熊 英, 張金娟, 李 玲, 陳 燕, 吳艷俊, 黃惠妍

(貴州醫(yī)科大學(xué)1. 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室(花溪區(qū)大學(xué)城), 貴陽550025; 2. 附屬醫(yī)院內(nèi)科, 貴陽550004)

香煙煙霧對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及血清細(xì)胞因子水平影響

熊 英1, 張金娟1, 李 玲1, 陳 燕2, 吳艷俊1, 黃惠妍2

(貴州醫(yī)科大學(xué)1. 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室(花溪區(qū)大學(xué)城), 貴陽550025; 2. 附屬醫(yī)院內(nèi)科, 貴陽550004)

目的 探討被動(dòng)吸煙聯(lián)合氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)法制備大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型過程中, 大鼠肺功能及血清中細(xì)胞因子水平的變化。方法 72只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為4周、6周、8周模型組，自然愈合3周、6周組和對(duì)照組。采用氣管內(nèi)兩次注入LPS聯(lián)合持續(xù)熏煙的方法建立COPD大鼠模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)被動(dòng)吸煙過程中及停止熏煙后，動(dòng)物肺功能指標(biāo)0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)及其與用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC)的變化; 同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素8(IL-8)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 與對(duì)照組比較, 各模型組 FEV0.3、FEV0.3/FVC、IL-10水平降低, IL-8、TNF-α水平升高(P均＜0.05); 且隨著熏煙時(shí)間延長細(xì)胞因子及肺功能指標(biāo)變化更為顯著。模型組IL-8、TNF-α水平與FEV0.3/FVC呈負(fù)相關(guān)(P＜0.001, r=-0.579; P=0.034, r=-0.354)。與對(duì)照組比較, 自然愈合6周組IL-8、TNF-α水平下降(P均＜0.05), IL-10升高(P＜0.05)，各自然愈合組FEV0.3、FEV0.3/FVC均低于對(duì)照組(P均＜0.05)。結(jié)論 香煙煙霧刺激能顯著影響COPD大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平。

慢性阻塞性肺疾病(COPD); 細(xì)胞因子; 動(dòng)物模型; 香煙煙霧

隨著人口老齡化和環(huán)境污染加重，世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)導(dǎo)致的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將進(jìn)一步增加[1]。吸煙和反復(fù)感染是人類COPD的重要發(fā)病因素[2]，被動(dòng)吸煙復(fù)合氣道內(nèi)注入脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)法建立的COPD大鼠模型具有發(fā)病機(jī)制與人類相似、造模方法容易掌握的優(yōu)點(diǎn), 是目前國內(nèi)研究者常用的動(dòng)物模型。該模型具有造模時(shí)間短，4周即可建立COPD大鼠模型[3,4]的優(yōu)點(diǎn)，但亦存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短時(shí)間內(nèi)需經(jīng)受多種刺激(煙熏、LPS、麻醉、氣管滴注機(jī)械損傷等)，以及熏煙的劑量較大的缺點(diǎn)。香煙煙霧對(duì)動(dòng)物氣道的直接損害，以及機(jī)體對(duì)刺激的應(yīng)激反應(yīng)都會(huì)引起動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞因子水平的改變。本實(shí)驗(yàn)就香煙煙霧對(duì)COPD模型大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平的影響進(jìn)行了探討，以進(jìn)一步明確該動(dòng)物模型體內(nèi)細(xì)胞因子水平變化的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

72只清潔級(jí)雄性SD大鼠, 體質(zhì)量(200±20) g第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍)2012-0011]。于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(黔)2012-0001]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度18～25℃，通風(fēng)良好。

