張利，黃敏，王婷，潘國棟，余楚純，李立群，葉金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶提取廣陳皮中橙皮苷工藝

張利，黃敏，王婷，潘國棟，余楚純，李立群，葉金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

為優(yōu)化纖維素酶輔助提取廣陳皮中橙皮苷的工藝條件，選定加酶量、pH值、溫度和時(shí)間為主要影響因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了纖維素酶的提取條件。結(jié)果表明，纖維素酶的最佳作用條件為：加酶量0.8%，pH值3.45，溫度59℃，時(shí)間2 h，在此條件下，橙皮苷得率達(dá)到了（4.13±0.06）%，較傳統(tǒng)醇提工藝提高了11.32%。

廣陳皮；纖維素酶；橙皮苷；響應(yīng)面法

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，陳皮藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”[1]?！皬V陳皮”為茶枝柑的干燥成熟果皮，主產(chǎn)于廣東新會(huì)，是廣東十大地道藥材之一。陳皮和廣陳皮的有效成分有揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)（其中以橙皮苷為主），一般通過測(cè)定橙皮苷的含量作為評(píng)價(jià)陳皮的質(zhì)量指標(biāo)。

橙皮苷屬雙氫黃酮糖苷類化合物，是陳皮的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種藥理活性[2]，且作為天然活性物質(zhì)，其無毒副作用，可以用作食品、藥品等的天然添加劑，在食品、醫(yī)藥及日用化工行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。目前，陳皮中橙皮苷提取常用的方法有水提法和有機(jī)溶劑浸提法。然而，陳皮中的橙皮苷幾乎被以纖維素為主構(gòu)成的細(xì)胞壁所包圍，傳統(tǒng)的提取方法無法使細(xì)胞壁破裂，存在巨大的傳質(zhì)阻力，致使提取效果不理想，提取率低，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。而纖維素酶能夠作用于天然和結(jié)晶的纖維素，可將纖維素分解成寡糖或單糖。采用纖維素酶可以破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁疏松、破裂，減小傳質(zhì)阻力，有利于陳皮中橙皮苷的溶出，從而提高橙皮苷的提取率[3-5]。因此，本研究建立纖維素酶輔助提取法，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，以期提高橙皮苷提取率，為進(jìn)一步開發(fā)利用廣陳皮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣陳皮：廣東藥材公司中藥飲片廠；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，批號(hào)110712）：廣州藥品檢驗(yàn)所；纖維素酶（15 000 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-6S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海虞龍儀器設(shè)備有限公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器：江蘇城西曉陽電子儀器廠；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HS6150超聲清洗機(jī)：北京康林科技有限公司；LC-20高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液。然后取儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 mL，分別定容至 10 mL，使橙皮苷濃度分 別 為 0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL 的 溶液，采用高效液相色譜，繪制橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。以橙皮苷濃度（Y）對(duì)峰面積（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程 Y=5.654 36×10-8X+0，R2=0.999 2，表明橙皮苷濃度在0.04 mg/mL～0.40 mg/mL時(shí)與峰面積值的線性關(guān)系良好。

色譜條件：色譜柱為安捷倫公司ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶醋酸 ∶水=35∶4 ∶61；檢測(cè)波長：283 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2 纖維素酶輔助提取工藝

取廣陳皮原料置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 h，粉碎，過80目篩。準(zhǔn)確稱取6.0 g廣陳皮粉末，按一定料液比加入蒸餾水[料液比 1∶10（g/mL）]，調(diào)節(jié)溶液pH值，然后加入纖維素酶在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間。酶解反應(yīng)結(jié)束后，在本課題組醇提結(jié)果的基礎(chǔ)之上，加入乙醇繼續(xù)提取 [提取條件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度65%、溫度83℃、提取時(shí)間2 h]，冷卻，抽濾，洗滌濾渣，合并濾液與洗液，采用高效液相色譜儀分析檢測(cè)提取液中的橙皮苷。根據(jù)橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線得出提取液中橙皮苷的含量，并按下式計(jì)算廣陳皮橙皮苷得率：

