衛(wèi) 強(qiáng)，任定美，李四聰，孫 濤，呂來(lái)虎

皖南山區(qū)紅豆杉多糖提取、純化方法及單糖組成分析

衛(wèi) 強(qiáng)，任定美，李四聰，孫 濤，呂來(lái)虎

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

研究皖南地區(qū)野生紅豆杉莖、葉中多糖的提取、純化方法，分析其單糖組成情況。結(jié)果表明，閃式提取為最佳提取方法，其中太平紅豆杉細(xì)莖和黟縣紅豆杉葉多糖提取量最高，分別達(dá)到7.09、10.25 mg/g，其中細(xì)莖比粗莖多糖含量高10～20 倍。Sevag法脫蛋白效果最好，對(duì)太平紅豆杉細(xì)莖、黟縣紅豆杉葉多糖的脫蛋白率分別為66.5%、69.1%。H2O2法脫色效果最好，對(duì)太平紅豆杉細(xì)莖、黟縣紅豆杉葉多糖的脫色率為84.2%、85.3%。紅外光譜顯示，紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉多糖譜圖相似。2個(gè)產(chǎn)地的紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉中精制多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，三者單糖種類相似，木糖物質(zhì)的量比均較高，但單糖組成比例不同。該研究為紅豆杉多糖的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參數(shù)。

紅豆杉；多糖；提??；純化；單糖組成

我國(guó)野生紅豆杉屬（Taxus Linn.）植物主要分布甘肅、陜西、安徽等省區(qū)，生于海拔1 000～1 500 m石山雜林。皖南野生紅豆杉屬南方紅豆杉[Taxus chinensis var. mairei (Lemée et Lévl.) Cheng et L.K.Fu]，在安徽境內(nèi)主要分布于黟縣、太平等皖南山地、丘陵區(qū)[1]。黃山腳下的譚家橋鎮(zhèn)聶家山上新近發(fā)現(xiàn)的紅豆杉古樹(shù)群面積約100 hm2，樹(shù)齡大都在500 a之上[2]。多糖是重要的活性成分，具有抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等作用。紅豆杉莖葉可再生，可作為提取多糖的主要來(lái)源，具有環(huán)境友好特點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)采用微波[8]、超聲[9]等提取出種植紅豆杉中多糖。利用Sevag法[10]、三氯乙酸法[11]等脫除多糖中蛋白質(zhì)，利用H2O2[12]、活性炭[13]等對(duì)多糖進(jìn)行脫色。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)皖南野生紅豆杉中多糖進(jìn)行提取、純化方法的篩選，制備精多糖，并進(jìn)一步分離和測(cè)定其莖、葉精多糖的單糖組成，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皖南紅豆杉莖、葉于2016年4月分別采自安徽黃山市太平縣、黟縣，分為太平細(xì)莖（直接連接葉的枝條，簡(jiǎn)稱TP細(xì)莖）、黟縣細(xì)莖（簡(jiǎn)稱yX細(xì)莖）、太平粗莖（非直接連接葉的枝條，簡(jiǎn)稱TP粗莖）、黟縣粗莖（簡(jiǎn)稱yX粗莖）、太平葉（簡(jiǎn)稱TP葉）和黟縣葉（簡(jiǎn)稱yX葉），經(jīng)李啟照副教授鑒定。

Sephadex G-150 上海森雅生物技術(shù)有限公司；DEAE-52纖維素 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。

牛血清白蛋白 美國(guó)Roche公司；鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、巖藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50型閃式提取器 河南金鼎科技發(fā)展有限公司；LDZ4-1.2型低速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；KJ-Sy-150超聲提取器 北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；CNWB-C型微波萃取器 廣州萬(wàn)程微波設(shè)備有限公司；UV-4802型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼柯儀器有限公司；TJ270-30A紅外光譜儀 天津拓普儀器有限公司；6890-5973N氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；FA1004型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆杉多糖提取方法的選擇

