王定美，王偉，麥力文，楊霞，李勤奮

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南?？?71101）

HPLC法同時測定不同采收期木薯葉中6種類黃酮的含量

王定美，王偉，麥力文，楊霞，李勤奮*

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南?？?71101）

建立同時測定木薯葉中6種類黃酮的高效液相色譜（high performance liquid chromatography）法，測定不同采收期下木薯葉中類黃酮含量，探討木薯葉作為黃酮資源利用的最佳采收期。色譜柱為CNW Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-乙酸-水，梯度洗脫，流速為 1 mL/min，柱溫室溫，進樣量5 μL，檢測波長兒茶素與二氫黃酮甙為281 nm，蘆丁與山奈酚為360 nm，槲皮素367 nm、穗花杉雙黃酮338 nm。兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素、山奈酚、穗花杉雙黃酮的濃度分別為 1.5 mg/L～194.6 mg/L（R2=0.999 9）、7.8 mg/L～992.6 mg/L（R2=1.000 0）、0.7 mg/L～84 mg/L（R2=0.999 9）、0.7 mg/L～93.8 mg/L（R2=0.999 9）、0.8 mg/L～108 mg/L（R2=0.995 8）、0.5 mg/L～67.2 mg/L（R2=0.999 5）時與各自峰面積線性關系良好，回收率95.50%～100.01%，相對標準偏差（RSD）小于3%。該法適用于木薯葉中以上6種類黃酮成分的精確定量。檢測結果表明，不同品種、不同采收期的木薯葉中類黃酮的組成和含量差異較大，蘆丁與穗花杉雙黃酮為主要類黃酮。兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素含量最高采收期為種植后180 d，穗花杉雙黃酮為種植后120 d，山奈酚因品種而異。

高效液相色譜；木薯葉；類黃酮；采收期

木薯葉是木薯大規(guī)模種植與加工利用產(chǎn)生的、還沒有得到充分利用的重要副產(chǎn)物之一。隨著木薯種植面積不斷擴大，如何有效利用越來越多的木薯副產(chǎn)物是急需解決的問題。實踐表明，食用木薯葉可提高抗病能力，減少患癌癥及糖尿病、高血壓等疾病的幾率[1-2]；木薯葉提取物可提高魚類的糖代謝、脂肪代謝、免疫能力、促進魚類生長[3-4]。這可能與木薯葉中含有豐富的黃酮類化合物有關。李兵等[5]研究表明，木薯葉黃酮對金黃色葡萄球菌有較高的抑菌作用。Hai-Teng Tao等[6]研究發(fā)現(xiàn)木薯葉黃酮提取物具有肝保健的功效。Kubo等[7]發(fā)現(xiàn)，巴西木薯葉含槲皮素840 mg/kg、山奈酚840 mg/kg、蘆丁4 620 mg/kg，并且這3種化合物的抗氧化性效果顯著。李姍姍等[8]首次從該木薯中分離得到具多種生物功能的穗花杉雙黃酮。何翠薇等[9]研究確定木薯莖葉含有二氫黃酮類化合物。Tanaka Y等[10]發(fā)現(xiàn)，木薯在采收之后會產(chǎn)生大量的兒茶素等次生代謝產(chǎn)物。因此，開發(fā)利用木薯葉黃酮，有利于提高木薯葉資源化利用水平，實現(xiàn)變廢為寶，延長木薯產(chǎn)業(yè)鏈。

木薯葉類黃酮成分含量的精確定量是開發(fā)利用木薯葉黃酮的必要條件。但許多類黃酮化學結構和性質(zhì)相似，難以分離。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HLPC）由于其靈敏度高、選擇性強、色譜柱的選擇范圍寬、樣品預處理簡單和譜圖簡單等使其成為檢測類黃酮化合物最常用的方法之一[11]。至今關于木薯葉類黃酮成分含量測定的文獻報道，國內(nèi)僅見于何翠薇[12]對蘆丁的測定，對于木薯葉中多種類黃酮成分的同時測定及成分含量隨采收期的動態(tài)規(guī)律更是未見報道。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法，建立同時測定木薯葉中兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素、山奈酚、穗花杉雙黃酮6種類黃酮成分含量的方法，并據(jù)此監(jiān)測該6種成分隨生長期的動態(tài)，為確定木薯葉作為黃酮資源利用的最佳采收期，有效利用這一木薯副產(chǎn)物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

