李大偉

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 ?？?571200)

合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的表達情況及其臨床意義

李大偉

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，海南 海口 571200)

目的：探討FOXC2在合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中的表達情況，并分析其臨床意義。方法：選取2013年1月至2015年12月77例合并2型糖尿病乳腺癌患者為實驗組，另取80例非2型糖尿病乳腺癌患者作為對照組。手術切取患者腫瘤組織，對一部分標本提取組織RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT- PCR)技術檢測兩組患者癌組織中FOXC2 mRNA表達水平；對另一部分標本石蠟切片行ER、PR、Her- 2、FOXC2免疫組化檢測，對比免疫組化FOXC2表達結(jié)果與RT- PCR結(jié)果的一致性。比較兩組乳腺癌分子分型構(gòu)成比的差異，并做FOXC2表達與三陰乳腺癌(基底細胞樣型)的相關性分析。通過Kaplan Meier- plotter法分析FOXC2與乳腺癌患者預后的相關性。結(jié)果：RT- PCR結(jié)果顯示，實驗組癌組織FOXC2 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。免疫組化的結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2的表達水平與RT- PCR結(jié)果一致。實驗組luminal A型占比為22.1%(17/77),luminal B型為18.2%(14/77),Her- 2過表達型為24.7%(19/77),基底細胞樣型為35.1%(27/77)；對照組luminal A型占比為37.5%(30/80),luminal B型為30.0%(24/80),Her- 2過表達型為16.3%(13/80),基底細胞樣型為16.3%(13/80)。兩組患者luminal A型、luminal B型及基底細胞樣型占比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組患者FOXC2 mRNA表達水平與患者基底細胞樣型表型呈顯著正相關性(P<0.05)。Kaplan Meier- plotter結(jié)果顯示,高表達FOXC2乳腺癌患者預后差。結(jié)論：FOXC2是2型糖尿病致惡性腫瘤的潛在關鍵因子。

乳腺癌； 2型糖尿病； FOXC2； 乳腺癌分子分型； 預后

隨著人類生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的趨勢，世界衛(wèi)生組織預計2030年全球2型糖尿病患者將達到5.52億，嚴重威脅人類健康安全[1]。近年來許多研究顯示，2型糖尿病人群中某些腫瘤發(fā)生率明顯提高，其中就包括乳腺癌，其相對危險度是非糖尿病患者的1.27倍(相對危險度RR=1.27)[2]，但其機制尚未完全闡明。FOXC2是人類forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，作為控制能量代謝的關鍵基因，其可誘導棕色脂肪分化，提高胰島素敏感性，在對抗糖尿病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[3- 4]；但新近的研究[5- 8]顯示,FOXC2在多種惡性腫瘤中表達異常，且促進胃癌和結(jié)直腸癌細胞EMT的過程，影響宮頸癌和乳腺癌組織的血管的生成。以此為依據(jù)，本研究擬探究FOXC2在合并2型糖尿病乳腺癌患者中的表達情況及其與乳腺癌惡性程度和患者預后的關系，揭示其可能的臨床意義，以期指導臨床工作。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2013年1月至2015年12月77例合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織標本為實驗組，以同期80例非2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織標本作為對照組。手術切取的腫瘤組織一部分置于凍存管中，液氮下保存，用于RT- PCR實驗檢測FOXC2 mRNA表達；另一部分送至病理科做石蠟切片用于免疫組化檢測?；颊呋厩闆r見表1，兩組患者年齡、男女比例及病程差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 兩組患者一般情況的比較

組 別n年齡/歲(男/女)/例病程/年實驗組7753．8±8．31．2(42/35)2．91±0．37對照組8052．7±7．81．3(45/35)3．02±0．51t或χ2值0．9410．0461．261P值>0．05>0．05>0．05

1.2 糖尿病的診斷標準

患者術前存在既往糖尿病史(二級以上醫(yī)院明確診斷為2型糖尿病);患者既往無糖尿病史，但具有糖尿病典型癥狀，入院時空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L-1；患者既往無糖尿病史，無糖尿病典型癥狀，連續(xù)2次以上空腹血糖≥7.0 mmol·L-1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L-1。

1.3 主要試劑及抗體

主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code No:9108)、免疫組化試劑盒[Rabbit specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC Kit(ab64261)]?？贵w：FOXC2抗體(Abcam,ab55004)、Anti- Estrogen Receptor alpha抗體[EPR4097]- ChIP Grade(ab108398)、Anti- Progesterone Receptor抗體[Alpha PR6]- ChIP Grade(ab2765)、Anti- Ki67抗體(ab15580)、Anti- ErbB 2抗體[3B5](ab16901)。