回流：干燥紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)24 目篩，精密稱取各5.0 g，分別加入80%乙醇溶液200 mL浸漬3 次，每次24 h，抽濾，棄去濾液。濾渣加入1 000 mL蒸餾水回流提取3 次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至200 mL，加入無(wú)水乙醇調(diào)整至體積分?jǐn)?shù)80%，放入冰箱冷藏24 h，抽濾，濾餅以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、環(huán)己烷、淋洗3～4 次，再加入150 mL蒸餾水70 ℃溶解，加入1/4體積的氯仿-濃硫酸（體積比4∶1）置于磁力攪拌器中振蕩30 min，再離心3～4 次，每次5 min（4 000 r/min），吸取上清液，加入5 mL 30% H2O2溶液50 ℃保溫脫色3 h，取5 mL按照1.3.2節(jié)方法計(jì)算多糖提取率。

超聲：精密稱取干燥紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉粗粉各5 g，分別加入80%乙醇溶液200 mL超聲5 次，每次8 min，抽濾，棄去濾液。濾渣加入1 000 mL蒸餾水超聲（功率1 kW）提取3 次，每次30 min，合并濾液后同回流操作。

微波：精密稱取干燥紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉粗粉各5 g，分別加入80%乙醇溶液200 mL浸漬3 次，每次24 h，抽濾，棄去濾液。濾渣加入1 000 mL蒸餾水微波（功率1 kW）提取3 次，每次5 min，合并濾液后同回流操作。

閃式：精密稱取干燥紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉粗粉各5 g，分別加入80%乙醇溶液200 mL超聲5 次，每次10 min，抽濾，棄去濾液。濾渣加入1 000 mL蒸餾水閃式提取3 次（轉(zhuǎn)速3 500 r/min），每次5 min，合并濾液后同回流操作。

上述提取方法均重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

[14]，精密稱取52.6 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，以蒸餾水定容于100 mL容量瓶。再移取5 mL以蒸餾水定容于100 mL容量瓶。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于6 只10 mL刻度試管中，分別加蒸餾水至2 mL，再分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，40 ℃水浴保溫15 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：A=0.040 23C+ 0.029 80，r為0.999 1，線性范圍為2.63～13.15 μg/mL。

1.3.3 脫蛋白方法

1.3.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]，精密稱定50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，以25 mL 95%乙醇溶液溶解，再加入85%磷酸溶液50 mL，蒸餾水定容至500 mL。精密稱定牛血清蛋白25 mg，以蒸餾水定容至100 mL，吸取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于具塞試管，加蒸餾水至5 mL，再加考馬斯亮藍(lán)G-250溶液25 mL，放置10 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以空白試劑為參比，測(cè)定其吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：Y=0.172 1X+0.028 50，r為0.999 2，線性范圍為0.83～5.00 μg/mL。

1.3.3.2 脫蛋白方法的選擇

Sevag法：按氯仿-正丁醇（4∶1，V/V）溶液配制Sevag試劑，將10 mL Sevag試劑與50 mL質(zhì)量濃度一定的粗多糖樣液混合，劇烈振搖20 min，4 000 r/min離心10 min，分去下層有機(jī)相和中間的變性蛋白。收集上清液，將上述方法反復(fù)6～8 次。測(cè)定多糖含量、蛋白含量及色素吸光度。按公式（1）、（2）計(jì)算多糖損失率和脫蛋白率。

三氯乙酸法：取50 mL粗多糖樣液，用10%三氯乙酸溶液調(diào)至pH 3，混勻靜置過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液。并按公式（1）、（2）計(jì)算多糖損失率和脫蛋白率。

石灰乳法：取粗多糖溶液50 mL，水浴溫度80 ℃，用石灰乳調(diào)pH 10，加熱攪拌20 min，再用磷酸調(diào)pH 6，保溫10 min后，靜止室溫，過(guò)濾沉淀，并按公式（1）、（2）計(jì)算多糖損失率和脫蛋白率。

鹽酸法：取50 mL粗多糖樣液，用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH 3，靜置過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液。并按公式（1）、（2）計(jì)算多糖損失率和脫蛋白率。

上述脫蛋白方法均重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.4 脫色方法

考慮到大孔樹(shù)脂在生產(chǎn)過(guò)程中有殘留問(wèn)題，未對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行考察。采用H2O2、活性炭法、反膠束溶液法、95%乙醇法進(jìn)行脫色，于波長(zhǎng)300 nm處測(cè)定吸光度[15]，按公式（3）、（4）計(jì)算脫色率和多糖損失率。