1.2 主要儀器與試劑

HX200插管式呼吸傳感器、BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng), 成都泰盟軟件有限公司; 酶標(biāo)儀, 美國BioTek公司; 黃果樹(10 mg)過濾嘴香煙, 貴州中煙公司; 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(L2880-10 mg),索萊寶生物技術(shù)有限公司; 白細(xì)胞介素8(interleukin-8,IL-8)、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-alpha, TNF-α)試劑盒, 上海滬鼎生物技術(shù)有限公司; 有機(jī)玻璃熏煙箱(50 cm×40 cm×20 cm)自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和造模方法 (1)動(dòng)物分組： 計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組法將72只SD大鼠分成對(duì)照組、4周、6周和8周模型組、自然愈合3周和6周組，每組12只。(2)造模方法： 采用氣管內(nèi)滴注脂多糖聯(lián)合持續(xù)熏煙的方法造模，于造模第1日和第14日，參照陳燕等[5]的方法將動(dòng)物麻醉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%水合氯醛4.5 mL/kg，腹腔注射)后行直視下氣管插管術(shù)，除對(duì)照組注入等量生理鹽水外，其余各組大鼠氣道內(nèi)均注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%LPS溶液200 μL。從造模第2日起，除對(duì)照組外各組大鼠均予以被動(dòng)吸煙，1 次 /日(參照前期的實(shí)驗(yàn)方法[6]： 將 6 只大鼠放入有機(jī)玻璃熏煙箱內(nèi), 同時(shí)點(diǎn)燃2支香煙并置于箱內(nèi)兩對(duì)角的位置，待自行燃盡后立即更換, 每次熏煙共需燃盡8支香煙, 約45 min)。4周、6周和8周模型組分別連續(xù)熏煙28 d、42 d和 56 d; 自然愈合3周和6周組則連續(xù)熏煙56 d后停止熏煙，于造模前相同條件下分別飼養(yǎng)21 d和42 d。氣管內(nèi)滴注LPS當(dāng)日不予熏煙，對(duì)照組術(shù)后不予熏煙。

1.3.2 病理學(xué)觀察 取大鼠左肺行病理學(xué)檢查。用7#留置針行頸動(dòng)脈穿刺抽盡全血, 待動(dòng)物死亡后迅速開胸取出雙側(cè)肺組織，生理鹽水沖洗表面, 取左肺用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定, 脫水, 石蠟包埋，切片, 蘇木素-伊紅(HE)染色, 光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

各模型組于熏煙結(jié)束后次日將動(dòng)物麻醉后先測(cè)定呼吸功能0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)及其與用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC)，再行頸總動(dòng)脈插管術(shù)收集全血、分離血清, 測(cè)定IL-8、IL-10和TNF-α的含量。對(duì)照組與4周模型組在同日進(jìn)行檢測(cè)。自然愈合組分別于停止熏煙3周和6周后，用同樣方法檢測(cè)上述各項(xiàng)指標(biāo)。

設(shè)小正方形的邊長為x(即為原題設(shè)條件中所折無蓋長方體形盒子的高h(yuǎn))，則盒底的邊長為a-2x，所折無蓋長方體形盒子的高也為x，因此，無蓋方盒的容積為：

1.4.1 肺功能測(cè)定 麻醉后行氣管切開插管術(shù)，將Y型插管的一端與呼吸傳感器連接, 并通過BL-4 20 s生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)呼吸曲線，另一端接三通閥。在呼氣末打開三通閥并快速向氣管內(nèi)推入空氣6 mL(相當(dāng)于被動(dòng)深吸氣[7])，通過記錄到的呼吸曲線計(jì)算FEV0.3和FEV0.3/FVC。

1.4.2 細(xì)胞因子含量測(cè)定 用7#留置針行頸總動(dòng)脈穿刺, 并用真空采血管(普通血清管)收集全血, 室溫下靜置20 min后離心(3 000 r/min, 20 min), 分離血清。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定細(xì)胞因子含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，相關(guān)分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

造模過程中逐漸出現(xiàn)毛發(fā)微黃、體質(zhì)量減輕、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍以及呼吸伴喘鳴音等癥狀。停止熏煙后上述癥狀均有所好轉(zhuǎn)、體質(zhì)量增加。

