DO Thanh-Trung李 健張風(fēng)娟楊麗濤,*李楊瑞,2,*邢永秀

1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530005;2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 / 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530007

甘蔗與抗旱性相關(guān)差異蛋白質(zhì)組分析

DO Thanh-Trung1李 健1張風(fēng)娟1楊麗濤1,*李楊瑞1,2,*邢永秀1

1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530005;2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 / 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530007

采用桶栽方式, 對(duì)抗旱性強(qiáng)的F172和抗旱性弱的YL6甘蔗品種在苗期進(jìn)行重度干旱脅迫處理后, 應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)分析, 分別找出差異顯著的28和20個(gè)差異蛋白點(diǎn), 其中部分呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá), 部分呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá), 還有部分新增的蛋白點(diǎn), 因品種抗性不同而表現(xiàn)各異, F172葉片中的差異蛋白主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),而 YL6中大多表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。在重度干旱脅迫下, 抗旱性不同的甘蔗品種蛋白質(zhì)豐度變化有顯著差異。采用MALDI-TOF-TOF/MS鑒定所獲得的差異蛋白, 從YL6、F172中分別鑒定出18、14個(gè)蛋白的氨基酸序列, 對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)根據(jù)功能分為8類。YL6中參與自由基清除的2個(gè), 參與光合作用的6個(gè), 參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的1個(gè), 參與基礎(chǔ)代謝的6個(gè), 參與防衛(wèi)反應(yīng)的2個(gè), 未知功能蛋白1個(gè)。F172中參與自由基清除的1個(gè), 參與光合作用的2個(gè), 參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的2個(gè), 參與基礎(chǔ)代謝的4個(gè), 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的2個(gè), 參與蛋白加工的1個(gè), 未知功能蛋白2個(gè), 其中22 kD干旱誘導(dǎo)蛋白的豐度明顯提高, 而在YL6中則檢測(cè)不到此蛋白。這說(shuō)明在干旱脅迫下抗旱性不同的甘蔗品種在蛋白質(zhì)組成上有很大差異, 推測(cè)這是不同甘蔗品種間抗旱性差異的重要分子基礎(chǔ)。

甘蔗; 水分脅迫; 蛋白質(zhì)組; 差異表達(dá); 抗旱性

甘蔗是世界上也是中國(guó)最重要的糖料作物和能源作物。中國(guó)的蔗糖產(chǎn)量占食糖總產(chǎn)的 90%以上。中國(guó)大陸的 80%以上甘蔗種植在缺乏灌溉條件的旱坡地上, 而干旱是限制甘蔗產(chǎn)量的重要因素[1]。

