鞠璐寧，黃妍，吳航，曹星

（閩北職業(yè)技術學院，福建南平353011）

不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋特性的比較

鞠璐寧，黃妍，吳航，曹星

（閩北職業(yè)技術學院，福建南平353011）

為遴選蜂蜜醋發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，了解不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜的特性，在液態(tài)發(fā)酵法制備蜂蜜醋時，研究酒精度、接種量和pH值對產(chǎn)酸量的影響。通過單因素和正交試驗，得出最佳工藝參數(shù)為：許氏醋酸桿菌為酒精度6%VOL、接種量15%、pH 6.0，巴氏醋酸桿菌為酒精度4%VOL、接種量10%、pH 5.0，巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）為酒精度6%VOL、接種量10%、pH 6.0，惡臭醋酸桿菌為酒精度6%VOL、接種量10%、pH 6.0，混變種ASl.41醋酸菌為酒精度6%VOL、接種量15%、pH 5.0。

蜂蜜醋；醋酸菌；比較

果醋飲料是以果蔬為主要原料進行二次發(fā)酵制成的新型飲料，被譽為“第六代黃金飲品”[1]。我國的果醋飲料產(chǎn)品主要有兩種，一種是單一果醋，如由蘋果[2]、葡萄[3]、椰棗[4]、山楂[5]、西瓜[6]、葛根[7]、豆薯[8]、懷山藥[9]等單一果蔬發(fā)酵的產(chǎn)品，另一種是混合汁，即以混合果汁發(fā)酵而成，如雪蓮果、西番蓮[10]，蘋果、葡萄和梨汁等混合發(fā)酵的產(chǎn)品[11]。

蜂蜜醋是以蜂蜜為原料，經(jīng)發(fā)酵制備成的醋，是醋酸飲料的一種，具有香味獨特、口感醇和、保留蜂蜜的活性成分、香味和營養(yǎng)價值的同時富含有醇、醋、酯、有機酸、氨基酸、維生素等活性物質(zhì)[12-14]。采用液態(tài)發(fā)酵法進行[15]，經(jīng)酵母菌酒精發(fā)酵，醋酸菌醋酸發(fā)酵制成。果醋的發(fā)酵菌種是決定果醋飲料品質(zhì)的關鍵因素之一，國外常用醋酸菌種為奧爾蘭醋酸桿菌（Aceto－bacter orleanense）、許氏醋酸桿菌（Acetobacter schutzenbachii），國內(nèi)常用醋酸菌種為惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）（Acetobacter pasteurianussubsp.pasteurianus）、混變種 ASl.41 醋酸菌（Acetobacterrancensvar.tubidans）。然而，以往研究多集中在工藝研究和原料適宜性方面[16-17]，且采用單一醋酸菌種或多菌種共生發(fā)酵[18]制備。本文通過比較許氏醋酸桿菌、巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌等5種菌株在不同酒精度、接種量、pH值等實驗條件下所制備蜂蜜醋的產(chǎn)酸、產(chǎn)酯等方面的特性，以期選擇制備蜂蜜醋適宜的發(fā)酵條件及醋酸菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

椴樹蜂蜜、棗花蜂蜜、龍眼蜂蜜：福建省神蜂科技開發(fā)有限公司；安琪葡黃酒高活性干酵母：市售；許氏醋酸桿菌、巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）：上海迪發(fā)釀造生物有限公司；惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌：通派（上海）生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉等均為生物試劑：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、檸檬酸、磷酸二氫鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸銨等均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器設備

85-2恒溫磁力攪拌器：上海江星儀器有限公司；數(shù)顯式酸度計：上海精宏實驗設備有限公司；BX5200L HP超聲波清洗器：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HH4-電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；1000W電子調(diào)溫電爐：江陰市保利科研器材有限公司；BT125 D電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；WTY型手持糖量計：泉州化學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

