趙雅楠，王 穎,2，張東杰,*，王麗俠*，佐兆杭

內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性SSR分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建

趙雅楠1，王 穎1,2，張東杰1,*，王麗俠3,*，佐兆杭1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

目的：分析內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種的遺傳多樣性并構(gòu)建其DNA指紋圖譜，為探明綠豆種質(zhì)資源遺傳背景及真?zhèn)舞b定提供科學(xué)依據(jù)。方法：以內(nèi)蒙古地區(qū)92 份綠豆品種為模板，利用篩選得到的10 對(duì)多態(tài)性豐富的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）引物對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建。結(jié)果：10 對(duì)SSR引物共檢測(cè)到58 個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到3～10 個(gè)不等；不同引物揭示的多態(tài)信息含量變幅介于0.371 4～0.773 7，平均為0.52。92 份綠豆種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)變幅介于0.033 4～1.000 0之間，平均為0.46。非加權(quán)組平均法聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.294 4時(shí)，可將92 份綠豆種質(zhì)分為兩大類群。構(gòu)建了92 份綠豆品種的SSR指紋圖譜及分子身份證，除個(gè)別品種外，大部分具有唯一性，可用于品種鑒定。結(jié)論：內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性相對(duì)較豐富，但存在一定程度的近交現(xiàn)象，有待進(jìn)一步加強(qiáng)引進(jìn)基因資源，創(chuàng)新綠豆育種材料；構(gòu)建綠豆SSR指紋圖譜和分子身份證，對(duì)綠豆品種真?zhèn)舞b定、身份識(shí)別、溯源管理及原產(chǎn)地保護(hù)具有重要意義。

SSR熒光標(biāo)記；綠豆；遺傳多樣性分析；指紋圖譜構(gòu)建

綠豆（Vigna radiate）是豇豆屬、亞洲豇豆亞屬的栽培作物，是起源于中國(guó)的重要糧食作物，在我國(guó)已有2000多年的栽培歷史[1-3]。綠豆生育期短，具有較強(qiáng)的耐瘠性和固氮能力，是禾谷、棉花、薯類等作物間套種的適宜作物，也是良好的減災(zāi)救荒的填閑作物。同時(shí)綠豆富含蛋白質(zhì)、淀粉等，是調(diào)解營(yíng)養(yǎng)平衡的重要補(bǔ)充糧[4-5]。隨著人們生活水平的提高，綠豆以其特殊的藥食同源性深受青睞。然而對(duì)我國(guó)近些年來育成的綠豆品種進(jìn)行深入分析不難發(fā)現(xiàn)，少數(shù)優(yōu)良親本被重復(fù)集中使用，種質(zhì)資源應(yīng)用同質(zhì)化的趨勢(shì)日趨顯著，導(dǎo)致我國(guó)綠豆種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，優(yōu)異基因流失，且綠豆種子侵權(quán)、機(jī)械混雜和人為摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，傳統(tǒng)鑒定方法越來越難以區(qū)分鑒別[6-7]。因此，探究綠豆種質(zhì)資源遺傳多樣性、構(gòu)建DNA指紋圖譜對(duì)明確綠豆種質(zhì)遺傳分化水平，挖掘、利用優(yōu)質(zhì)綠豆種質(zhì)資源及名優(yōu)品種保護(hù)具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸成熟，尤其是簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等特點(diǎn)在作物遺傳多樣性分析及品種鑒定等研究中廣泛應(yīng)用。Rana等[8]對(duì)48 個(gè)梨品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，將參試品種劃分為5 個(gè)類群。羅兵等[9]對(duì)太湖地區(qū)42 份粳稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，認(rèn)為SSR標(biāo)記可將常規(guī)粳稻和雜交粳稻進(jìn)行區(qū)分。宮慧慧等[10]利用18 對(duì)SSR引物對(duì)80 份小豆種質(zhì)進(jìn)行分析，證明SSR技術(shù)是探究種群聚類與種質(zhì)地理起源相關(guān)性的重要途徑。薛建峰等[11]利用10 對(duì)SSR引物構(gòu)建了國(guó)內(nèi)外31 份具有品種特異性的蓖麻DNA指紋圖譜；姚全勝等[12]構(gòu)建了11 個(gè)具有代表性的芒果品種的指紋圖譜，利用4 對(duì)引物即可將其完全區(qū)分開；陸徐忠等[13]利用48 對(duì)SSR引物構(gòu)建了133 份雜交水稻的分子身份證，并將其與品種形態(tài)學(xué)信息結(jié)合，構(gòu)建了具有查詢功能的SSR指紋網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，為水稻品種的選育及鑒別提供參考。