1.4 檢測方法

1.4.1 腫瘤組織中mRNA水平的檢測 將收集的組織液氮下研磨至粉末，加入RNAiso Plus 1 ml，嚴格按照說明書上操作流程提取組織mRNA，取5 μg RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后利用熒光定量PCR儀檢測mRNA水平。反應條件：預變性94 ℃ 4 min；擴增條件94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。FOXC2上游引物為5′- GATGCATTATCTTTGTCTCCTGATC- 3′,下游引物為5′- GCTGCCCAGTTCTCAGCTCACAGGC- 3′,擴增引物大小為319 bp。以β- actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5′- TGGCACCCAGCACAATGAA- 3′,下游引物序列為5′- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA- 3′,目的片段大小為186 bp。

1.4.2 免疫組化的檢測與結(jié)果分析 將收集的組織制成4 μm石蠟切片，SP免疫組化技術法檢測組織中FOXC2、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體2(HER- 2)的表達情況，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。一抗使用質(zhì)量濃度為3 μg·ml-1，均用PBS稀釋，4 ℃孵育過夜，二抗孵育后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，沖洗后脫水、樹膠封片再行鏡檢。

IHC染色切片采用光學顯微鏡進行觀察，每張切片選取10個高倍視野，每個視野觀察100個腫瘤細胞，計算其中平均陽性的細胞比例。ER及PR以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標準，無陽性細胞或陽性細胞<10%的為陰性(-)，≥10%的為陽性(+)。Her- 2以細胞膜呈清晰棕色為陽性細胞，無陽性細胞或陽性細胞<10%的為陰性(-)，≥10%的為陽性(+)。Ki67以細胞核為棕黃色為陽性細胞，選陽性細胞密集的區(qū)域觀察500個細胞，計數(shù)陽性細胞的百分數(shù)，≥14%為陽性，<14%的為陰性。FOXC2以細胞漿或細胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性細胞，無陽性細胞或陽性細胞<10%的為陰性(-)，10%至50%的為陽性(+)，>50%為強陽性(++)。根據(jù)2011年ST Gallen共識乳腺癌亞型的定義和治療策略，將乳腺癌分為4個亞型，即腔上皮型乳腺癌A型(luminal A型)[ER(+)或PR(+)且HER- 2(-)]、腔上皮型乳腺癌B型(luminal B型)[ER(+)或PR(+)且HER- 2(-)]、HER- 2過表達型[ER(-)，PR(-)且HER- 2(+)]及基底細胞樣(basal like)型[ER(-)，PR(-)、HER- 2(-)]。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料采用平均數(shù)±標準差表示。行t檢驗比較兩組患者RT- PCR檢查結(jié)果差異是否有統(tǒng)計學意義，采用χ2檢驗檢測兩組患者乳腺癌分子分型構(gòu)成比的差異，采取Spearman相關性分析檢測患者FOXC2 mRNA水平的表達與基底細胞樣型的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者mRNA表達水平比較

RT- PCR結(jié)果顯示，77例實驗組FOXC2 mRNA表達水平為0.220 5±0.064，顯著高于對照組的0.112 8±0.041(t=12.60，P<0.001)。

2.2 兩組患者免疫組化結(jié)果比較

實驗組FOXC2強陽性為28.6%,高于對照組的18.75%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組FOXC2陽性為42.8%,高于對照組的38.75%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組FOXC2陰性患者為26.0%，低于對照組的42.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者腫瘤組織FOXC2免疫組化陽性率的比較 例

乳腺癌分子分型情況中，實驗組luminal A型為22.1%,低于對照組的37.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組luminal B型為18.2%，低于對照組的30.0%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組Her- 2過表達型為24.7%，高于對照組的16.3%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組基底細胞樣型為35.1%，高于對照組的16.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3 兩組患者FOXC2表達水平與基底細胞樣型的相關性分析

Spearman相關性分析結(jié)果示,實驗組和對照組患者FOXC2的mRNA表達水平與患者基底細胞樣型呈正相關(r=0.672,P<0.05)。

2.4 Kaplan Meier- plotter分析乳腺癌患者FOXC2的表達與患者預后的相關性

根據(jù)Kaplan Meier- plotter乳腺癌數(shù)據(jù)庫中的FOXC2表達水平及患者隨訪資料，837例患者FOXC2的表達水平分為高表達與低表達組。繪制生存分析曲線發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2高表達組較低表達組預后差，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