酵母菌的活化[19]：取安琪葡萄酒高活性干酵母接入含糖量2%蜂蜜溶液中，置于30℃恒溫培養(yǎng)18 h。

醋酸菌的活化：分別將許氏醋酸桿菌、巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌5種醋酸菌接入酒精度為4%VOL蜂蜜酒中，加入硫酸銨0.1 g/L，磷酸銨0.5 g/L，檸檬酸鉀0.1 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，在30℃，200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)18 h。

1.2.2 蜂蜜的稀釋及滅菌

據(jù)李若彤[20]研究，椴樹蜂蜜溶液（質(zhì)量比為31%）、棗花蜂蜜（49%）、龍眼蜂蜜（15%）在體積比為4∶4∶2下所制蜂蜜醋感官評價最佳。故采用該配比制備混合蜂蜜溶液，并用蒸餾水稀釋，調(diào)整最終蜂蜜液含糖量至15%，于80℃水浴中滅菌15 min。

1.2.3 調(diào)pH值

發(fā)酵前調(diào)整蜂蜜的pH值至5.0，加入適量的磷酸銨滿足酵母菌所需的氮源。

1.2.4 蜂蜜酒發(fā)酵

將活化后的混合酵母菌，接種于含糖量15%，pH 5.0的滅菌蜂蜜稀釋液中，接種量1.5%，30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵待蜂蜜液中不再產(chǎn)生氣泡停止發(fā)酵，測定含糖量、酒精含量、酯含量。

1.2.5 不同醋酸菌蜂蜜醋發(fā)酵特性比較

本試驗主要比較了顯著影響醋酸菌生長的酒精度、接種量、pH值3個因素。

1.2.5.1 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜酒精度比較

蜂蜜酒酒精度調(diào)整為 2%VOL、4%VOL、6%VOL、8%VOL，分別接種10%的許氏醋酸桿菌活化液至蜂蜜酒溶液中，pH值為6.0，搖床溫度32℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測定產(chǎn)酸量。

巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌發(fā)酵方法同上。

1.2.5.2 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜接種量比較

蜂蜜酒液pH值調(diào)至6.0，酒精度調(diào)至4%VOL，搖床溫度32℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，分別將5%、10%、15%、20%的許氏醋酸桿菌進行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測定產(chǎn)酸量。

巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌發(fā)酵方法同上。

1.2.5.3 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜pH值比較

將蜂蜜酒液酒精度調(diào)整為4%VOL，pH值調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0，許氏醋酸桿菌接種量為 10%，搖床溫度為32℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下進行蜂蜜醋發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測定產(chǎn)酸量。

巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌發(fā)酵方法同上。

1.2.5.4 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜酒精度、接種量、pH值正交試驗

在單因素試驗的基礎上，確定醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋的主要影響因素。正交試驗因素水平的設計見表1，以發(fā)酵后的產(chǎn)酸量為指標，在搖床溫度為32℃，轉(zhuǎn)速180 r/min條件下進行L9（34）正交試驗。

表1 正交試驗設計表Table 1 Design of orthogonal test

1.2.6 分析測定方法

酒精度：GB/T394.2-2008《酒精通用分析方法》[21]；pH值：pH計法；總糖度：手持糖量儀測定；醋酸含量：酸堿滴定法[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜酒發(fā)酵結(jié)果

蜂蜜酒發(fā)酵過程中酒體的優(yōu)劣與酵母菌種類、接種量、發(fā)酵溫度及蜂蜜品種等有直接關系。發(fā)酵溫度過高會影響蜂蜜酒的口感和香氣成分，溫度過低則發(fā)酵時間較長。蜂蜜因蜜源植物不同含糖量和香氣成分亦不同，品質(zhì)較好的蜂蜜含糖量適中，香味撲鼻，深加工成蜜酒不僅含有原蜂蜜的香味也產(chǎn)生新的芳香成分。蜂蜜酒發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇?、酒精度、揮發(fā)酯、感官評價結(jié)果如表2。