H2O2法：取脫蛋白后的多糖配制成5 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，加入30% H2O2溶液1 mL，50 ℃保溫脫色3 h，直至顏色符合要求或色值不能再降低，檢測(cè)其脫色前后色素吸光度和多糖含量。

活性炭法：活性炭經(jīng)重蒸水清洗過(guò)濾，120 ℃干燥24 h，備用。取脫蛋白后的多糖配制成5 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，加入2%活性炭，50 ℃條件下脫色3 h，直至顏色符合要求或色值不能再降低，檢測(cè)其脫色前后色素吸光度和多糖含量。

反膠束溶液法：取脫蛋白后的多糖配制成5 mg/mL的粗多糖溶液50 mL，沸水浴中加熱30 min后冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取20 mL上清液加入0.234 g氯化鈉備用。再移取1 mL正己醇、4 mL異辛烷和0.274 g十六烷基三甲基溴化銨混合制成反膠束溶液。取3 mL粗多糖溶液和1 mL反膠束溶液，振蕩3 min，靜置30 min，取下層液體檢測(cè)其脫色前后色素吸光度和多糖含量。

乙醇法：取脫蛋白后的多糖以1∶20料液比（g/mL）回流提取3 h，重復(fù)3 次，抽濾，合并提取液，濃縮，95%乙醇溶液醇沉，離心，取沉淀測(cè)定脫色前后色素吸光度和多糖含量[16]。

上述脫色方法均重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.5 紅外光譜分析

選取經(jīng)1.3.1節(jié)方法提取后含量較高的TP細(xì)莖和yX葉多糖2.0 mg，加入適量KBr混合均勻后壓片，經(jīng)紅外測(cè)試，分別比較不同提取方法中紅外光譜的變化。

1.3.6 單糖組成分析

將紅豆杉莖、葉粗多糖以蒸餾水溶解配制成質(zhì)量濃度為120 mg/mL的溶液，離心后取上清液1 mL上DEAE-52纖維素柱（1.5 cm×60 cm），以蒸餾水及0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L氯化鈉溶液依次洗脫，流速為0.5 mL/min，每管收集量為3 mL，于波長(zhǎng)490 nm處以苯酚-硫酸測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線。洗脫液濃縮，再經(jīng)透析、濃縮、干燥，得多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶解于5 mL蒸餾水中，離心得上清液過(guò)Sephadex G-150凝膠柱，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，以苯酚-硫酸法（A490nm）隔管檢測(cè)糖含量，并在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度，檢測(cè)蛋白含量，繪制洗脫曲線，按照洗脫峰收集合并組分，透析冷凍干燥得精制多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

稱取精制多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各20 mg及等量的鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品分別加入蒸餾水溶解，加入硼氫化鈉還原3 h，以冰乙酸調(diào)pH 4～5，加入甲醇，濃縮至干。加入醋酐，90 ℃水浴1.5 h，冷卻，加入甲苯3 mL，N2吹干，加入乙醇，反復(fù)吹干3 次后，2 mL三氯甲烷萃取，過(guò)濾之后進(jìn)行氣相色譜分析。色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm）；載氣為氮?dú)猓魉? mL/min；進(jìn)樣量1 μL；程序升溫：柱初始溫度160 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250 ℃[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉多糖提取方法的選擇

如圖1所示，不同產(chǎn)地和不同提取方法對(duì)紅豆杉莖、葉多糖提取量影響較大。其中閃式法在TP粗莖、yX粗莖、TP細(xì)莖、yX細(xì)莖、TP葉、yX葉中提取量均較高，其中TP細(xì)莖和yX葉中提取量達(dá)到7.09、10.25 mg/g，TP葉中多糖的提取量達(dá)到7.12 mg/g。閃式提取通過(guò)高速機(jī)械剪切力和超速動(dòng)態(tài)分子滲濾作用，將藥材破碎成微粉，具有破壁作用強(qiáng)、提取時(shí)間短、耗能低、雜質(zhì)少等特點(diǎn)[18]。而微波和回流由于是高溫處理，雜質(zhì)多，在醇沉和脫蛋白過(guò)程中損失嚴(yán)重。而細(xì)莖比粗莖多糖含量高10～20 倍，說(shuō)明紅豆杉新枝（即細(xì)莖）對(duì)提取多糖有非常積極的意義，而老枝（粗莖）則應(yīng)給予相應(yīng)的保護(hù)。另外，TP葉、yX葉中多糖含量較高，說(shuō)明摘取葉有利于增加提取量，由于葉再生能力強(qiáng)，修剪對(duì)植物影響小，也可作為提取多糖的重要原料。

