靳欣欣，田英姿，2

（1.華南理工大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641；2.喀什大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844006）

響應(yīng)面法優(yōu)化大葉白麻莖中多糖的提取工藝

靳欣欣1，田英姿1，2

（1.華南理工大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510641；2.喀什大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844006）

以大葉白麻莖為原料，以水為提取溶劑，采用超聲輔助提取方法，考察液料比、超聲強(qiáng)度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)大葉白麻莖中多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到多糖的最佳提取工藝為：液料比15∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度35%×1 kW，提取時(shí)間45 min，提取次數(shù)2次，在此條件下的多糖提取得率為1.565%。

大葉白麻；多糖；響應(yīng)面法；提取工藝

大葉白麻（Poacynum hendersonii（Hook.f.）Woods），又稱大花羅布麻，工業(yè)上和羅布紅麻并稱羅布麻，夾竹桃科（Apocynaceae），白麻屬（Poacynum），為直立半灌木，高0.5 m～2.5 m，一般高1 m左右，花期4月～9月（盛開期6月～7月），果期7月～12月（成熟期9月～10月），植株含乳汁，生長(zhǎng)于鹽堿荒地和沙漠邊緣及河流沖積平原水田和湖泊周圍，分布在我國新疆、甘肅、青海等省區(qū)[1]。由于大葉白麻具有延緩衰老、降壓、降脂、抗感冒、鎮(zhèn)靜安神等功效，大葉白麻已被廣泛應(yīng)用于藥用保健業(yè)[2-5]。大葉白麻莖中的黃酮、木脂素、香豆素、萜類和維生素等成分已有研究[6-9]。已經(jīng)有對(duì)大葉白麻多糖成分分析的相關(guān)報(bào)道[10]，但是卻鮮有對(duì)其提取工藝的探討，尤其其莖部被大量丟棄，影響了大葉白麻及其多糖的應(yīng)用研究進(jìn)展。因此本文應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取多糖進(jìn)行了優(yōu)化，為大葉白麻及其多糖的分析和應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DLSBFZ低溫循環(huán)真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Q02旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾拓思實(shí)驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司；FT-IR紅外光譜儀ME-113（美國）：上海精密儀器儀表公司；SONICS超聲波破碎儀（美國）1kw：上海芃奇科學(xué)儀器有限公司；H2050R臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 材料與試劑

大葉白麻莖：新疆塔里木盆地。

石油醚、乙醚、無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、活性炭、碘化鉀試劑、考馬斯亮藍(lán)試劑、濃硫酸、蒽酮、α-萘酚等化學(xué)試劑：廣州市雨韶貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和換算系數(shù)的計(jì)算

精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.4 mg，置于100 mL容量瓶中，定容，得葡萄糖標(biāo)液 A。分別取 1、2、3、4、5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液A置于25 mL容量瓶，定容，得5個(gè)梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5個(gè)梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL置于10 mL具塞試管，另取1 mL超純水作為空白對(duì)照，在6個(gè)比色管加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4 mL，冰水浴10 min，取出立即沸水浴15 min，冷卻至室溫，在620 nm處測(cè)其吸光度，作A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線。

大葉白麻莖多糖實(shí)際濃度與測(cè)定濃度換算系數(shù)：稱取精制大葉白麻莖多糖10.002 mg，置于100 mL容量瓶，得100.002 mg/L多糖溶液，使用蒽酮-硫酸法在620 nm處測(cè)其吸光度，代入A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其測(cè)定顯示濃度C0。C與實(shí)際濃度L的換算系數(shù)X=50.2/C0。

1.3.2 精制大葉白麻多糖純度的鑒定

碘-碘化鉀反應(yīng)：取1 mL大葉白麻多糖樣品制成的溶液，加入碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化。

考馬斯蘭顯色反應(yīng)：取1 mL大葉白麻多糖樣品制成的溶液，加入0.5 mL 0.1%的考馬斯蘭乙醇溶液，混勻，煮沸1 min～2 min，冷卻觀察顏色反應(yīng)。