蛋白質(zhì)組(Proteome)是指基因組表達(dá)產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì), 即細(xì)胞、組織或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式[2]。運(yùn)用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù), 可大量研究逆境脅迫后蛋白質(zhì)組的變化。迄今, 已經(jīng)獲得了大量的差異蛋白并進(jìn)行了功能研究[3-8]。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各種植物中。在缺水條件下, 植物蛋白的含量和種類會(huì)發(fā)生變化, 有的蛋白豐度不變, 有的蛋白豐度增加, 有的蛋白豐度降低, 或者有新的蛋白合成[9-10]。但是,有研究表明, 比起蛋白的增加或新蛋白的出現(xiàn), 干旱更容易引起蛋白含量的減少或丟失[10]。Xiao等[11]研究了不同來(lái)源的 2個(gè)青楊種群受干旱脅迫后的蛋白質(zhì)變化情況, 用質(zhì)譜分析成功鑒定出40個(gè)干旱響應(yīng)蛋白, 這些蛋白的功能涉及到多個(gè)方面, 其中抗氧化酶、HSPs以及次生代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白等對(duì)青楊的抗旱能力起了重要作用。Salekdeh等[9]用干旱處理2個(gè)水稻品種, 經(jīng)雙向電泳分析, 發(fā)現(xiàn)有42個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量在干旱脅迫前后表現(xiàn)出顯著變化, 推測(cè) 2個(gè)品種之間的蛋白差異導(dǎo)致抗旱性顯著差異。孫存華等[12]研究表明, 在中度干旱脅迫時(shí), 藜葉有5個(gè)蛋白點(diǎn)的譜帶明顯加強(qiáng); 在重度干旱脅迫時(shí), 其中的 2個(gè)蛋白點(diǎn)譜帶增強(qiáng), 但弱于中度干旱脅迫時(shí)的譜帶。章玉婷等[13]在干旱與正常處理?xiàng)l件下研究馬鈴薯葉片表達(dá)差異蛋白質(zhì)組, 經(jīng)電泳圖譜分析和質(zhì)譜鑒定獲12個(gè)差異蛋白點(diǎn), 其中有保護(hù)馬鈴薯光合系統(tǒng)以及線粒體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的酶類, 調(diào)節(jié)該植株對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)以及調(diào)控其組織內(nèi) N、C運(yùn)輸系統(tǒng)的功能蛋白, 這些蛋白在受到干旱脅迫時(shí)表達(dá)量均升高, 從而揭示出該類蛋白是馬鈴薯在干旱條件下產(chǎn)生的耐受相關(guān)蛋白。在甘蔗上, Su等[14]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)研究甘蔗與黑穗病互作的蛋白差異表達(dá)譜, 發(fā)現(xiàn)抗病和感病基因型中篩選出的與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)的差異蛋白中, 與差異基因表達(dá)趨勢(shì)相同的均為關(guān)聯(lián)上調(diào)表達(dá), 且其中近半數(shù)以上的關(guān)聯(lián)差異蛋白與植物抗逆性密切相關(guān), 如過(guò)氧化物酶、病程相關(guān)蛋白、葡聚糖酶、熱休克蛋白和植物凝集素等。我們之前的研究發(fā)現(xiàn), 在用 10% PEG-6000進(jìn)行水分脅迫的條件下, 抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種 ROC22中Drought inducible 22 kD protein和ATPase CF1 subunit beta蛋白的相對(duì)豐度高于抗旱性弱的甘蔗品種ROC16, 這 2種蛋白有可能作為不同品種抗旱性標(biāo)志蛋白[4]。

甘蔗抗旱蛋白質(zhì)組研究以及甘蔗品種抗旱性的分子機(jī)制探索, 有望為甘蔗抗旱性鑒定和培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種以及旱地甘蔗栽培技術(shù)研發(fā)提供重要的理論依據(jù), 對(duì)甘蔗的生產(chǎn)實(shí)際具有重要的應(yīng)用意義。本研究擬在對(duì)甘蔗進(jìn)行干旱脅迫處理的基礎(chǔ)上, 開展甘蔗抗旱蛋白質(zhì)組學(xué)研究,以期探索抗旱性不同的甘蔗品種對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制, 進(jìn)而為利用基因工程改良甘蔗品種的抗旱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

根據(jù)韋漢文等[15]和檀小輝等[16]的研究結(jié)果, 選取園林6號(hào)(簡(jiǎn)寫YL6, 抗旱性弱)、臺(tái)糖172 (簡(jiǎn)寫F172, 抗旱性強(qiáng)) 2個(gè)甘蔗品種作為供試材料。在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗研究所的智能溫室大棚內(nèi), 2012年4月21日桶栽單芽蔗莖, 桶的上徑49.3 cm、下徑34.5 cm、高34.4 cm, 每桶3個(gè)單芽的甘蔗莖段,每個(gè)處理 20桶。桶中裝入配置的土壤(大田表土∶河沙∶牛糞 = 5∶4∶1), 每個(gè)桶的底部都鉆3～5個(gè)直徑為4 mm的圓孔防止積水, 每桶裝約2/3桶的土壤。參考朱理環(huán)等方法[17]在苗期對(duì)2個(gè)甘蔗品種進(jìn)行正常灌溉(CK)和重度干旱脅迫(停止供水 7 d, 土壤含水量為 7.5%～10.0%)。于干旱脅迫處理 7 d后(2012年6月30日), 從每個(gè)品種的干旱脅迫處理和對(duì)照隨機(jī)選取3株甘蔗, 分別在其+1葉(最高可見(jiàn)肥厚帶葉)距肥厚帶18 cm處剪取5 cm葉片, 放入冰盒中拿回實(shí)驗(yàn)室冰浴清洗, 剪成碎片在冰浴條件下快速磨樣待測(cè)。

