì)數(shù)；芽孢條

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）16-0202-02

生物指示劑是指一類特定微生物經(jīng)過特定方法制備的生物制品，這些特定微生物比普通微生物具有更強(qiáng)的耐受性。生物指示劑常用于制藥工藝中滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)以及氣體滅菌法、過濾除菌法的滅菌程序的驗(yàn)證。

孢子數(shù)量是衡量滅菌工藝生物滅殺力的重要參數(shù)，故需事先確定其適用性，方可應(yīng)用于產(chǎn)品滅菌工藝的開發(fā)和驗(yàn)證。孢子數(shù)量同時(shí)是基于商品化產(chǎn)品穩(wěn)定性考察所需要嚴(yán)格控制的內(nèi)容，生物指示劑使用者在應(yīng)用前能夠?qū)γ渴褂脝挝坏木鋽?shù)進(jìn)行測定。孢子計(jì)數(shù)普遍存在菌數(shù)回收率較低的問題，許多環(huán)節(jié)都可能影響最終結(jié)果，本文通過對(duì)不同的稀釋劑及前處理方法的研究，改進(jìn)操作環(huán)節(jié)來提高回收菌數(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物指示劑孢子的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣本收集

經(jīng)過市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)市售芽孢條式環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑主要有三家：廠家A，批號(hào)BATR-418；廠家B，140918；廠家C，141008。

1.2 儀器設(shè)備

MS3渦旋振蕩器，IKA；IF450恒溫培養(yǎng)箱，Memmert；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，Sanyo。

1.3 試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3303005；供應(yīng)商：廣東環(huán)凱）。

吐溫-80（批號(hào)：20160623；供應(yīng)商：國藥）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 以滅菌純化水作稀釋劑，用玻璃珠將樣品粉碎

取待測樣品1片，放入一支含玻璃珠的內(nèi)置10ml冷卻滅菌純化水的玻璃試管中，渦旋振蕩15min。將試管放入84℃的熱水中水浴10min，加熱完后迅速以冰水浴冷卻。轉(zhuǎn)移1ml的混懸液到試管中，用滅菌純化水進(jìn)行適宜的系列稀釋，選擇孢子數(shù)在30～300 cfu/皿稀釋級(jí)的稀釋液進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)測定。每個(gè)平皿中倒入45～50℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，待其凝固，倒扣平皿置36℃進(jìn)行培養(yǎng)，48h后進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)，記錄各皿的菌落數(shù)。每個(gè)樣本取4片芽孢條式環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑平行操作。結(jié)果見表1。

2.2 以含0.1%吐溫80的滅菌純化水作稀釋劑，用玻璃珠將樣品粉碎

將含0.1%吐溫80的滅菌純化水作為稀釋劑，其余實(shí)驗(yàn)方法同2.1，結(jié)果見表2。

2.3 以滅菌純化水作稀釋劑，用勻漿儀將樣品粉碎

取待測樣品1片，放入一個(gè)已滅菌的內(nèi)置50ml冷卻滅菌純化水的勻漿杯中，9000rpm勻漿5min，其余實(shí)驗(yàn)方法同2.1，結(jié)果見表3。

2.4 以含0.1%吐溫80的滅菌純化水作稀釋劑，用勻漿儀將樣品粉碎

取待測樣品1片，放入一個(gè)已滅菌的內(nèi)置50ml含0.1%吐溫80的滅菌純化水的勻漿杯中，9000rpm勻漿5min，其余實(shí)驗(yàn)方法同2.1，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 不同稀釋劑對(duì)于活孢子數(shù)測定的比較

比較相同粉碎方式不同稀釋劑的孢子數(shù)測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用含0.1%吐溫80的滅菌純化水作稀釋劑比不含吐溫的回收率有顯著增加，且RSD值明顯減小。分析原因，可能是由于吐溫80作為表面活性劑能使活菌孢子聚集體分割成細(xì)小的微粒，使其分散懸浮在溶液中，起到促使活菌孢子均勻分散的作用。

3.2 不同前處理方法對(duì)于活孢子數(shù)測定的比較

比較相同稀釋劑不同前處理方法的孢子數(shù)測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)采用勻漿法將樣品粉碎比采用玻璃珠的回收率有顯著增加，且RSD值明顯減小。分析原因，可能是由于玻璃珠很難打碎載菌紙片而勻漿儀的綜合攪拌刀高速旋轉(zhuǎn)，能將載菌紙片快速、完全地打碎，均勻效果勻漿法更優(yōu)。

3.3 適宜的活孢子數(shù)測定方法

綜合3.1和3.2的討論可見，稀釋劑的選擇以及前處理的方法對(duì)于活孢子數(shù)的測定結(jié)果的影響是顯而易見的。因此，為了真實(shí)反映環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑活孢子總數(shù)，建議選擇含適量表面活性劑的稀釋劑以及更有利于紙片粉碎、分散的勻漿法進(jìn)行樣品的前處理。endprint