圖1 提取方法對(duì)多糖提取量的影響Fig. 1 Effect of extraction methods on the yield of polysaccharides

2.2 紅豆杉粗多糖的脫蛋白結(jié)果

圖2 脫蛋白方法對(duì)多糖的影響Fig. 2 Effect of deproteinization methods on protein removal and polysaccharide loss

如圖2所示，Sevag法脫蛋白率最高，對(duì)TP細(xì)莖和yX葉的脫蛋白率為66.5%和69.1%，而多糖損失率最低，對(duì)TP細(xì)莖和yX葉的多糖損失率為10.6%和8.9%。

2.3 紅豆杉粗多糖的脫色

如圖3所示，H2O2法脫色率最高，對(duì)TP細(xì)莖和yX葉的脫色率為84.2%和85.3%，而多糖損失率較低，對(duì)TP細(xì)莖和yX葉的多糖損失率為20.6%和22.5%。

圖3 脫色方法對(duì)多糖的影響Fig. 3 Effect of decolorization methods on decoloraization rate and polysaccharide loss

2.4 紅外光譜分析

圖4 TP細(xì)莖（A）和YX葉（B）不同提取多糖及閃式提取不同部位多糖（C）紅外光譜譜型比較Fig. 4 Comparison of IR spectra of polysaccharides extracted from thin stems (A) and leaves (B) by different extraction techniques and polysaccharides extracted from different parts by flash extraction (C)

表1 TP細(xì)莖多糖紅外光譜比較Table 1 Comparison of IR spectral peaks of polysaccharides extracted from thin stems by different extraction techniques

表2 YX葉多糖紅外光譜比較Table 2 Comparison of IR spectral peaks of polysaccharides extracted from leaves by different extraction techniques

表3 閃式提取葉、細(xì)莖和粗莖多糖的紅外光譜比較Table 3 Comparison of IR spectral peaks of polysaccharides extracted from leaves and thin and thick stems by flash extraction

由圖4A、B可知，不同提取的TP細(xì)莖和yX葉多糖紅外光譜相似。由圖4C可知，紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉閃式提取多糖紅外光譜譜型也相似。由表1和表2可知，微波、回流和超聲提取的細(xì)莖和葉多糖紅外吸收光譜在3 400 cm-1左右是形成氫鍵的—OH伸縮振動(dòng)，說(shuō)明是分子內(nèi)或分子間氫鍵；2 930 cm-1左右是糖類C—H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 400～1 200 cm-1是糖類C—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1740～1720 cm-1是C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 600～1 650 cm-1是—COOH中C＝O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1 400 cm-1左右是—COO中的C—O伸縮振動(dòng)，說(shuō)明存在糖醛酸結(jié)構(gòu)；1 150～1 020 cm-1是多糖中糖的醚鍵C—O—C伸縮振動(dòng)特征峰；1 080～1 000 cm-1是吡喃環(huán)變形振動(dòng)峰，說(shuō)明可能是吡喃型多糖；879、881 cm-1說(shuō)明TP細(xì)莖微波提取和yX葉超聲提取多糖存在β-糖苷鍵，757 cm-1為α-吡喃環(huán)對(duì)稱伸縮振動(dòng)特征峰。由表3可知，3 550、3 410 cm-1左右形成氫鍵的—OH伸縮振動(dòng)，說(shuō)明閃式提取多糖中同時(shí)存在游離—OH和分子內(nèi)或分子間氫鍵。經(jīng)過(guò)與鼠李糖紅外光譜比對(duì)，669、603、461 cm-1可能為鼠李糖的特征峰[19]。