1.2 主要儀器設(shè)備

PROTEAN i12 IEF等電聚焦儀(Bio-Rad, USA)、Biorad Powerpac Universal 164-5070 (Bio-Rad, USA)、Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳儀(Bio-Rad, USA)、Bio-Rad GS-800掃描儀(Bio-Rad, USA)、Dynamica Velocity 18R高速冷凍離心機(jī)(Dynamica, Australia)。

1.3 樣品蛋白質(zhì)的提取及測(cè)定

參照 Yang等[3]報(bào)道的酚抽法提取蛋并存于–80℃。采用Bradford方法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.4 雙向凝膠電泳及掃描分析

采用Bio-Rad Protean IEF cell等電聚焦系統(tǒng), 17 cm IPG膠條。等電聚焦結(jié)束后分別用含2% DTT (平衡液 1)和 2.5%碘乙酰胺(平衡液 2)的膠條平衡緩沖液(6 mol L–1尿素, 2% SDS, pH 8.8、0.375 mmol L–1Tris-HCl, 20%甘油)平衡膠條各15 min。第2向電泳采用 Bio-Rad大型垂直電泳系統(tǒng)和制膠模具, 分離膠濃度為 12.5%。按 Zhou等的方法[4], 第一步, 用固定液固定2 h, 然后用雙蒸水洗3次, 每次5 min。第二步, 用敏化液敏化 1 h, 然后用雙蒸水洗 3次,每次10 min。第三步, 用銀染液染色30 min, 然后用雙蒸水洗3次, 每次1 min。第四步, 用顯色液顯色,約5 min, 然后用冰乙酸終止反應(yīng)10 min。

采用Bio-Rad GS-800掃描儀進(jìn)行圖像掃描, 保存圖像。掃描儀分辨率為300 dpi, 對(duì)比度與亮度采用軟件默認(rèn)值。用PDQuest軟件分析掃描圖像, 尋找差異蛋白點(diǎn)。

1.5 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析

采用 4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4700 Proteomics Analyzer (TOF/TOFTM) Applied Biosystems, USA)進(jìn)行質(zhì)譜分析, 激光源為 355 nm 波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器, 加速電壓為20 kV, 采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式獲取數(shù)據(jù)。獲得的PMF采用基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和MOWOSE概率算法的蛋白質(zhì)鑒定系統(tǒng)Mascot軟件, 對(duì)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)綜合分析, 設(shè)置NCBIInr和Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(全部生物種類)檢索參數(shù), 數(shù)據(jù)檢索方式為 Combined (MS+MS/MS); 消化多肽的酶為胰蛋白酶, 設(shè)定Mowse Score大于65分的蛋白即為鑒定的蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重度干旱脅迫時(shí)甘蔗幼苗葉片總蛋白的SDS-PAGE圖譜

從圖 1可看出, 所提取的蛋白條帶清晰, 處理與對(duì)照之間的蛋白豐度存在差異, 表明干旱脅迫后甘蔗葉片的蛋白表達(dá)有變化。并且所提取蛋白無(wú)雜質(zhì)污染, 質(zhì)量較好, 定量準(zhǔn)確, 能較好地分離甘蔗葉片總蛋白, 可以用于雙向電泳分析。

圖1 甘蔗葉片總蛋白12.5% SDS-PAGE凝膠圖譜Fig. 1 Separation profile of total protein in sugarcane leaves by electrophoresis with 12.5% SDS-PAGE