Molish反應(yīng)：取1 mL大葉白麻多糖樣品制成的溶液，加入2滴Molish試劑，搖勻，沿管壁慢慢加入1mL濃硫酸，觀察濃硫酸與糖交界面顏色的變化。

1.3.3 多糖含量的測(cè)定與計(jì)算

將提取液進(jìn)行一定稀釋后，運(yùn)用蒽酮-硫酸法測(cè)定并計(jì)測(cè)定濃度C。大葉白麻莖多糖含量

式中：X為換算系數(shù)。

1.3.4 大葉白麻多糖提取方法的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：對(duì)液料比、超聲強(qiáng)度、乙醇添加量、超聲時(shí)間幾個(gè)因素對(duì)提取得率的影響進(jìn)行探究。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)：根據(jù)單因素結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及多糖含量計(jì)算方法的確定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可得，葡萄糖濃度-吸光度線性回歸方程為 y=0.010 7x+0.016 6（R2=0.996 7）。

制得的大葉白麻多糖經(jīng)顏色試驗(yàn)，沒有顏色變化。按照1.3.1的方法進(jìn)行計(jì)算，得換算系數(shù)為3.51。

2.2 超聲提取大葉白麻莖中多糖的單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)多糖提取得率的影響

超聲強(qiáng)度40%×1 kW，乙醇添加量0，超聲40 min，考察不同液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]對(duì)多糖提取得率的影響見圖2。

圖2 液料比對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on extraction yield

由圖2可知，提取得率隨液料比的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在10∶1（mL/g）時(shí)提取率最高。

2.2.2 超聲強(qiáng)度對(duì)多糖提取得率的影響

液料比 10∶1（mL/g），超聲時(shí)間 40 min，乙醇添加量0，考察不同超聲強(qiáng)度對(duì)于多糖提取得率的影響見圖3。

由圖3可知，提取得率隨超聲強(qiáng)度的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在35%×1 kW時(shí)達(dá)到最大。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響

液料比 10∶1（mL/g），乙醇添加量 0，超聲強(qiáng)度35%×1 kW，考察不同超聲時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響見圖4。

圖3 超聲強(qiáng)度對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic intensity on extraction yield

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield

由圖4可知，隨著提取時(shí)間增長(zhǎng)，提取得率先增大后減小，且在提取時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最大。

2.2.4 乙醇添加量對(duì)提取得率的影響

液料比 10∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度 35%×1 kW，超聲時(shí)間40 min，考察乙醇添加量對(duì)多糖提取得率的影響見圖5。

圖5 乙醇添加量對(duì)提取得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction yield

由圖5可知，乙醇添加量越高，多糖提取得率越低。因此在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中不再考慮乙醇添加量因素。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響

液料比 10∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度 35%×1 kW，超聲時(shí)間40 min，乙醇添加量0，每次提取完過濾濾液后，加入新的萃取劑，進(jìn)行再一次萃取。提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響見圖6。由圖6可知，超聲次數(shù)增大到2時(shí)，多糖的提取得率基本不再發(fā)生變化。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

2.3.1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以液料比A、超聲強(qiáng)度B、提取時(shí)間C、提取次數(shù)D為響應(yīng)變量，多糖提取得率為響應(yīng)值（R1）進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

圖6 提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響Fig.6 Effect of extraction times on extraction yield

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Arrangement and experimental results of the BBD

2.3.2 方差分析

利用Design-expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到提取率與各因素變量之間的二次回歸模型。

提取得率=-3.378 37+0.143 00A+0.119 20B+0.044 010C+1.028 66D-1.035 00×10-3AB-4.000 00×10-5AC-8.050 00×10-3AD-1.300 00×10-4BC-2.075 00×10-3BD-1.950 00×10-3CD+4.090 33×10-3A2-1.397 58×10-3B2-3.906 46×10-4C2-0.167 01D2

試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鲆姳?。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治鯰able 2 Variance analysis for the fitted regression mode