以木薯品種華南9號（SC09）和華南205號（SC205）嫩莖葉為材料，于2015年6月采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所儋州試驗基地。經(jīng)60℃烘干至恒重后粉碎至粒徑0.3 mm，保存待用。

1.1.2 試劑

標準品兒茶素（catechin，含量97.2%，批號：110877-201203）、蘆?。╮utin，含量≥98.1%，批號：1022799）、二氫黃酮甙（hesperidin，含量95.3%，批號：110721-201316）、槲皮素（quercetin，含量≥96.5%，批號：100081-200907）、穗花杉雙黃酮（amentoflavone，含量≥90.2%，批號：111902-201102）：購自中國食品藥品檢定研究院；山奈酚（kaempferol，含量≥98.0%，編號：K107144）：購自阿拉丁公司；甲醇、乙腈為色譜純；超純水，其它試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

Ultimate 3000液相色譜儀：美國戴安；METTLER TOLEDO AL204電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多；UV2600紫外可見分光光度計：日本島津。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

稱取1g（精確至0.0001g）木薯葉粉，置于50mL離心管中，加入40mL濃度為50%乙醇水溶液，搖動使充分混合，超聲輔助提取0.5 h（功率80 W），在3 000 r/min離心5 min，取上清液于250 mL圓底燒瓶中；殘渣同樣超聲離心，合并兩次上清液于圓底燒瓶中。

45℃、120 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液至膏狀，用60%乙醇清洗至50 mL離心管中，配平后8000r/min離心10 min后，用2倍～3倍體積的石油醚萃取3遍，合并乙醇層于圓底燒瓶中，45℃、120 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，用甲醇清洗膏狀物至25 mL容量瓶中，定容貯存在-20℃下作為液相分析備用液。測定樣品前取備用液，用甲醇稀釋至合適倍數(shù)并過0.22 μm濾膜。

1.2.2 色譜條件

色譜柱 CNW Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A：乙腈，B：2.5%乙酸水溶液，采用梯度洗脫。流動相A的比例為：0～30 min，15%～70%；30 min～32 min，70%～100% ；32 min～34 min，100%；34 min～36 min，100%～15%；36 min～45 min，15%。流速1.0 mL/min，柱溫室溫，進樣體積5 μL。檢測波長為：兒茶素、二氫黃酮甙281 nm，蘆丁、山奈酚360 nm，槲皮素367 nm，穗花杉雙黃酮338 nm。

1.2.3 類黃酮標準溶液的配制

準確稱取兒茶素9.7 mg、蘆丁49.6 mg、二氫黃酮甙4.2 mg、槲皮素4.7 mg、山奈酚5.4 mg，穗花杉雙黃酮3.4 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容至刻度，作為標準品儲備液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 線性關系考察

精密吸取混合標準品儲備液，用甲醇按倍數(shù)2、4、8、16、32逐級稀釋并定容配制5個標液。按1.2.2色譜條件，取各濃度標準品溶液分別進樣5 μL，以峰面積為橫坐標（X），質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線的線性回歸方程及相關系數(shù)（R2）。

1.2.5 精密度試驗

精密吸取類黃酮混合標準品溶液，按1.2.2的色譜條件進樣5 μL，連續(xù)進樣6次，測定各自的峰面積，根據(jù)測定結果計算相對標準偏差RSD。

1.2.6 重復性試驗

精密稱取同一批次木薯葉干樣品5份，按1.2.1的方法平行制備5份樣品溶液，按1.2.2色譜條件進樣5 μL，記錄峰面積，并計算各類黃酮的含量及RSD值。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一份木薯葉干樣品，按1.2.1的方法制備樣品溶液，按 1.2.2 色譜條件，分別于 0、6、12、18、24 h進樣5 μL，測定樣品中6種類黃酮的含量，計算RSD值。

1.2.8 回收率試驗

精密稱取同一批次已知該6種黃酮成分含量的木薯葉干樣品5份，同時分別定量加入類黃酮標準溶液，按1.2.1的方法平行制備5份樣品溶液，按1.2.2的色譜條件進樣5 μL，根據(jù)測定結果中6種黃酮成分的含量計算相應的平均回收率及RSD值。