我國(guó)綠豆的主產(chǎn)區(qū)主要分布在黃淮流域及東北地區(qū)，其中內(nèi)蒙古在綠豆播種量及產(chǎn)量方面均位居全國(guó)前列，并且在漫長(zhǎng)的自然進(jìn)化和人工選擇過程中形成了豐富的綠豆種質(zhì)資源。然而隨著綠豆品種的大面積推廣，遺傳基礎(chǔ)愈發(fā)狹窄，品種間相似度高，生產(chǎn)存在潛在危險(xiǎn)性[14-16]。同時(shí)，關(guān)于內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建的研究報(bào)道十分有限[17-18]，研究中涉及的品種數(shù)量較少，目前鮮見針對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)大部分綠豆資源遺傳多樣性研究的報(bào)道，同時(shí)，前人研究中均利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，耗時(shí)費(fèi)力，在不同批次分析中易產(chǎn)生誤差，檢測(cè)精確度不高?；诖?，為進(jìn)一步充分了解內(nèi)蒙古地區(qū)的綠豆種質(zhì)資源，本研究對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供的100 對(duì)綠豆SSR引物篩選得到條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的10 對(duì)SSR引物，利用SSR熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)92 份綠豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建其SSR指紋圖譜，為探明內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源遺傳背景提供理論依據(jù)，同時(shí)也為我國(guó)綠豆品種真?zhèn)舞b定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及資源保護(hù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選取來自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市、呼和浩特市等23 個(gè)地區(qū)的92 份綠豆地方品種，綠豆種質(zhì)材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，供試綠豆信息見表1。

表1 內(nèi)蒙古地區(qū)92 份參試綠豆品種信息Table 1 Information about 92 mungbean varieties in different regions of Inner Mongolia

續(xù)表1

植物基因組DNA提取試劑盒、dNTPs、Taq酶、Mg2+、Buffer、瓊脂糖、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量等均購于北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 SSR引物

10 對(duì)SSR引物均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，普通引物由上海生工生物工程公司合成；熒光標(biāo)記引物由美國(guó)ABI公司合成，在正向引物上加注的熒光染料分別是5’HEX（綠色）、5’FAM（藍(lán)色）和5’TMRA（黃色），見表2。

表2 10 對(duì)SSR引物信息Table 2 Information about 10 pairs of SSR primers

1.3 儀器與設(shè)備

ABI Prism 3730XL型基因分析儀 上海艾研生物科技有限公司；WD-9402C基因擴(kuò)增儀 北京六一生物科技有限公司；QT-88A智能核酸蛋白檢測(cè)儀 上海琪特分析儀器有限公司；2-16PK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Alpha凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)ProteinSimple公司；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái) 上海皓莊儀器有限公司；SANyO SIM-F14全自動(dòng)制冰機(jī) 上海迭戈生物科技有限公司；LDZX-40B立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋河北藍(lán)夢(mèng)生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取

取室溫條件下種植12 d左右的新鮮嫩葉，液氮環(huán)境中用球磨機(jī)打碎成粉狀，采用改良后的CTAB法[19]提取DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，用QT-88A智能核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度，并稀釋成30 ng/μL于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