回歸方程模型極顯著（P＜0.0001），模型相關(guān)系數(shù)R2為 0.987 5，校正決定系數(shù)（Adj.R2）為 0.966 1，模型變異系數(shù)（CV.）為1.27%，說明該二次模型能夠擬合真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)誤差?。辉撃Ｐ偷氖M項(xiàng)（P=0.084 8＞0.05）不顯著，表明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)相符，可用其對(duì)應(yīng)的回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表3。

表3 提取率回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Extraction yield of regression model analysis of variance

料液比A、超聲強(qiáng)度B、提取時(shí)間C、提取次數(shù)D對(duì)多糖提取得率均有顯著影響，液料比A、提取時(shí)間C、提取次數(shù)D對(duì)提取得率有極顯著影響。除料液比A和提取時(shí)間C的交互因素外，4個(gè)因素的其它交互因素對(duì)提取得率均有顯著影響。

2.3.3 響應(yīng)面分析及提取工藝的優(yōu)化

不同提取因素對(duì)提取得率影響的三維曲面見圖7。

圖7 不同因素對(duì)多糖提取得率的影響Fig.7 Effect of different factors on exrtraction yield of polysaccharide

通過三維曲面可以判斷各因素對(duì)提取得率影響的顯著性及各因素之間交互作用的強(qiáng)弱。6個(gè)三維曲面圖形均為上凸形，且最高點(diǎn)落在所選區(qū)域內(nèi)，可以說明因素水平選擇合理；多糖提取得率隨液料比、超聲強(qiáng)度、超聲時(shí)間的增大呈現(xiàn)先升高后降低的二次關(guān)系，隨超聲次數(shù)的增加，提取得率先升高后呈現(xiàn)較穩(wěn)定趨勢(shì)。

由Design-expert軟件獲得提取多糖的最佳條件：液料比 15∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度 33.7%×1 kW，超聲時(shí)間44.37 min，超聲次數(shù)2.27，在此條件下多糖的提取得率是1.57%。為了方便實(shí)際操作，最佳條件確定為：液料比 15∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度 35%×1 kW，提取時(shí)間 45 min，提取次數(shù)2次，在此條件下多糖提取得率為1.565%。與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型用于提取多糖是可靠的。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面對(duì)大葉白麻莖中多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了多糖提取的數(shù)學(xué)模型。評(píng)價(jià)了液料比、超聲強(qiáng)度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響，其中液料比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取得率的影響極為顯著，超聲強(qiáng)度對(duì)提取得率的影響顯著；由試驗(yàn)結(jié)果得最佳提取工藝為：液料比15∶1（mL/g），超聲強(qiáng)度35%×1 kW，提取時(shí)間45 min，提取次數(shù)2次，在此條件下的多糖提取得率為1.565%。本研究所確定的多糖提取方法操作簡(jiǎn)便，提取得率相對(duì)于傳統(tǒng)水提法高，方便于對(duì)大葉白麻及其多糖的進(jìn)一步利用。

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Optimization of Extraction Technology of the Polysaccharide from Pocynum hendersonii by Reponse Surface Methodology

JIN Xin-xin1，TIAN Ying-zi1，2
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510641，Guangdong，China；2.College of Life and Geography Sciences，Kashi University，Kashi 844006，Xinjiang，China）

This study used Pocynum hendersonii as the raw material，with water as extraction solvent，adopted the method of ultrasonic assisted extraction，investigated the effect of liquid ratio，ultrasonic strength，extraction time，extraction times on extraction yield of polysaccharide.The extraction technology of polysaccharide was optimized by single factor and response surface analysis.The results showed that the optimal extraction technologywasas follows：liquid tosolidratio15∶1（mL/g），ultrasonicstrengthof35%×1kW，extraction time for 45 min，extraction for 2 times，under this technology，the extraction yield of polysaccharide was 1.565%.

Pocynum hendersonii；polysaccharide；response surface technology；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.013

2016-12-15

“羅布麻纖維功能性再造煙葉的研制及應(yīng)用研究”（QJ/GY G03.009/02）

靳欣欣（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：植物資源利用與天然產(chǎn)物開發(fā)。