2.5 單糖組成分析

由圖5～7、表4～6可知，以yX葉為例，經(jīng)DEAE-52纖維素柱柱層析后，得到3 個(gè)峰，表明多糖由3 種不同組成的組分構(gòu)成。yX葉精制多糖經(jīng)Sephadex G-150凝膠色譜柱純化的多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（圖6a、b、c），流出曲線呈單一對(duì)稱峰，說(shuō)明是相對(duì)分子質(zhì)量分布均一的多糖組分，為多糖結(jié)合蛋白。3 種精制多糖經(jīng)衍生后，氣相色譜測(cè)定單糖組成，計(jì)算物質(zhì)的量比。結(jié)果表明，精制多糖Ⅰ、Ⅱ均含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。精制多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中木糖物質(zhì)的量比均較高。yX葉精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Gal、Ara（24.6∶18.4∶10.1），TP葉精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Rha、GlaA、Glc（18.0∶15.2∶10.6∶10.5），yX細(xì)莖精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是Man、Xyl、Glc（22.2∶19.2∶10.0），TP細(xì)莖精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是Man、Gal、Xyl（40.2∶20.4∶11.6），yX粗莖精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是GlcA、Xyl、GlaA、Man（18.0∶15.6∶15.1∶12.2），TP粗莖精制多糖Ⅰ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、GlcA、Glc、GlaA（20.1∶14.7∶11.5∶10.3）。

圖5 多糖DEAE-52纖維素柱洗脫曲線Fig. 5 Elution curve of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography

圖6 YX葉多糖Ⅰ（a）、Ⅱ（b）、Ⅲ（c）經(jīng)Sephadex G-150分子排阻色譜圖Fig. 6 Chromatography of purified leaf polysaccharides Ⅱ (b) andⅠ (a),Ⅲ (c) on Sephadex G-150 column

圖7 單糖對(duì)照品（a）、YX葉精制多糖Ⅰ（b）、Ⅱ（c）、Ⅲ（d）氣相色譜圖Fig. 7 Gas chromatograms of mixed monosaccharide standards (a), purified polysaccharides Ⅰ (b),Ⅱ(c), andⅢ (d)

表4 紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉精制多糖Ⅰ的單糖組成比較Table 4 Monosaccharide composition of purified polysaccharides Ⅰfrom thick and thin stems and leaves

表5 紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉精制多糖Ⅱ的單糖組成比較Table 5 Monosaccharide composition of purified polysaccharides Ⅱfrom thick and thin stems and leaves

表6 紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉精制多糖Ⅲ的單糖組成比較Table 6 Monosaccharide composition of purified polysaccharides Ⅲfrom thick and thin stems and leaves

yX葉精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Gal、GlcA、Rha（18.0∶12.1∶10.7∶10.5），TP葉精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Rha、Xyl、Man（12.5∶11.1∶10.0），yX細(xì)莖精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Man、Gal（20.1∶16.5∶12.2），TP細(xì)莖精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Man、Gal、Xyl（31.1∶26.0∶13.7），yX粗莖精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、GlaA、Man、GlcA（22.2∶14.0∶10.6∶10.5），TP粗莖精制多糖Ⅱ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Glc（15.8∶13.0）。

yX葉精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Gal，TP葉精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Xyl、Rha（14.6∶10.0），yX細(xì)莖精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Man、Xyl（29.0∶18.2），TP細(xì)莖精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Gla、Man、Xyl（22.4∶20.2∶15.0），yX粗莖精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Man、Xyl、GlaA（18.9∶10.6∶10.0），TP粗莖精制多糖Ⅲ中物質(zhì)的量比較高的是Glc、Xyl（18.8∶12.0）。

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉多糖具有明顯的抗腫瘤作用，如紅豆杉多糖組分CPTC-2可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901，誘導(dǎo)其凋亡[20]。多糖組分PSy-1可抑制Lewis肺癌、HepA肝癌荷瘤小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)[21]。多糖組分TMP90W可抑制乳腺癌MCF-7、肺癌A549細(xì)胞[22]?；钚远嗵荘CH0.5可抑制肺癌HepA和Lewis肺癌細(xì)胞[23]。從云南紅豆杉中分離出的活性多糖TMP70W可抑制白血病K562、宮頸癌MCF7細(xì)胞[24]。多糖TMP70S-1可抑制宮頸癌Hela、纖維肉瘤HT1080細(xì)胞[25]。