2.2 干旱脅迫對(duì)甘蔗幼苗蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

PDQuest軟件對(duì)各個(gè)處理的電泳圖譜分析顯示, 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的相似度較高, 平均匹配率為65%。在2個(gè)甘蔗品種的CK和重度干旱脅迫處理間分別找到差異顯著的蛋白點(diǎn)28個(gè)和20個(gè)(圖2和圖3), 這些差異蛋白點(diǎn)的局部放大圖見(jiàn)圖4和圖5。與CK相比, 兩個(gè)甘蔗品種各差異蛋白點(diǎn)上調(diào)、下調(diào)情況見(jiàn)表1和表2。顯示在YL6所分離到的28個(gè)蛋白中, 干旱脅迫處理后有15個(gè)下調(diào)表達(dá), 7個(gè)上調(diào)表達(dá),新產(chǎn)生蛋白6個(gè); 在F172所鑒定到的20個(gè)蛋白中,干旱脅迫處理后有5個(gè)下調(diào)表達(dá), 15個(gè)上調(diào)表達(dá)。

2.3 差異蛋白的鑒定

分別挖取YL6、F172甘蔗幼苗葉片2-DE凝膠28個(gè)和 20個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行(MALDI-TOF-TOF/ MS)分析, 通過(guò)MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行搜索比對(duì), Mowse Score大于65分的蛋白即為鑒定的蛋白。根據(jù)鑒定報(bào)告分別有18、14個(gè)差異蛋白鑒定成功, 鑒定率分別為64.3%和70.0% (表3和表4)。

圖2 甘蔗品種YL 6幼苗葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig. 2 2-DE profile for proteins from leaves of sugarcane variety YL 6 seedling

圖3 甘蔗品種F172幼苗葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig. 3 2-DE profile for proteins from leaves of sugarcane variety F172 seedlings

根據(jù)前人已鑒定的功能蛋白對(duì)鑒定的32個(gè)蛋白進(jìn)行功能分類[18-23], 可將它們分為8類(圖6): (1)參與光合作用的10個(gè)蛋白中, 從YL6中鑒定出來(lái)的有6個(gè), 包括 Os03g0279950 (spot 6)、Os03g0592500 (spot 11)、二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose bisphosphate carboxylase, spot 14)、Os06g0603000 (spot 24)、鐵氧還原蛋白(ferredoxin, spot 25)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit, spot 27); 從F 172中鑒定出來(lái)的有 2個(gè), 為放氧增強(qiáng)蛋白 1 (oxygenevolving enhancer protein 1, OEE1, spot 6)和33 kD光系統(tǒng) II蛋白(Photosystem II protein 33 kD, spot 15)。(2)參與自由基清除的3個(gè)蛋白中, 從YL6中鑒定出來(lái)的有 2個(gè), 包括 Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase, spot 15)、鐵氧還原蛋白和鐵氧還蛋白-NADP-氧化還原酶復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)A鏈(chain A, crystal structure of the complex between ferredoxin and ferredoxin-NADP+reductase, spot 28),從F172中鑒定出來(lái)的有1個(gè), 為乙二醛酶1 (Glyoxylase1, spot 11)。(3)參與防衛(wèi)反應(yīng)的2個(gè)蛋白僅在YL6中鑒定出, 分別為類異黃酮還原酶(isoflavone reductase homolog IRL, spot 19)和17.4 kD一級(jí)熱擊蛋白3 (17.4 kD class I heat shock protein 3, spot 21)。

圖4 甘蔗品種YL 6的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的局部放大圖Fig. 4 Enlarged pictures of the differential protein spots in sugarcane variety YL6

圖5 甘蔗品種F172的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的局部放大圖Fig. 5 Enlarged pictures of the differential protein spots in sugarcane variety F172

