周漪波，朱志鑫，梁永威，黃瀠惠

（中國廣州分析測(cè)試中心廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

氣相色譜-質(zhì)譜法分析啤酒中游離脂肪酸

周漪波，朱志鑫*，梁永威，黃瀠惠

（中國廣州分析測(cè)試中心廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070）

啤酒中游離脂肪酸的含量對(duì)啤酒的風(fēng)味具有重要的影響。采用固相萃取法對(duì)市售啤酒中游離脂肪酸成分進(jìn)行提取，氣相色譜/質(zhì)譜法進(jìn)行定性分析并外標(biāo)法定量。通過添加一定加標(biāo)水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸），結(jié)果表明各脂肪酸在不同的加標(biāo)濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.8%，試驗(yàn)精密度較高。比較不同比例提取溶劑對(duì)各種脂肪酸回收率的研究，結(jié)果表明采用正己烷-乙醚（體積比50∶50）作為提取溶劑時(shí)提取效率相對(duì)最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕櫚酸89.8%、油酸93.5%），說明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定啤酒中的游離脂肪酸含量。

氣相色譜/質(zhì)譜（GC-MS）；回收率；啤酒；游離脂肪酸

啤酒是以麥芽為主要原料，添加酒花、酵母發(fā)酵釀制而成的一種含二氧化碳、低酒精度的飲料酒[1]。啤酒中存在的揮發(fā)性、低揮發(fā)性及不揮發(fā)性有機(jī)酸超過100多種，其中游離脂肪酸在多個(gè)方面影響啤酒質(zhì)量[2-4]。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等形成辛基風(fēng)味，其中辛酸和癸酸是“酵母味”的代表物質(zhì)[5]，長鏈不飽和脂肪酸會(huì)使麥汁渾濁，其通過氧化作用形成的氫過氧化物在一定條件下降解產(chǎn)生醛類等老化物質(zhì)，尤其是亞油酸和亞麻酸是反-2-壬烯醛的前體物質(zhì)[6]。另外，游離脂肪酸還影響啤酒的泡沫穩(wěn)定性及泡沫掛杯性等[7]，啤酒中的長鏈脂肪酸含量一般都比較低，而當(dāng)啤酒儲(chǔ)藏在極惡劣的條件時(shí)，其含量就容易增加很多，導(dǎo)致啤酒口味變差[8]。再者由于飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例同泡沫相關(guān)[9-10]，而啤酒泡沫是其重要的外觀特性。

為了研究游離脂肪酸對(duì)啤酒品質(zhì)的影響,應(yīng)該建立一套行之有效的測(cè)定方法。游離脂肪酸在啤酒中的含量極少,性質(zhì)又極不穩(wěn)定,如何對(duì)樣品進(jìn)行前處理是測(cè)定的關(guān)鍵。水蒸汽蒸餾[11-12]原理簡單但提取過程時(shí)間長、溫度高、其過程易造成成分的揮發(fā)損失，溶劑液液萃取法[13-15]儀器設(shè)備簡單、操作方便，但由于啤酒樣品相對(duì)基質(zhì)復(fù)雜，含有碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和少量脂肪酸[16]，萃取過程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致萃取物損失[17]。最近幾年，頂空頂相色譜法[18]、固相微萃取法[19]等也用于啤酒中脂肪酸的提取，但這兩種方法僅適合中短鏈脂肪酸的提取，對(duì)長鏈脂肪酸的萃取效率相對(duì)較低。

固相萃取是近年發(fā)展起來一種樣品預(yù)處理技術(shù)，可以更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，操作簡單、省時(shí)、省力，并已經(jīng)在脂肪酸分析中發(fā)揮作用[20]。本文采用固相萃取法對(duì)啤酒樣品進(jìn)行處理，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)，根據(jù)質(zhì)譜特征離子結(jié)合色譜保留時(shí)間確定游離脂肪酸的組成可以消除啤酒中復(fù)雜基體的干擾。結(jié)果表明該方法具有較高的準(zhǔn)確率和回收率，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合啤酒樣品中的游離脂肪酸分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HP 6890GC/5973MSD氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；脂肪酸甲酯對(duì)照品（1 mL，37 個(gè)組分，C4～C24 200 μg/mL～400 μg/mL）：美國 Supelco公司；辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸：美國Sigma公司。

Chem Elut SLE硅藻土液/液萃取柱：美國安捷倫公司；三氟化硼-甲醇溶液：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；正己烷、乙醚（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

試驗(yàn)用水為GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。

啤酒樣品：廣州某大型超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取脂肪酸甲酯對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到濃度為 20 μg/mL～60 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到濃度為2.0 μg/mL～6.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別準(zhǔn)確稱20.0 mg辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸于50 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容，得到濃度為400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

取20mL啤酒樣品，超聲振蕩除氣。讓啤酒樣品緩慢通過固相萃取小柱，然后用20mL正己烷-乙醚（體積比50∶50）將脂肪酸洗脫出來，濾入100 mL梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其濃縮至1mL，轉(zhuǎn)入10mL酯化管中。

1.4 酯化方法

在酯化管中加入0.1 mL 14%的三氟化硼-甲醇溶液，在95℃酯化20 min，再加入2 mL水及2 mL正己烷，振蕩分層,收集有機(jī)相，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1.0 mL，待測(cè)定。在這種酯化條件下，只有游離的脂肪酸能夠被甲酯化，而以甘油三酯和磷脂形式存在的脂肪酸不會(huì)被酯化[5]。

1.5 色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)