2 結果

2.1 HPLC定量分析方法的建立

2.1.1 檢測波長的選擇

相對吸收度/%=某波長下的吸光度/掃描波長范圍中的最大吸光度×100

對6種類黃酮標準樣品進行最大吸收光譜掃描，得到不同類黃酮成分的最大吸收光譜圖見圖1。

圖1 6種類黃酮成分標準樣品吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrogram of 6 flavonoids standards

如圖1所示，各組分在200 nm～210 nm均有最大吸收峰，其中二氫黃酮甙、兒茶素在281 nm有最大吸收峰，穗花杉雙黃酮最大吸收峰出現(xiàn)在270、338 nm，槲皮素 260、367 nm、蘆丁 260、360 nm，山奈酚 261、360 nm。綜合考慮可分4個波長進行檢測：兒茶素與二氫黃酮甙為281nm、穗花杉雙黃酮338nm、蘆丁與山奈酚360nm、槲皮素367 nm。

2.1.2 流動相的選擇

試驗參考前人研究結果[13]，比較研究了甲醇、乙腈與不同濃度的酸（甲酸、乙酸、磷酸）作為流動相，對類黃酮混合標準品以及木薯葉提取液中各種類黃酮色譜峰的分離效果，其中以乙腈（A）-2.5%乙酸水溶液（B）分離效果較好。根據(jù)大梯度洗脫液相掃描結果，摸索了不同的梯度洗脫，最后確定洗脫程序為：0～30 min，15%～70%A；30 min～32 min，70%～100%A；32 min～34 min，100%A；34 min～36 min，100%～15%A；36 min～45 min，15%A。試驗結果表明，采用上述梯度洗脫程序條件，色譜峰之間能夠達到完全分離，并且峰形尖銳，對稱性好，可滿足多種類黃酮的同時分離。

2.1.3 流動相流速的選擇

試驗比較了流動相流速在0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min下類黃酮混合標準品以及木薯葉提取液中各種類黃酮色譜峰的分離情況見圖2。

由圖2可知，流速為1.0 mL/min時，分離程度最好。

圖2 6種類黃酮標準品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 6 flavonoids standards

2.1.4 檢測進樣量的選擇

試驗比較了在流動相流速1.0 mL/min下，在進樣體積5、10、15 μL類黃酮混合標準品以及木薯葉提取液中各種類黃酮色譜峰的分離情況見圖3。

由圖3可知，進樣體積5 μL時，峰形最好。

2.2 HPLC定量分析的方法學考察

2.2.1 線性關系考察

線性關系考察結果見表1。

圖3 木薯葉樣品中6種類黃酮液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 6 flavonoids in cassava leave samples

表1 類黃酮標準曲線的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear range of the flavonoids

兒茶素、蘆丁等6種黃酮成分標準品質(zhì)量濃度和相應峰面積呈良好線性關系。兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素、山奈酚、穗花杉雙黃酮的線性范圍分別為：1.5 mg/L～194.6 mg/L、7.8 mg/L～992.6 mg/L、0.7 mg/L～84 mg/L、0.7 mg/L～93.8 mg/L、0.8 mg/L～108 mg/L、0.5 mg/L～67.2 mg/L。

2.2.2 精密度試驗

6種類黃酮精密度試驗結果見表2。

兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素、山奈酚、穗花杉雙黃酮對應的RSD值分別為0.75%、0.56%、0.84%、0.55%、0.57%、0.59%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗

重復性試驗結果見表3。

表2 6種類黃酮精密度試驗結果Table 2 Accuracy tests for 6 flavonoids（n=6）

表3 6種類黃酮重復性試驗結果Table 3 Repeatability tests for 6 flavonoids（n=5）

6種類黃酮含量的RSD值均小于3%，表明該測定方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗見表4。

表4 6種類黃酮穩(wěn)定性試驗結果Table 4 Stability tests for 6 flavonoids

當樣品放置18 h時，槲皮素含量的RSD值為5.37%，大于3%外，其他成分含量的RSD值均小于3%，說明該樣品溶液室溫放置18 h時穩(wěn)定性降低，放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 回收率試驗