2.2 病理觀察結(jié)果

對(duì)照組大鼠支氣管周圍及間質(zhì)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管、終末細(xì)支氣管、肺泡無明顯破壞，肺泡壁完整(圖1A)。各模型組均出現(xiàn)肺泡壁變薄、肺泡腔擴(kuò)大或肺泡壁破裂、融合形成肺大皰；支氣管黏膜壞死、脫落，伴淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤等(圖1B、C、D)，肺氣腫和支氣管炎癥的病理學(xué)改變，結(jié)合肺功能指標(biāo)(FEV0.3，F(xiàn)EV0.3/FVC)下降說明造模成功。與模型組比較，自然愈合組炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡擴(kuò)張融合等現(xiàn)象均有不同程度的減輕(圖1E、F)，其中以6周組更為明顯。

2.3 肺功能測(cè)定

與對(duì)照組比較, 各模型組和自然愈合組FEV0.3、FEV0.3/FVC均顯著下降(P＜0.05)，各模型組之間比較，6周、8周模型組與4周模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05); 與8周模型組比較，各自然愈合組FEV0.3、FEV0.3/FVC升高(P均＜0.05)，且自然愈合6 周組較3 周組升高(P＜0.05)，(表1)。

2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)

與對(duì)照組比較, 各模型組血清IL-8、TNF-α水平升高(P均＜0.05), IL-10水平下降(P＜0.05)。模型組間比較IL-8水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05)。各自然愈合組與8周模型組比較, IL-8、TNF-α水平顯著下降(P均＜0.05), 而IL-10水平顯著升高(P＜0.05);自然愈合組組間比較上述細(xì)胞因子水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與對(duì)照組比較, 自然愈合6周組IL-8、TNF-α水平下降, IL-10 升高(P＜0.05)(表 1)。

2.5 相關(guān)性分析

將全部模型組血清IL-8、TNF-α、IL-10水平與FEV0.3/FVC作直線相關(guān)分析, 模型組IL-8、TNF-α水平與FEV0.3/FVC呈負(fù)相關(guān)(P＜0.000, r=-0.579 P=0.034相關(guān)系數(shù)r=-0.354); 而IL-10與FEV0.3FVC無線性相關(guān)(P=0.304)。同樣對(duì)全部自然愈合組的上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，IL-8與FEV0.3/FVC呈負(fù)相關(guān)(P=0.041, r=-0.420)。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(×100)Figure 1 HE staining of lung tissue in rats of each group

表 1 各組大鼠肺功能和細(xì)胞因子水平比較Table 1 The concentration of IL-8, IL-10, TNF-α and lung function in rats of each groups

3 討論

COPD是呼吸系統(tǒng)常見疾病，反復(fù)發(fā)作的肺部感染是導(dǎo)致疾病加重的重要因素。肺部炎癥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的全身炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞的異常活化，并釋放大量炎性相關(guān)細(xì)胞因子，細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞相互作用進(jìn)一步放大炎癥效應(yīng)，并導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的破壞。因此細(xì)胞因子水平變化和炎癥細(xì)胞活化是全身炎癥反應(yīng)的標(biāo)志。動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和治療方法的基礎(chǔ)，但是由于COPD病因復(fù)雜且動(dòng)物和人存在種屬差異，目前尚無公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)COPD動(dòng)物模型制備方法。熏煙復(fù)合氣道內(nèi)注入LPS法最早由宋一平等[3]報(bào)道，該方法模擬了人類COPD的發(fā)病誘因，動(dòng)物病理生理狀況與人類相似，被許多國內(nèi)學(xué)者采用。但是除了疾病導(dǎo)致的機(jī)體炎癥反應(yīng)外，大劑量煙霧刺激能夠通過氧化應(yīng)激直接損傷氣道上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞因子水平的變化。因此，熏煙法建立的COPD動(dòng)物模型用于細(xì)胞因子相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，應(yīng)該充分考慮香煙煙霧對(duì)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞因子水平的直接影響。