表2 蜂蜜酒殘?zhí)恰⒕凭?、揮發(fā)酯含量Table 2 The content of residual sugar，alcohol and volatile ester of honey wine

從表2可以看出，葡萄酒高活性干酵母發(fā)酵的蜂蜜酒，發(fā)酵充分從殘?zhí)恰⒕凭?、揮發(fā)酯、口感都比較好，說明葡萄酒高活性干酵母適合蜂蜜酒的釀制與文獻報道[23]相符合。

2.2 不同醋酸菌蜂蜜醋發(fā)酵特性的比較

發(fā)酵蜂蜜醋的優(yōu)劣與蜂蜜醋酒精度、接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度及蜂蜜品種等因素關系密切，通過單因素和正交試驗比較酒精度、接種量和初始pH值對發(fā)酵蜂蜜醋的影響，比較不同品種醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋的特性。

2.2.1 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜酒精度比較

醋酸菌的主要特征是氧化酒精生成醋酸。醋酸菌對酒精適應環(huán)境及耐受力不一樣，酒精度低醋酸菌不能充分生長，酒精度過高反而會抑制醋酸菌生長和產(chǎn)酸，酒精轉(zhuǎn)化率都會降低。試驗中以酒精度為變量，保持其他發(fā)酵因素恒定，以產(chǎn)酸量為指標。分別比較了5種醋酸菌的產(chǎn)酸狀況，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在2%VOL至8%VOL酒精度范圍內(nèi)，產(chǎn)酸量是先升高后下降，許氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌在酒精度為6%VOL時產(chǎn)酸量達到最大值，巴氏醋酸桿菌在酒精度為4%VOL時產(chǎn)酸量達到最大值。

2.2.2 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜接種量比較

醋酸菌醋酸發(fā)酵過程中接種量是影響發(fā)酵成功與否的另一關鍵因素。醋酸菌的接種量過少則不能立即形成生長優(yōu)勢，易污染雜菌使菌生長環(huán)境變差；接種量過多，就會使得發(fā)酵過程加快，醋酸菌大量繁殖后迅速衰退，發(fā)酵不充分新生成物質(zhì)少，醋酸風味得不到豐富。試驗中以接種量為變量，在酒精度為4%VOL，pH值為6時，保持其他發(fā)酵因素恒定，以產(chǎn)酸量為指標。分別比較了5種醋酸菌的產(chǎn)酸狀況，結(jié)果如圖2所示。

圖1 不同酒精度醋酸菌產(chǎn)酸量Fig.1 Producing vinegar amount when different alcohol percentage

圖2 不同菌種接種量醋酸菌產(chǎn)酸量Fig.2 Various strains producing acid when inoculation amount

由圖2可知，在5%至20%接種范圍內(nèi)，產(chǎn)酸量是先升高后下降，巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌在接種量為10%時產(chǎn)酸量最大。許氏醋酸桿菌和混變種ASl.41醋酸菌在15%時產(chǎn)酸量最大。

2.2.3 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜pH值比較

醋酸菌在醋酸發(fā)酵過程中不僅與酒精度、接種量有關，還與發(fā)酵液的pH值有關且直接影響醋酸菌的生長和產(chǎn)酸量。醋酸發(fā)酵初期發(fā)酵液中適量的醋酸既能促進產(chǎn)酸，又能抑制雜菌的生長。因此，適宜pH值有助于促進蜂蜜醋的蜂蜜。試驗中以pH值為變量，保持其他發(fā)酵因素恒定，以產(chǎn)酸量為指標。分別比較了5種醋酸菌的產(chǎn)酸狀況，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，各菌種在pH值從4.0到7.0時產(chǎn)酸量是先升高后下降，巴氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌、混變種ASl.41醋酸菌隨著pH值的增加產(chǎn)酸速度再增加，許氏醋酸桿菌的產(chǎn)酸速度明顯小于前4種醋酸菌；巴氏醋酸桿菌和混變種ASl.41醋酸菌在pH值為5.0時產(chǎn)酸量達最大。許氏醋酸桿菌、巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌在pH值6.0時產(chǎn)酸量達最大。