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照不同的加酶量、pH值、溫度、時(shí)間進(jìn)行廣陳皮中橙皮苷的纖維素酶法輔助提取，以橙皮苷得率為指標(biāo)，確定最佳酶解條件。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選定加酶量、pH值、溫度、時(shí)間為因素，以橙皮苷得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)確定纖維素酶法輔助提取的最佳條件。并使用Design-Expert 7.0.1.0軟件對(duì)設(shè)計(jì)方案中每次試驗(yàn)獲得的響應(yīng)值進(jìn)行多維非線性回歸分析，求出多元二次方程的系數(shù)，方程擬合的質(zhì)量用回歸系數(shù)R2表示，其統(tǒng)計(jì)顯著性用F-檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加酶量對(duì)橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至4.5，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的纖維素酶在50℃下反應(yīng)2 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后加入乙醇繼續(xù)提?。ㄌ崛l件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度65%、溫度83℃、提取時(shí)間2 h），冷卻，抽濾，測(cè)定提取液中的橙皮苷，考察不同加酶量對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1分析可知，隨著加酶量的增加，橙皮苷得率增加，但當(dāng)加酶量達(dá)到0.8%后，橙皮苷得率隨著加酶量的增加反而下降。這是因?yàn)殛惼ぷ鳛楣腆w底物，不能充分?jǐn)U散到溶液中，導(dǎo)致酶與底物的接觸面積受到限制。在較低的酶濃度下，酶與底物尚可較充分地結(jié)合；隨著酶濃度的升高，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制[6]。因此，對(duì)一定的底物濃度均存在一個(gè)最佳酶用量，試驗(yàn)選擇適宜加酶量為0.8%。

圖1 加酶量對(duì)橙皮苷得率的影響Fig.1 Influence of enzyme amount on the yield of hesperidin

2.2 pH值對(duì)橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，加入 0.8%的纖維素酶在50℃下反應(yīng)2 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測(cè)定提取液中的橙皮苷，考察不同pH值對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對(duì)橙皮苷得率的影響Fig.2 Influence of pH on the yield of hesperidin

由圖2分析可知，當(dāng)溶液pH值小于3.5時(shí)，橙皮苷得率隨著pH值的增大而增大，當(dāng)pH值達(dá)到3.5時(shí)橙皮苷得率達(dá)到最大值，此后橙皮苷得率逐漸下降。這是因?yàn)閜H值影響酶的活性中心或與之有關(guān)的基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶解反應(yīng)有著適宜的pH值，在此pH值條件下酶解催化速率最高。pH值在3.5左右時(shí)正好處于纖維素酶的最佳作用pH值區(qū)間內(nèi)，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，破壞細(xì)胞壁，減小傳質(zhì)阻力，促進(jìn)橙皮苷的溶出[7]。因此，試驗(yàn)選擇適宜pH值為3.5。

2.3 溫度對(duì)橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.5，加入 0.8%的纖維素酶，分別在 45、50、55、60、65、70℃條件下反應(yīng)2 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測(cè)定提取液中的橙皮苷，考察不同溫度對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)橙皮苷得率的影響Fig.3 Influence of temperature on the yield of hesperidin

由圖3分析可知，在溫度低于60℃時(shí)，橙皮苷得率隨著溫度的升高而增大；溫度超過60℃時(shí)，橙皮苷得率逐漸下降。酶解反應(yīng)有著適宜的反應(yīng)溫度，溫度過低，酶活力也較低，不能充分發(fā)揮酶解作用效果；升高溫度增加了包括酶和底物分子在內(nèi)的溶液體系的熱能，既可使胞內(nèi)活性物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度加快，又能提供酶促反應(yīng)所需的能量，使酶解破壁作用加強(qiáng)，提高橙皮苷得率；但溫度升高將使酶部分甚至全部變性，酶解反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致橙皮苷得率下降。因此，試驗(yàn)選擇適宜溫度為60℃。

2.4 時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.5，加入0.8%的纖維素酶，在60℃條件下分別反應(yīng)1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測(cè)定提取液中的橙皮苷，考察不同提取時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響Fig.4 Influence of time on the yield of hesperidin

由圖4分析可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，橙皮苷得率逐漸增大。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，廣陳皮細(xì)胞壁及細(xì)胞間層的纖維素和果膠形成的阻擋層被有效降解，橙皮苷逐漸從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散出來。但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)外的橙皮苷濃度達(dá)到了一種動(dòng)態(tài)平衡，繼續(xù)延長提取時(shí)間對(duì)提高提取液中橙皮苷濃度的作用有限，且酶解反應(yīng)產(chǎn)物濃度的積累也將抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行[8]，此外時(shí)間過長將延長生產(chǎn)周期，增加能耗，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此試驗(yàn)選擇適宜時(shí)間為2 h。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取條件

為了進(jìn)一步優(yōu)化纖維素酶輔助提取條件，以橙皮苷得率為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 7.0.1.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)27個(gè)處理組，其中3個(gè)零水平處理組，試驗(yàn)因素和水平見表1，響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素和水平Table 1 Test factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design of experiments and results

運(yùn)用Design-Expert 7.0.1.0軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到橙皮苷得率（Y）對(duì)加酶量（A）、pH（B）、溫度（C）、時(shí)間（D）的回歸模型為：