1.5.1 色譜條件

色譜柱 DB-FFAP（30 m×0.32 mm×0.50 μm）；柱溫80℃，程序升溫8℃/min，至220℃下保持10 min；進(jìn)樣口溫度240℃；載氣He，柱流量0.8 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣。

1.5.2 質(zhì)譜參數(shù)

EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍29 u～400 u，四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，電子倍增器電壓1 500 V，GC/MS接口溫度280℃，檢索譜庫為Nist11.L。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的定性檢測(cè)

分別將脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)處理的啤酒樣品0.2 μL注入到氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，根據(jù)質(zhì)譜特征離子[21]及標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時(shí)間得到的總離子流圖進(jìn)行定性分析。啤酒樣品1的總離子流圖見圖1。

2.2 樣品的定量檢測(cè)

分別將定性出來的脂肪酸甲酯的峰面積與標(biāo)樣的峰面積比較，單點(diǎn)法定量，其結(jié)果見表1。

2.3 結(jié)果與分析

由于啤酒的基質(zhì)比較復(fù)雜，方法的準(zhǔn)確性可以通過考察回收率和精密度等來完成。

圖1 啤酒樣品1的總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the beer sample 1

表1 不同啤酒樣品游離脂肪酸含量Table 1 The content of free fatty acids in beer samples

2.3.1 方法的回收率和精密度

為了評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，首先測(cè)試啤酒樣品中天然存在的各種脂肪酸的濃度，然后添加一定加標(biāo)水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸），按試驗(yàn)方法處理后進(jìn)行測(cè)試，然后測(cè)試加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸濃度，進(jìn)而得到其回收率，同時(shí)進(jìn)行6個(gè)平行樣品測(cè)試，計(jì)算該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。

從表2可以看出，各脂肪酸在不同的加標(biāo)濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.8%，試驗(yàn)精密度較高，說明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定啤酒中的游離脂肪酸含量。

表2 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery and precision

2.3.2 提取溶劑的選擇

中鏈飽和脂肪酸（如辛酸和月桂酸）中極性基團(tuán)部分相對(duì)較小，非極性脂肪鏈部分使之更像非極性化合物，因此，非極性溶劑正己烷也非常適合提取飽和中鏈和斷鏈脂肪酸，需要通過使用不同比例的正己烷-乙醚來確定最佳提取溶劑。

首先測(cè)試啤酒樣品中天然存在的各種脂肪酸的濃度，然后添加一定數(shù)量的各種脂肪酸（2.0 mg），選擇不同溶劑按試驗(yàn)方法提取后進(jìn)行測(cè)試，得到加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸濃度，進(jìn)而得到其回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑各種脂肪酸回收率Fig.2 Recovery of fatty acids using different solvents

由圖2可以看出，采用正己烷-乙醚（50∶50，體積比）作為提取溶劑時(shí)各種脂肪酸的回收率最高（辛酸82.1%，癸酸84.2%，月桂酸88.4%，棕櫚酸89.8%，油酸93.5%）。其中中短鏈脂肪酸的回收率偏低，特別是辛酸，這可能由于辛酸的碳數(shù)相對(duì)比較少，相對(duì)極性偏大，使辛酸更容易留在水相而不容易被萃取出來。

3 結(jié)論

本文提出用固相萃取法提取、氣相色譜/質(zhì)譜法進(jìn)行定性分析并外標(biāo)法定量檢測(cè)啤酒中脂肪酸含量的方法，可以克服啤酒中游離脂肪酸含量極少，采取常規(guī)的提取方法難以滿足檢測(cè)要求的問題。通過對(duì)方法回收率和精密度的考察，結(jié)果表明各脂肪酸在不同的加標(biāo)濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.8%，試驗(yàn)精密度較高。比較不同比例提取溶劑對(duì)各種脂肪酸回收率的研究，發(fā)現(xiàn)采用正己烷-乙醚（體積比50∶50）作為提取溶劑時(shí)提取效率相對(duì)最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕櫚酸89.8%、油酸93.5%），說明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定啤酒中的游離脂肪酸含量。該方法具有萃取時(shí)間短，減少了有毒溶劑的使用，且萃取結(jié)果不受乳化效果的影響等優(yōu)點(diǎn)，并提供了自動(dòng)化的可能性，是啤酒中游離脂肪酸分析的理想方法。

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Determination of Free Fatty Acids in Beer by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHOU Yi-bo，ZHU Zhi-xin*，LIANG Yong-wei，HUANG Ying-Hui
（Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology，China National Analytical Center（Guangzhou），Guangzhou 510070，Guangdong，China）

The content of free fatty acids in beer has important influence to its flavor.The free fatty acids in beer sample were extracted using solid phase extraction method，and then they were esterified and analyzed by GCMS.The recovery was conducted by adding a certain amount of fatty acid（caprylic acid，capric acid，lauric acid，palmic acid and oleic acid），and the result illustrated that relative high recovery can be obtained（78.1%-93.5%）with the relative sandard deviation（RSD）were 2.2%-3.8%.The results showed that the extraction efficiency was the highest when n-hexane-ethyl ether（50 ∶50 Volume ratio）was selected as the extractive solvent.This method has the advantage of fast operation，reliable，low solvent consumption and high recovery，and it can meet the requirements of the analysis of free fatty acids in beer.

gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；recovery；beer；free fatty acids

2017-05-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.031

周漪波（1981—），男（漢），助理研究員，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

*通信作者：朱志鑫（1977—），男，高級(jí)工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。