回收率試驗見表5。

表5 6種類黃酮回收率試驗結果Table 5 Recovery tests for 6 flavonoids（n=5）

6種黃酮成分含量的回收率范圍95.50%～100.01%，均在允許限以內(nèi)。

2.3 不同采收期下木薯葉類黃酮含量

不同采收期下木薯葉類黃酮含量見表6。

由表6可知，隨采收期延長，各類黃酮成分含量變化規(guī)律不盡一致。6種類黃酮中，兒茶素、蘆丁、二氫黃酮甙、槲皮素均于180 d采收期時含量達到最高，分別是 474.48、4 397.84、83.26、14.70 mg/kg（品種 SC09）和171.18、3 989.45、81.59、24.74 mg/kg（品種 SC205）；山奈酚含量最高的采收期則分別在種植后210 d（SC09，32.05 mg/kg）和 180 d（SC205，56.42 mg/kg）；穗花杉雙黃酮含量最大時的采收期為種植后120 d，其最大含量值分別為642.09 mg/kg（SC09）和883.02 mg/kg（SC205）。SC09中山奈酚含量隨葉片成熟度逐漸增大，直至達到210 d的最大值。6種類黃酮總含量隨采收期發(fā)生變化，分別為 2 251 mg/kg～5 556 mg/kg（SC09）和1 153 mg/kg～4 943 mg/kg（SC205），變化范圍受品種影響大，并均在種植后180 d采收期達到最大值。綜上，以單一類黃酮成分含量最高為最優(yōu)的最佳木薯葉采收期因木薯品種而有所差別；為達到以上6種成分總含量最大，木薯葉采收期可為種植后180 d。

表6 不同采收期下木薯葉中6種類黃酮的含量Table 6 Content of 6 flavonoids in cassava leaves from different harvest times

同一采收期下6種類黃酮成分的含量，SC09與SC205木薯葉中均以蘆丁含量最高，隨采收期含量范圍分別為 1 590.08 mg/kg～4 397.84 mg/kg（SC09）、755.04mg/kg～3 989.45 mg/kg（SC205）。其次為穗花杉雙黃酮，其含量范圍分別為125.61 mg/kg～642.09 mg/kg（SC09）、243.69 mg/kg～883.02 mg/kg（SC205）。兒茶素、二氫黃酮甙、山奈酚、槲皮素含量隨采收期變化規(guī)律因木薯品種而異，變化范圍分別為SC09：116.60 mg/kg～474.48 mg/kg、5.47 mg/kg ～83.26 mg/kg、17.20 mg/kg ～32.05 mg/kg、0.55 mg/kg～14.70 mg/kg；SC205：12.31 mg/kg～171.18 mg/kg、0.93 mg/kg～81.59mg/kg、17.13 mg/kg～56.42 mg/kg、0.56 mg/kg～24.74mg/kg。SC09與 SC205木薯葉在種植后不超過180 d采收，槲皮素含量均為相同采收期下最?。⊿C09：0.55 mg/kg～14.70 mg/kg；SC205：0.56 mg/kg～24.74 mg/kg），種植 210 d 時采收，二氫黃酮甙含量最?。⊿C09：5.47 mg/kg；SC205：0.93 mg/kg）。由上分析，在本研究采收期（種植后90 d～210 d）下，蘆丁在6種類黃酮中相對含量最高，其次為穗花杉雙黃酮，兩者占比合計分別為 SC09：86.0%～93.8%、SC205：90.1%～97.9%，為其他4種類黃酮成分含量總和的6倍以上，為木薯葉黃酮中的主要成分。

3 結論與討論

3.1 結論

本試驗建立的高效液相色譜分析方法可使木薯葉中6種類黃酮成分得到較好分離。經(jīng)方法學驗證，各成分的線性關系良好，回收率準確度較高，是一種檢測木薯葉黃酮組成及含量的有效方法。

對木薯品種SC09與SC205不同采收期嫩莖葉中6種類黃酮成分檢測表明，蘆丁與穗花杉雙黃酮為葉黃酮主要成分，其相對含量之和為其他4種類黃酮成分含量總和的6倍以上。種植后180 d采收，木薯葉中兒茶素、蘆丁、橙皮苷、槲皮素的含量最高，穗花杉雙黃酮含量最大的采收時間為種植后120 d，山奈酚最大含量采收期因品種而異。6種成分總含量最大的采收期為種植后180 d。