本研究分別監(jiān)測(cè)了持續(xù)熏煙不同時(shí)間及停止熏煙后大鼠的肺功能和血清IL-8、IL-10和TNF-α的水平, 結(jié)果顯示, 造模4周后動(dòng)物肺功能指標(biāo)顯著下降，IL-8、TNF-α升高、IL-10下降(P均＜0.05)，結(jié)合病理檢查結(jié)果說明該動(dòng)物模型成立，并且細(xì)胞因子在早期就有顯著改變。模型組之間比較顯示，隨著造模時(shí)間延長上述細(xì)胞因子水平變化更為顯著，且模型組IL-8、TNF-α水平與FEV0.3/FVC呈負(fù)相關(guān)，與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。IL-8主要由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是中性粒細(xì)胞重要的趨化因子。TNF-α是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，其通過氣道慢性炎癥網(wǎng)絡(luò)，參與了COPD氣道重塑和阻塞進(jìn)程[9]。IL-10是重要的抗炎因子, 研究認(rèn)為IL-10的減少與COPD氣道炎癥的持續(xù)存在關(guān)系密切[10]。臨床研究認(rèn)為，IL-8和TNF-α相互影響，共同參與了氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑過程, 導(dǎo)致患者肺功能下降[11,12]，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示，模型組大鼠血清IL-8、TNF-α水平與FEV0.3/FEV0.3/FVC有負(fù)相關(guān)關(guān)系，且自然愈合組IL-8與FEV0.3/FEV0.3/FVC也呈負(fù)相關(guān)，提示這兩個(gè)因子一定程度上反映了該動(dòng)物模型COPD的嚴(yán)重程度。

為了進(jìn)一步探討該動(dòng)物模型體內(nèi)細(xì)胞因子水平變化與煙霧刺激的關(guān)系, 監(jiān)測(cè)了停止熏煙3周和6周后大鼠肺功能和血清中上述因子的水平，結(jié)果顯示： 自然愈合組大鼠肺功能指標(biāo)較8周模型組改善(P均＜0.05), 但與對(duì)照組比較, FEV0.3、FEV0.3/FVC降低(P均＜0.05); 與8周模型比較, 自然愈合組上述細(xì)胞因子水平呈顯著恢復(fù)趨勢(shì); 自然愈合3周組細(xì)胞因子水平與對(duì)照組接近。提示香煙煙霧是引起細(xì)胞因子水平變化的因素之一，停止熏煙后因子水平的變化能在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，但肺功能損傷不可逆。

被動(dòng)吸煙復(fù)合氣道內(nèi)注入LPS法建立的COPD大鼠模型雖然具有發(fā)病機(jī)制與人類相似、建模所需時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，且大鼠血清IL-8和TNF-α水平與肺功能下降有相關(guān)關(guān)系，但是短時(shí)間內(nèi)大劑量香煙煙霧刺激導(dǎo)致的呼吸道損傷，也是導(dǎo)致體內(nèi)部分細(xì)胞因子水平變化的重要因素，停止熏煙后血清細(xì)胞因子水平變化會(huì)在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，與人類COPD的慢性呼吸道和全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞因子變化不完全相同，因此在采用這一動(dòng)物模型進(jìn)行細(xì)胞因子相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)充分考慮該因素的影響。

[1] Lopez AD, Shibuya K, Rao C, et al. Chronic obstructive pulmonary disease： current burden and future projections[J]. Eur Respir J, 2006, 27(2)：397-412.

[2] 劉君波, 黃夢(mèng)珊, 余晨曦, 等. 慢性阻塞性肺疾病模型[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2011, 19(2)：129-133.

[3] 宋一平, 崔德健, 茅培英, 等. 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重塑及生長因子的研究[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2001, 24(5)：283-285.