PCR體系為20 μL，包括30 ng/μL DNA模板2 μL，2 μmol/L引物0.6 μL、2.5 U/μL Taq酶0.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、20 mmol/L MgCl21 μL、Buffer 2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。

1.4.3 毛細(xì)管電泳

將甲酰胺與分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10 倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對(duì)測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置作比較分析，得到片段大小。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用POPGENE version 1.32[20]軟件計(jì)算平均觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)百分率、期望雜合度、觀察雜合度、擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量、遺傳相似度?；谶z傳相似度，采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法對(duì)各種群進(jìn)行聚類分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

如表3所示，10 對(duì)SSR引物在92 份綠豆品種中共擴(kuò)增出58 個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)變幅為3～10 個(gè)不等，平均為5.8 個(gè)。其中，引物CEDG156檢測(cè)到的等位變異最多，為10 個(gè)，而引物P3-581、P3-627和CEDG178檢測(cè)到的等位基因數(shù)最少，僅為3 個(gè)。10 對(duì)引物共檢測(cè)到28.38 個(gè)有效等位基因，占48.9%。多態(tài)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)變幅介于1.64～4.98中間，平均為2.58。不同引物揭示的多態(tài)信息含量變幅介于0.371 4～0.773 7，平均為0.52，其中引物CEDG048、CEDG154、CEDG156、CEDG228、CEDG244多態(tài)性較高，多態(tài)信息含量均大于0.5，為高度多態(tài)性位點(diǎn)，而其余5 對(duì)引物均為中度多態(tài)性位點(diǎn)（0.25＜多態(tài)信息含量＜0.5）。Nei’s基因多樣性變幅介于0.388 8～0.799 2之間，平均為0.575 2。Shannon信息指數(shù)變幅范圍介于0.700 4～1.779 7之間，平均為1.140 0。觀察雜合度變幅介于0.804 3～1.000 0之間，平均為0.896 0。期望雜合度變幅介于0.390 9～0.803 7之間，平均為0.578 4。引物CEDG244和CEDG048無論觀測(cè)從等位基因數(shù)目（僅次于CEDG156，為8和7）還是多態(tài)信息含量（0.773 7和0.649 6）來看，均較高，因此它們將是內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆遺傳多樣性分析研究中的骨干引物。

表3 10 對(duì)SSR引物多態(tài)性信息Table 3 Information about genetic diversity of 92 mungbean germplasms based on 10 SSR

2.2 遺傳相似性分析

圖1 遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布Fig. 1 Genetic similarity distribution

依據(jù)10 對(duì)SSR引物在92 份內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源中檢測(cè)到的58 個(gè)等位基因，利用NTSySpc2.0統(tǒng)計(jì)分析軟件按Nei的方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)材料間的遺傳相似系數(shù)，共獲得遺傳相似系數(shù)4 278 個(gè)，92 份綠豆種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)變幅介于0.033 4～1.000 0之間，平均為0.46。其中昭烏達(dá)盟綠豆（C0623）與準(zhǔn)格爾旗綠豆（C3784）的遺傳相似系數(shù)最小，為0.033 4，說明二者遺傳相似性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；昭烏達(dá)盟小綠豆（C0628）與烏蘭察布綠豆（C0641）和烏蘭察布綠豆（C0643）與烏蘭察布綠豆（C0641）的遺傳相似系數(shù)較大，為0.983 3，說明彼此間遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近。以0.1為組距，對(duì)4 278 個(gè)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行次數(shù)分布分析，如圖1所示。參試材料的遺傳相似系數(shù)近似呈正態(tài)分布，有2 928 個(gè)遺傳相似系數(shù)在0.21～0.60之間，占全部數(shù)據(jù)的68.4%；有435 個(gè)在0.2以下，占全部數(shù)據(jù)的10.2%；有489 個(gè)在0.7以上，占所有數(shù)據(jù)的21.4%。結(jié)果表明內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性相對(duì)較高，但也存在一定程度的近交現(xiàn)象。