表1 干旱脅迫后甘蔗品種YL6差異蛋白點(diǎn)的表達(dá)類型Table 1 Expression modes of differential protein spots insugarcane variety YL6 under drought stress

表2 干旱脅迫后甘蔗品種F172蛋白差異點(diǎn)的表達(dá)類型Table 2 Expression modes of differential protein spots in sugarcane variety F172 under drought stress

圖6 從甘蔗品種園林6號(hào)和F172中已鑒定的32個(gè)差異蛋白的功能分類Fig. 6 Functional classification of the 32 differential protein spots identified from sugarcane varieties YL6 and F172

(4)參與基礎(chǔ)代謝的 10個(gè)蛋白中, 從 YL6中鑒定出來(lái)的有6個(gè), 包括DNA依賴性ATP酶(SNF2family DNA-dependent ATPase, spot 2)、核糖核酸酶(ribonuclease HII RnhB, spot 4)、核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase I, spot 7)、ATP合酶δ亞基(ATP synthase delta chain, spot 9)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, spot 17)、ATP合酶CF1α亞基(ATP synthase alpha subunit, spot 18); 從F172中鑒定出來(lái)的有 4個(gè), 包括推定的谷氨酰胺合成酶(putative glutamine synthetase, spot 1)、葉綠體腺苷酸激酶(Adenylate kinase, chloroplastic, spot 3)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase, spot 19)、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶前體(Fructose 1,6-bisphosphate aldolase precursor, spot 13)。(5)參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化的3蛋白中, 從YL6中鑒定出來(lái)1個(gè), 為生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP20前體(auxin-binding protein ABP20 precursor, spot 26); 從F172中鑒定出來(lái)2個(gè), 為推定的無(wú)機(jī)焦磷酸酶(putative inorganic pyrophosphatase, spot 4)和生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP20前體(spot 20)。(6)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的2個(gè)蛋白均來(lái)自F172, 分別為F-box家族蛋白(F-box family protein, spot 5)和22 kD干旱誘導(dǎo)蛋白(drought inducible 22 kD protein, spot 12)。(7)參與蛋白加工的1個(gè)蛋白來(lái)自F172, 為20 S蛋白酶體α亞基(20 S proteasome alpha subunit, spot 16)。(8)未知功能蛋白3個(gè), 其中來(lái)自YL6的有1個(gè), 為假定蛋白(hypothetical protein, spot 1); 來(lái)自F172的有2個(gè),為假定蛋白(hypothetical protein, spots 8 and 9)。

3 討論

植物在遭受逆境脅迫后往往會(huì)誘導(dǎo)一些蛋白質(zhì)的合成也會(huì)使一些蛋白合成受阻或被降解, 因而分析脅迫前后蛋白點(diǎn)的變化有望從蛋白水平上了解植物的抗逆機(jī)制[19-26]。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了干旱脅迫過(guò)程中不同抗旱性的甘蔗品種蛋白質(zhì)組的變化。雙向電泳分析結(jié)果表明, 抗旱性弱的品種YL6在干旱脅迫處理后所分離到的差異蛋白以下調(diào)表達(dá)為主, 而抗旱性強(qiáng)的品種F172在干旱脅迫處理后所分離到的差異蛋白以上調(diào)表達(dá)為主。從 YL6和F172甘蔗品種中成功鑒定了32個(gè)干旱響應(yīng)相關(guān)的差異蛋白, 涉及自由基清除、光合作用、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、新陳代謝、防衛(wèi)保護(hù)、蛋白加工、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程, 還有部分獲得的蛋白是未知的假定蛋白。