植物細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)，多糖成分與維生素、蛋白質(zhì)、果膠、淀粉、植物纖維等成分共存，普通提取難以破壁溶解，提取量較低[26]。紅豆杉莖葉多糖的提取、純化方法報(bào)道較多，但對(duì)莖中粗莖、細(xì)莖和葉中多糖含量差異鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)回流、超聲、微波、閃式4 種方法驗(yàn)證了粗莖、細(xì)莖和葉中多糖的含量，得出細(xì)莖和葉含量較高，有利于指導(dǎo)對(duì)其莖葉的采集、應(yīng)用和開(kāi)發(fā)。比較了4 種提取方法，閃式提取具有良好的提取效果。閃式提取技術(shù)是一種用于植物軟、硬組織破碎的新型提取技術(shù)，能最大限度保留植物有效成分，使其不會(huì)受熱破壞，具有溶劑用量小、提取時(shí)間短、效率高、刀具耐磨、結(jié)構(gòu)緊湊及使用安全可靠的特點(diǎn)[27-28]。陳艷蕊等[29]利用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了黃芪多糖的閃式提取條件，與堿提法相比，閃式提取的黃芪多糖得率提高了近30%。謝霞等[30]證明，與傳統(tǒng)提取方法比較，閃式提取法不僅節(jié)約時(shí)間和能源，而且在細(xì)柱五加莖多糖提取量上也優(yōu)于回流提取法和超聲提取法。本研究表明，皖南野生紅豆杉莖、葉中多糖以閃式提取效果最好，新枝（細(xì)莖）比老枝（粗莖）多糖含量高，黟縣葉（yX葉）中多糖含量也較高。多糖的純化以Sevag法脫蛋白，H2O2法脫色效果最好。不同提取方法提取的紅豆杉細(xì)莖、粗莖和葉多糖的紅外光譜圖相似，光譜數(shù)據(jù)有一定差異，說(shuō)明提取方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響不大。TP葉、yX葉、TP粗莖、yX粗莖、TP細(xì)莖、yX細(xì)莖中精制多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在單糖種類相似，木糖物質(zhì)的量比均較高，但單糖組成比例不同，可能對(duì)其生物活性產(chǎn)生一定的影響。

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Extraction and Purification of Polysaccharides from Stems and Leaves of Taxus Grown in Mountain Areas in Southern Anhui Province and Their Monosaccharide Composition

WEI Qiang, REN Dingmei, LI Sicong, SUN Tao, Lü Laihu
(College of Pharmacy, Anhui Xinhua University, Hefei 230088, China)

The extraction and purification of polysaccharides from the stems and leaves of wild Taxus chinensis var. mairei (Lemée et Lévl.) Cheng et L.K.Fu grown in mountain areas in the south of Anhui province were investigated and their monosaccharide compositions were determined. The results indicated that flash extraction was the best method to extract polysaccharides from these plant materials. The yields of polysaccharides extracted from thin stems from Taiping county and leaves from yi county were the highest (7.09 and 10.25 mg/g, respectively). Thin stems contained 10–20 times more polysaccharides than did thick ones. The Sevag method gave the highest deproteinization rate (66.5% and 69.1% for crude polysaccharides extracted from thin stems from Taiping county and leaves from yi county, respectively). The highest decolorization rate (84.2% and 85.3% for the two crude samples, respectively) was achieved by using hydrogen peroxide. Infrared spectra of polysaccharides extracted from thin and thick stems as well as leaves were similar. The purified polysaccharides (Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ) from thin and thick stems as well as leaves contained a similar monosaccharide composition with xylose being predominant, but varying in monosaccharide ratio. These findings can provide valuable information for the development and application of polysaccharides from Taxus plants.

Taxus; polysaccharides; extraction; purification; monosaccharide composition

10.7506/spkx1002-6630-201716030

R284.1

A

1002-6630（2017）16-0190-08

衛(wèi)強(qiáng), 任定美, 李四聰, 等. 皖南山區(qū)紅豆杉多糖提取、純化方法及單糖組成分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 190-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716030. http://www.spkx.net.cn

WEI Qiang, REN Dingmei, LI Sicong, et al. Extraction and purification of polysaccharides from stems and leaves of Taxus grown in mountain areas in southern Anhui province and their monosaccharide composition[J]. Food Science, 2017, 38(16): 190-197. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716030. http://www.spkx.net.cn

2016-10-20

安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2016A313）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201612216090）

衛(wèi)強(qiáng)（1977—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分。E-mail：weiqiang509@sina.com