2.3 聚類分析

圖2 基于SSR標(biāo)記的92 份綠豆聚類分析Fig. 2 Dendrogram of 92 mungbean varieties generated by SSR markers

通過UPGMA法利用遺傳相似系數(shù)對(duì)92 份內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源材料進(jìn)行聚類分析，如圖2所示。在遺傳相似系數(shù)為0.294 4時(shí)，可將92 份綠豆種質(zhì)分為2 個(gè)類群。第1類群由76 份種質(zhì)組成，其余16 份種質(zhì)聚集在第2類群。在遺傳相似系數(shù)為0.412 0時(shí)，可將第1類群分為4 個(gè)亞群。第1個(gè)亞群包括綠豆（C0601）、綠豆（C0618）、大綠豆（C3768）、綠豆（C3766）、小綠豆（C0612）、小綠豆（C3767）和綠豆（C3776）共7 份綠豆種質(zhì)；第2個(gè)亞群包括65 個(gè)綠豆種質(zhì)。在遺傳相似系數(shù)為0.576 6時(shí)，可將第2個(gè)亞群分成7 個(gè)小組。第1個(gè)小組包括29 份種質(zhì)，其中來自內(nèi)蒙古中部地區(qū)（烏蘭察布、東勝、呼和浩特）的綠豆種質(zhì)17 份，來自內(nèi)蒙古東部地區(qū)（哲里木盟、興安盟、昭烏達(dá)盟）的綠豆種質(zhì)10 份，僅小綠豆（C0640）來自內(nèi)蒙古西南部地區(qū)的伊克昭盟，未知來源的小綠豆（C0603）與來源于哲里木盟的吉豆（C0620）聚在一起，推測(cè)其可能也來源于哲里木盟或者內(nèi)蒙古東部其他地區(qū)；第2小組包括12 份綠豆種質(zhì)，除了C0633等4 份來自昭烏達(dá)盟的種質(zhì)外，其余均來自內(nèi)蒙古中部呼和浩特市附近；第3小組包括16 份綠豆種質(zhì)，其中除綠豆（C0607）和綠豆（C3755）分別來自內(nèi)蒙古北部地區(qū)呼倫貝爾和中部呼和浩特外，其余所有品種均來自內(nèi)蒙古東部地區(qū)；第4、5、6、7小組分別由綠豆（C0610）、小綠豆（C0630）、小綠豆（C0634）、灰皮綠豆（C3778）和綠豆（C0614）、大八角（C0637）和小明綠豆（C0638）、小綠豆（C0656）以及灰皮綠豆（C3765）、綠豆（C3758）、小綠豆（C3773）組成。第2亞群包括16 份綠豆種質(zhì)，其中除小綠豆（C0628）和小綠豆（C0631）來自昭烏達(dá)盟外，其余所有品種均來自內(nèi)蒙古中部地區(qū)，未知來源的小綠豆（C0602）與來自準(zhǔn)格爾旗的明綠豆（C3783）聚在一起，推測(cè)其可能也來源于內(nèi)蒙古中部地區(qū)。第3個(gè)亞群包括3 份綠豆種質(zhì)，即灰皮綠豆（C3765）、綠豆（C3758）和小綠豆（C3773）單獨(dú)聚為一類；第4亞群僅包含1 份種質(zhì)，即綠豆（C3779），說明該品種與其他材料間的基因交流較少，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.4 SSR指紋圖譜及分子身份證構(gòu)建

表4 92 個(gè)綠豆品種在10 個(gè)SSR位點(diǎn)的指紋數(shù)據(jù)Table 4 Fingerprint data at 10 SSR loci of 92 mungbean varieties