3.2 討論

目前制備木薯葉黃酮提取液方法主要為乙醇水索氏提取或超聲輔助提取。陸海騰[14]在乙醇濃度50%、提取溫度70℃、液料比40∶1（mL/g），提取時間2 h條件下測定木薯葉總黃酮含量為2.836%；李冰[5]在液料比25∶1（mL/g），乙醇體積分數(shù)60%，提取時間100 min條件下測定木薯葉中總黃酮含量為2.523%；本文則采用95%乙醇對SC09與SC205嫩莖葉進行超聲提取，但木薯葉類黃酮成分復雜，木薯葉類黃酮測定過程中受提取效率影響明顯，影響了不同研究之間測定結果的可比性。因此，研究木薯葉黃酮提取預處理方式對成分的影響，探討標準化處理條件，有利于完善木薯葉類黃酮測定規(guī)范。在本研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)在試驗采用的液相條件下還存在除6種成分之外的色譜峰（如圖3（a）中峰2左邊吸收峰），這些成分還有待于進一步分析與鑒定。

據(jù)報道，巴西木薯葉中槲皮素、山奈酚、蘆丁含量分別為 840、840、4 620 mg/kg[7]，廣西桂北木薯葉中蘆丁平均含量為9320mg/kg[12]。本文所測海南產(chǎn)木薯SC09與SC205葉片中類黃酮含量范圍為：槲皮素0.55 mg/kg～1.47 mg/kg （SC09） 和 0.56 mg/kg～2.47 mg/kg（SC205）；山奈酚：17.20 mg/kg～32.05 mg/kg（SC09）和17.13 mg/kg～56.42 mg/kg（SC205）；蘆丁：1 651 mg/kg～4 398 mg/kg（SC09）、和 821 mg/kg～3 989 mg/kg（SC205）。進一步表明了，木薯葉片類黃酮含量隨采收期及品種而存在差別。

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Simultaneous Determination of 6 Flavonoids in Cassava Leaves from Different Harvest Time by HPLC

WANG Ding-mei，WANG Wei，MAI Li-wen，YANG Xia，LI Qin-fen*
（Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，Hainan，China）

A high performance liquid chromatography （HPLC）method for the determination of six kinds of flavonoids was established and employed to the analysis of flavonoids in cassava leaves havested at different time.The chromatographic separation was performed on a CNW Athena C18-WP column kept at room temperature and acetonitrile/acetonitrile acid/water mixture were used as the mobile phase with a flow rate of 1 mL/min through gradient elution.The injection volume of the sample was 5 μL.The detection wavelengths were setat281nmforcatechinandhesperidin，338nmforamentoflavone，360nmforrutinandkaempferoland367nm for quercetin.The linear ranges of catechin，rutin，hesperidin，quercetin，kaempferol and amentoflavone were 1.5 mg/L-194.6 mg/L（R2=0.999 9），7.8 mg/L-992.6 mg/L（R2=1.000 0），0.7 mg/L-84 mg/L（R2=0.999 9），0.7 mg/L-93.8 mg/L（R2=0.999 9），0.8 mg/L-108 mg/L（R2=0.995 8），0.5 mg/L-67.2 mg/L（R2=0.999 5），respectively.This method was precise and accurate（RSD ＜3%）and the average recoveries ranged from 95.50%to 100.01%，suitable for the precise quantification of the six flavoinds in cassava leaves.The results indicated that rutin and amentoflavone were the major components with the total amounts over 6 times of other 4 flavoinds.The optimal harvest time to obtain the highest amouts for catechin，rutin，hesperidin，and quercetin was 180 d after planting，120 d for amentoflavone，and it depend on cassava varieties for kaempferol.

high performance liquid chromatography（HLPC）；flavonoids；cassava leaves；harvest time

2016-11-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.027

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（NO.2015hzs1J021、NO.2016hzs1J041）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院院級重點平臺-生態(tài)農(nóng)業(yè)中心條件改善項目

王定美（1986—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：廢棄物資源化利用。

*通信作者：李勤奮（1974—），女，研究員，博士，研究方向：生態(tài)農(nóng)業(yè)、產(chǎn)地環(huán)境風險評價。