本研究中, 在重度干旱脅迫下, 抗旱性不同的2個(gè)甘蔗品種均有蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的下調(diào), 如YL6的Rubisco亞基(spot 27)、二磷酸核酮糖羧化酶(spot 14)、銅/鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD, spot 15)蛋白、鐵氧還原蛋白(spot 25)、鐵氧還蛋白-NADP-氧化還原酶復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)A鏈(spot 28)、ATP合酶δ亞基(spot 9)蛋白、核苷二磷酸激酶蛋白(spot 7)、類異黃酮還原酶(spot 19)、一級(jí)熱激蛋白(spot 2)以及F 172的乙二醛酶(spot 11)等。同時(shí), 抗旱性弱的品種YL6中下調(diào)的蛋白質(zhì)種類和數(shù)量均明顯多于抗旱性強(qiáng)的品種 F172, 而且還出現(xiàn)多個(gè)新的蛋白點(diǎn)。在F172中, 沒(méi)有檢測(cè)到任何新的蛋白點(diǎn), 且參與光合作用的相關(guān)蛋白放氧增強(qiáng)蛋白(spot 6)和系統(tǒng)II蛋白(spot 15), 參與代謝的相關(guān)蛋白果糖-1,6-二磷酸醛縮酶前體(spot 13)和磷酸丙糖異構(gòu)酶(spot 19)、腺苷酸激酶蛋白(spot 3)、谷氨酰胺合成酶(spot1)蛋白,細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂相關(guān)蛋白無(wú)機(jī)焦磷酸酶(spot 4)和生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP20前體(spot 20)蛋白, 參與蛋白加工相關(guān)蛋白20S蛋白酶體α亞基(spot 16), 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白Drought inducible 22 kD protein的表達(dá)豐度均上調(diào), 相比較而言, YL6中檢出的18個(gè)蛋白只有參與代謝的相關(guān)蛋白ATP合酶CF1 α亞基(spot 18)蛋白、谷氨酰胺合成酶(spot 17)以及細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂相關(guān)蛋白生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白ABP20前體(spot 26)出現(xiàn)上調(diào)。由此可見(jiàn), 重度干旱脅迫對(duì)抗旱性弱的甘蔗品種YL6的傷害程度遠(yuǎn)大于抗寒性強(qiáng)的甘蔗品種 F172, 這在蛋白質(zhì)水平上得到充分表現(xiàn), 其中絕大部分功能蛋白的表達(dá)豐度明顯降低, 推測(cè)正是這不可避免地降低了甘蔗品種光合作用和清除氧自由基的能力[27-31], 進(jìn)而嚴(yán)重影響甘蔗體內(nèi)新陳代謝的正常進(jìn)行和對(duì)干旱脅迫的防衛(wèi)功能[32-35]。

20S蛋白酶體是一種不依賴ATP及泛素的蛋白酶, 由α和β這兩種亞基構(gòu)成。它是26S蛋白酶體中的 20S催化顆粒, 是蛋白酶體的重要組成部分,在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)降解等各種細(xì)胞生理過(guò)程中具有重要作用[36-37]。也有研究表明蛋白酶體 α亞基表達(dá)量上調(diào), 能有效減輕水稻鎘脅迫下細(xì)胞內(nèi)各種異常的或受損的蛋白質(zhì)積累[38-39], 從而增強(qiáng)水稻耐鎘能力。本研究中, 在干旱脅迫的條件下, 抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種F172中20S蛋白酶體α亞基(spot 16)和Drought inducible 22 kD protein均上調(diào)表達(dá), 推測(cè)蛋白酶體的增加有利于清除在干旱脅迫條件下產(chǎn)生的非正常蛋白, 從而增強(qiáng)甘蔗對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)能力。22 kD干旱誘導(dǎo)蛋白是ASR中的一員。Sugiharto等[40]發(fā)現(xiàn)維管束鞘細(xì)胞中的Sodip22在甘蔗應(yīng)答干旱脅迫的信號(hào)傳遞過(guò)程中起到重要作用, 這一過(guò)程受脫落酸的調(diào)節(jié)。Desclos等[41]發(fā)現(xiàn)油菜干旱誘導(dǎo)的22 kD蛋白同時(shí)具有水溶性葉綠素結(jié)合蛋白活性和胰蛋白酶抑制劑活性, 它能通過(guò)保持蛋白的完整性和正常的光合作用保護(hù)油菜幼嫩組織不受逆境的影響。在本研究中, 抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種F172中Drought inducible 22 kD protein的相對(duì)豐度高于抗旱性弱的甘蔗品種 YL6, 且在干旱脅迫后此蛋白在F172中上調(diào)表達(dá)而在YL6中下調(diào)表達(dá), 這與我們以前用 PEG-6000脅迫處理甘蔗所獲得的結(jié)果是一致的[4]。