[4] 楊金星, 袁嘉麗, 管翰粟, 等. 活血化瘀藥對(duì)COPD 模型大鼠氣道重塑的干預(yù)作用[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013,22(23)：2524-2526．

[5] 陳燕, 熊英, 李玲, 等. 慢性阻塞性肺疾病模型大鼠細(xì)胞因子水平變化的研究[J]. 中華疾病控制雜志, 2015, 19(8)：839-842.

[6] 熊英, 張金娟, 黃惠妍, 等. 異丙托溴銨霧化吸入治療對(duì)COPD大鼠肺功能的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 山東醫(yī)藥, 2016,56(21)： 27-29.

[7] 王翠茹, 李玲, 韓云霞, 等. 補(bǔ)肺膠囊對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功及血?dú)夥治龅挠绊慬J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥雜志,2012, 23(1)：104-106.

[8] Paone G, Conti V, Leone A, et al. Analysis of sputum markers in the evaluation of lung inflammation and functionalimpairment in symptomatic smokers and COPD patients[J].Dis Markers, 2011, 31(2)：91-100.

[9] Mukhopadhyay S, Hoidal JR, Mukherjee TK. Role of TNF-alpha in pulmonary pathophysiology[J]. Respir Res, 2006,7(1)：125-133.

[10] Takanashi SY, Hasegawa Y, Kanehira Y, et al. Interleukin-10 level in sputum is reduced in bronchial asthma, COPD and in smokers[J]. Eur Respir J, 1999, 14(2)：309-314.

[11] 牛穎梅. 慢性阻塞性肺疾病急性加重期細(xì)菌感染和細(xì)胞因子變化的臨床研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(9)1354-1357.

[12] 王曉青. 慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-8、IL-10、α HBDH、CRP及NO水平的變化[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2010, 26(12)：1262-1263.

Effects of Cigarette Smoke on Lung Function and Serum Cytokine Levels in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Rat

XIONG Ying1, ZHANG Jin-juan1, LI Lin1, CHEN Yan2, WU Yan-jun1, HUANG Hui-yan2
(1. Department of Medical Funtcion of the Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China;2. Department of Medicine,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China)

Objective To investigate the influence of cigarette smoke on lung function and serum cytokine levels in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rats which were established by the complex stimulation of lipopolysaccharide (LPS) and smoked cigarettes. Methods Seventy-two male SD rats were randomly divided into six groups, 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks model group, 3 weeks and 6 weeks natural healing group, and control group. A COPD rat model was established by the complex stimulation of two times LPS injection and smoked cigarettes. The lung function of the rats was measured during passive smoking and quit smoking. At the same time serum interleukin-8(IL-8), IL-10 and tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) levels were monitored by Enzyme-linked immunosorbent assay. Correlation analysis concerning cytokine levels and pulmonary function index were conducted. Results Compared with control group, forced expiratory volume in 0.3 second (FEV0.3), forced expiratory volume in 0.3 second as a percentage of forced vital capacity (FEV0.3/FVC) and IL-10 were decreased (P＜0.05), IL-8 and TNF-α levels were increased in the model groups (P＜0.05). And as the building time prolonged, the changes of those cytokines and lung function indexes were more obvious than before. IL-8 and TNF-α levels were inversely associated with FEV0.3/FVC(P＜0.001, r=-0.579; P=0.034, r=-0.354). Compared with control group, IL-8 and TNF-α levels were decreased in the 6 weeks healing group, at the same time IL-10 levels was increased(P＜0.05), the FEV0.3and FEV0.3/FVC were decreased in the healing groups (P＜0.05). Conclusions Cigarette smoke is the primary cause of changes on cytokine levels in this animal model.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Cytokines; Animal model; Cigarette smoke

R332; R563; Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0315-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.012

2017-05-30

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合LG字[2012]014號(hào))

熊 英(1977-), 女, 講師, 碩士。主要研究方向： 機(jī)能實(shí)驗(yàn)、藥理學(xué)。E-mail： xiongying1116@163.com

黃惠妍(1980-), 女, 臨床醫(yī)學(xué)碩士,E-mail： huanghuiyan8039@163.com