Y=4.12-0.022A-0.055B-0.15C+0.12D+0.025AB+0.015AC-0.020AD-0.008BC-0.008BD+0.047CD-0.26A2-0.26B2-0.38C2-0.21D2

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

由方差分析可知，模型的F=54.37，P＜0.000 1，回歸模型達(dá)到極顯著，二次多元回歸模型成立，應(yīng)用此方程可以預(yù)測(cè)橙皮苷得率及優(yōu)化酶解提取工藝。失擬分析表明，失擬項(xiàng)P=0.525 8＞0.05，模型失擬度不顯著，因而該模型擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)橙皮苷提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

回歸方程的擬合程度可通過決定系數(shù)R2和R2校正值R2adj來驗(yàn)證，模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值之間的相關(guān)性達(dá)98.45%，R2adj為0.966 4，表明在橙皮苷提取工藝研究中，該模型能解釋96.64%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好。

一次項(xiàng) C、D 和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2的 P＜0.000 1，表明 C、D 和 A2、B2、C2、D2對(duì)橙皮苷得率的影響是極顯著的；一次項(xiàng)B的P＜0.05，表明B對(duì)橙皮苷得率有顯著影響。而一次項(xiàng) A、交互項(xiàng) AB、AC、AD、BC、BD、CD的P＞0.05，表明其對(duì)橙皮苷得率沒有顯著性影響。在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，各因素對(duì)橙皮苷得率的影響主次順序?yàn)椋簻囟龋緯r(shí)間＞pH值＞加酶量。

運(yùn)用Design-Expert 7.0.1.0軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖5～圖10。

圖5 加酶量和pH值的交互作用Fig.5 Interactions of enzyme amount and pH

圖6 加酶量和溫度的交互作用Fig.6 Interactions of enzyme amount and temperature

圖7 加酶量和時(shí)間的交互作用Fig.7 Interactions of enzyme amount and time

從以上6組圖可以看出，橙皮苷得率隨著各因素的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但時(shí)間的減小趨勢(shì)不明顯，加酶量的變化趨勢(shì)不及pH值、溫度和時(shí)間，加酶量的影響最小。pH值、溫度和時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響均很顯著，這與響應(yīng)面分析結(jié)果一致。

圖8 pH值和溫度的交互作用Fig.8 Interactions of pH and temperature

圖9 pH值和時(shí)間的交互作用Fig.9 Interactions of pH and time

圖10 溫度和時(shí)間的交互作用Fig.10 Interactions of temperature and time

利用Design-Expert 7.0.1.0軟件，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出橙皮苷得率最高時(shí)的最佳工藝條件為：加酶量0.79%、pH3.45、溫度59.07℃、時(shí)間2.13 h。此時(shí)，響應(yīng)面預(yù)測(cè)橙皮苷得率為4.15%。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)情況，可將加酶量0.8%、pH3.45、溫度59℃、時(shí)間2 h作為最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。在橙皮苷得率最高時(shí)對(duì)應(yīng)的最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到廣陳皮中橙皮苷得率為（4.13±0.06）%（n=3），與模型的預(yù)測(cè)值基本一致。此外，采用纖維素酶輔助提取所得橙皮苷得率比傳統(tǒng)的乙醇提取工藝（橙皮苷得率為3.71%）提高了11.32%。

3 結(jié)論

為提高廣陳皮中橙皮苷的提取效率，優(yōu)化纖維素酶酶解工藝條件，以加酶量、pH值、溫度和時(shí)間為主要影響因素，以橙皮苷得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)纖維素酶輔助提取廣陳皮中橙皮苷的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳酶解工藝條件為加酶量0.8%、pH3.45、溫度59℃、時(shí)間2 h，在此條件下測(cè)得橙皮苷得率為（4.13±0.06）%，較傳統(tǒng)醇提工藝提高了11.32%。采用響應(yīng)面法確定的纖維素酶提取工藝合理，該工藝可以用于廣陳皮中橙皮苷的提取。

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Optimization of Extraction Technology of Hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by Cellulose Using Response Surface Methodology

ZHANG Li，HUANG Min，WANG Ting，PAN Guo-dong，YU Chu-chun，LI Li-qun，YE Jin-yu
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

In order to optimize the extraction technology of hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by cellulose.Enzyme amount，pH，temperature and time were selected as the main influencing factors.The extraction condition of hesperidin by cellulose was optimized by response surface methodology on the basis of single factor experiment.The result showed that the optimum extraction technology were enzyme amount of 0.8%，pH of 3.45，temperature of 59 ℃，time of 2 h.Under these conditions，yield of hesperidin reached（4.13±0.06）%，which increased by 11.32%compared with traditional alcohol extraction technology.

Citri Reticulatae Pericarpium；cellulose；hesperidin；response surface methodology

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.012

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金（CXZZ201406251617 34122）

張利（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品、保健食品的研究與開發(fā)。