表3 兩組患者腫瘤組織乳腺癌分子分型的比較 例

圖1 乳腺癌患者腫瘤組織FOXC2的表達的生存曲線

3 討 論

2型糖尿病的發(fā)生與多種腫瘤的發(fā)生存在密切關系[9]，其機制尚未完全闡明，可能的機制包括：(1)2型糖尿病發(fā)生的胰島素抵抗直接或間接地導致高胰島素血癥，進而增加血中胰島素樣因子-1(insulin- like growth factor- 1，IGF- 1)的水平，其能促進細胞的增殖和分化，并抑制腫瘤細胞的凋亡[10]；(2)持續(xù)高血糖狀態(tài)為生長迅速的腫瘤細胞提供了充足的能量來源，且長期高血糖可導致細胞線粒體呼吸酶受損，細胞呼吸功能障礙，導致細胞內(nèi)ROS累積增加，可能對DNA造成損傷[11- 13]；(3)長期高血糖狀態(tài)可能導致免疫功能障礙，免疫監(jiān)視功能受損，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到積極作用[14- 15]。FOXC2是調(diào)節(jié)代謝的關鍵基因，該基因的低表達可導致體質(zhì)量指數(shù)、三酰甘油水平升高，胰島素敏感性及基礎代謝率降低，導致代謝綜合征的發(fā)生[16- 17]。Yang等[18]的研究表明，胰島素抵抗的患者脂肪組織及骨骼肌FOXC2表達水平顯著降低，棕色脂肪組織數(shù)量減少；Riddestrale等[19]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪細胞的FOXC2 mRNA表達水平與胰島素抵抗指數(shù)呈負相關，證實了FOXC2在代謝方面的重要作用。近年關于FOXC2與腫瘤的相關研究逐漸增多，其在多種惡性腫瘤高表達，如TGF、WNT、Snai1/FOXC2經(jīng)典腫瘤信號通路，且FOXC2本身也能促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Mortazavi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌細胞系中FOXC2的表達與其EMT過程呈正相關，F(xiàn)OXC2可下調(diào)E- cadherin的表達而降低細胞間黏附作用，增強細胞的轉(zhuǎn)移傾向；Paranjape等[21]的研究顯示,前列腺癌細胞中FOXC2促進其細胞干性的維持；Nishida等[22]的研究指出,食管癌患者癌組織中FOXC2的表達與基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(MMP9)的表達呈正相關，提示FOXC2可能對食管癌侵襲轉(zhuǎn)移起促進作用。

本研究合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的mRNA及蛋白表達水平明顯高于非糖尿病乳腺癌患者，推測可能的原因是實驗組患者受到致病因素的影響，正常組織如脂肪組織、骨骼肌中FOXC2的表達量下降，使機體發(fā)生胰島素抵抗，代償性地導致腫瘤組織FOXC2的表達增加，導致兩組患者腫瘤組織FOXC2的表達出現(xiàn)差異。腫瘤組織FOXC2的表達量增加，不僅促進了機體整體的糖代謝，也加快了腫瘤組織的代謝進程，且FOXC2與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤干性的維持密切相關，加深細胞惡性程度，使得患者預后不良。本研究結(jié)果也證實了上述推測，實驗組患者乳腺癌分子分型更傾向于惡性程度高的基底細胞樣型，且腫瘤組織FOXC2表達高的患者預后不良。

關于2型糖尿病導致惡性腫瘤的機制尚不完全明確，本研究為揭示其確切機制提供了線索，F(xiàn)OXC2可能在其中發(fā)揮重要的中間作用。今后研究須進一步明確FOXC2在乳腺癌中扮演何種角色，探究其與其他分子間的相互作用，確定其可能的靶標分子，為乳腺癌臨床診斷及治療提供新的依據(jù)。

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2016- 10- 21

2017- 05- 15

李大偉(1980-)，男，海南?？谌耍髦吾t(yī)師，在讀碩士研究生。E- mail:dawei0898@163.com

李大偉.合并2型糖尿病乳腺癌患者腫瘤組織中FOXC2的表達情況及其臨床意義[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2017，36(4)：619- 623.

R737.9; R587.1

A

1671- 6264(2017)04- 0619- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.025