圖3 不同pH值醋酸菌產(chǎn)酸量Fig.3 Produce acid conditions of different pH value

2.2.4 不同醋酸菌發(fā)酵蜂蜜醋適宜酒精度、接種量、pH值正交試驗比較

通過正交試驗比較酒精度、接種量和pH值對產(chǎn)酸量的影響，根據(jù)表3、表4發(fā)現(xiàn)，各因素影響的主次順序因菌種不同而存在差別，其中，許氏醋酸桿菌和巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）發(fā)酵時，各因素的主次順序為酒精度＞初始pH值＞接種量，與李若彤[20]、周文俊[24]研究結(jié)果一致；其他菌種時，主次順序為酒精度＞接種量＞初始pH值，與馬榮山[17]、張麗珍[19]研究結(jié)果一致，各因素的顯著性均為極顯著水平，所以其影響非常顯著，且方差分析與極差分析結(jié)果一致，可見酒精度對跟菌種的發(fā)酵試驗的影響最大。不同菌種發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)如下，許氏醋酸桿菌為酒精度6%VOL、接種量15%、pH 6.0；巴氏醋酸桿菌為酒精度4%VOL、接種量10%、pH 5.0；巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）為酒精度6%VOL、接種量10%、pH 6.0；惡臭醋酸桿菌為酒精度6%VOL、接種量10%、pH 6.0；混變種ASl.41醋酸菌為酒精度6%VOL、接種量15%、pH5.0。

表3 醋酸發(fā)酵正交結(jié)果表Table 3 Orthogonal results tables of acetic fermentation

表4 醋酸發(fā)酵正交設計方差分析Table 4 Orthogonal design anova table of acetic fermentation

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過單因素和正交試驗，比較了醋酸發(fā)酵中常見的5種醋酸菌在蜂蜜醋發(fā)酵適宜的酒精度、醋酸菌接種量、pH值。結(jié)果表明：巴氏亞種（滬釀1.01醋酸菌）、惡臭醋酸桿菌最佳發(fā)酵條件一致其他醋酸菌最佳發(fā)酵條件存在差別，蜂蜜醋發(fā)酵是通過微生物的生長代謝完成，微生物的生長條件復雜而敏感，更復雜的試驗因素和密集的試驗梯度有待進一步研究。

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Comparison of Honey Vinegar Fermentation with Different Acetic Acid Bacteria

JU Lu-ning，HUANG Yan，WU Hang，CAO Xing
（Min Bei Vocational＆ Technical College，Nanping 353011，F(xiàn)ujian，China）

The purposes of this study was to select the optimum technology conditions of honey vinegar fermentation，and realize honey vinegar fermentation with different acetic acid bacteria.Researching on the production of acid with different alcohol，inoculation and pH value on honey vinegar liquid fermentation.Through the single-factor tests and the orthogonal tests，the optimum conditions were obtained as follows:Acetobacter schutzenbachiialcohol 6%VOL，inoculation amount 15%，pH 6.0；Acetobacter pasteurianusalcohol 4%VOL，inoculation amount 10%，pH 5.0；Acetobacter pasteurianussubsppasteurianus（HuNiang 1.01）alcohol 6%VOL，inoculation amount 10%，pH 6.0；Acetobacter rancensalcohol 6%VOL，inoculation amount 10%,pH 6.0；Acetobacter rancens var.tubidans（ASl.41）alcohol 6%VOL，inoculation amount 15%，pH 5.0.

honey vinegar；acetic acid bacteria；comparison

2017-05-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.020

福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JB14190）

鞠璐寧（1985—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品加工。