綜上所述, 在干旱脅迫下, 抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種F172葉片中與光合作用、自由基清除、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、防衛(wèi)反應(yīng)、蛋白加工、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá), 而抗旱性弱的甘蔗品種YL6中大多表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá), 這可能是他們之間抗旱性差異的重要分子基礎(chǔ), 可作為甘蔗抗旱分子育種的重要參考。

4 結(jié)論

抗旱性強(qiáng)的甘蔗品種F172葉片中與光合作用、自由基清除、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、防衛(wèi)反應(yīng)、蛋白加工、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá), 而抗旱性弱的甘蔗品種YL6中大多表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。

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Analysis of Differential Proteome in Relation to Drought Resistance in Sugarcane

DO Thanh-Trung1, LI Jian1, ZHANG Feng-Juan1, YANG Li-Tao1,*, LI Yang-Rui1,2,*, and XING Yong-Xiu

1Agricultural College, State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning 530005, China;2Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007, China

Drought stress is a major restraint in sugarcane production in China. Proteomic study in relation to drought stress provides valuable information in drought resistant breeding of sugarcane. In this study, the drought-resistant sugarcane variety, F172, and the drought-sensitive variety, YL6, were used in a pot experiment for differential proteome analysis. Seedlings of both varieties were exposed to severe drought stress for seven days and the leaf proteins were separated and analyzed using 2-DE technique and PDQuest software. From the protein profiles of F172 and YL6, 28 and 20 differential protein spots were detected between normal-irrigation and drought-stress treatments, respectively, including up- and down-regulated proteins and new protein spots. The differential proteins varied across the two varieties. Using MALDI-TOF-TOF/MS, 18 and 14 amino acid sequences were identified from YL6 and F172, respectively, and they were in eight function categories. In YL6, the 18 proteins consist of two participating in oxygen radical scavenging, six participating in photosynthesis, one participating in cell growth and division, six participating in basic metabolisms, two participating in protective response, and one unknown in function. In F172, the 14 proteins consist of one participating in oxygen radical scavenging, two participating in photosynthesis, two participating in cell growth anddivision, four participating in basic metabolisms, two participating in information transfer, one participating in protein processing, and one unknown in function. A drought-induced protein of 22 kDa was in high level in F172 but absence in YL6. These results indicate that protein compositions under drought stress are highly different in sugarcane varieties with different drought resistance and the differential proteins might give a hint to drought-resistant mechanism.

Sugarcane; Water stress; Proteome; Differential expression; Drought resistance

(

): 2016-06-04; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-06-05.

10.3724/SP.J.1006.2017.01337

本研究由國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(863計(jì)劃)(2013AA102604), 廣西八桂學(xué)者、特聘專家專項(xiàng)(2013), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西甘蔗創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)(gjnytxgxcxtd-03-01)和廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(12-K-05-01)資助。

This study was supported in part by the National High Technology Research and Development Program of China (863 program) (2013AA102604), the Special Funds for Bagui Scholars and Distinguished Experts in Guangxi (2013), the Guangxi Sugarcane Innovation Team of National Agricultural Industry Technology System (gjnytxgxcxtd-03-01), and the Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement (12-K-05-01).

*通訊作者(Corresponding authors): 李楊瑞, E-mail: lyr@gxaas.net; 楊麗濤, E-mail: litaoyang61@yahoo.com

聯(lián)系方式: E-mail: trungduchanh@gmail.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170605.1650.008.html