續(xù)表4

續(xù)表4

圖3 綠豆（C0627）（A）和小綠豆（C0628）（B）在位點(diǎn)P3-581座位上的毛細(xì)管電泳峰圖Fig. 3 SSR fingerprint patterns of mungbean varieties C0627 (A) and C0628 (B) using primer P3-581

利用10 對(duì)核心引物對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)92 份綠豆品種進(jìn)行擴(kuò)增，準(zhǔn)確獲得不同材料在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小及相應(yīng)的毛細(xì)管電泳圖，如表4、圖3所示。例如小綠豆（C0648）在SSR位點(diǎn)P3-581的擴(kuò)增片段為165 bp和168 bp。按表2的引物順序，即P3-581、P3-627、CEDG006、CEDG010、CEDG048、CEDG154、CEDG156、CEDG178、CEDG228、CEDG244將每對(duì)引物在92 份參試綠豆品種中擴(kuò)增出的等位基因按片段大小升序排列，依次編號(hào)。將每個(gè)樣品在10 對(duì)引物上擴(kuò)增條帶的數(shù)據(jù)串聯(lián)起來，即得到由至少10 位數(shù)字或字母（有雜合帶時(shí)則多于10 位）組成的分子身份證。如綠豆（C0601）的分子身份證為2152723326，第1個(gè)數(shù)字是“2”，即綠豆（C0601）在1號(hào)引物P3-581上擴(kuò)增出在片段排列中排位第2的片段，其余9位依此類推。92份參試綠豆品種的分子身份證如表5所示。

表5 92 份綠豆品種的分子身份證Table 5 List of digital molecular identifications of 92 mungbean accessions

3 討 論

SSR標(biāo)記因其多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)在農(nóng)作物遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建中廣泛應(yīng)用[22-24]。王麗俠等[25]利用28 對(duì)小豆SSR引物分析60 份綠豆種質(zhì)，檢測(cè)到的等位變異數(shù)變幅范圍為2～7 個(gè)，平均為2.9，多態(tài)信息含量變幅范圍為0.02～0.69，平均為0.36；Wang Xiaoqiang等[26]利用15 對(duì)引物分析65 份綠豆種質(zhì)的遺傳多樣性，共擴(kuò)增出47 個(gè)變異位點(diǎn)，每對(duì)引物擴(kuò)增出2～6 個(gè)變異位點(diǎn)不等，平均多態(tài)信息含量為0.28。而本研究利用10 對(duì)SSR引物對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)的92 份綠豆種質(zhì)進(jìn)行分析，得到的平均等為基因數(shù)（5.8）和平均多態(tài)信息含量（0.52）明顯優(yōu)于前人的研究，說明選取的核心引物多態(tài)性較豐富，在綠豆種質(zhì)研究中表現(xiàn)出較大潛力。

遺傳相似性分析結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)平均值為0.46，小于0.5的遺傳相似系數(shù)占整個(gè)數(shù)據(jù)的62.8%，說明內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種的遺傳多樣性水平相對(duì)較豐富，與任紅曉等[17]分析中國(guó)北方名優(yōu)綠豆品種時(shí)得到北方參試地區(qū)中內(nèi)蒙古是綠豆資源最豐富地區(qū)的結(jié)果相符。但大于0.7的遺傳相似系數(shù)占整個(gè)數(shù)據(jù)的21.4%，其中10 組（22 個(gè)）品種間的遺傳相似系數(shù)為1.00，考慮這幾組品種的遺傳背景相同，但不排除“同種異名”現(xiàn)象，同時(shí)也說明內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源存在一定程度的近交現(xiàn)象，個(gè)別品種在DNA水平上差異較小，親緣關(guān)系較近。原因可能是內(nèi)蒙古是春綠豆的主栽區(qū)，一些優(yōu)良品種由于長(zhǎng)時(shí)間的自然馴化、地區(qū)間資源共享，導(dǎo)致遺傳變異率降低，遺傳基礎(chǔ)狹窄，多樣性水平降低。因此，在今后的育種工作中應(yīng)加大引進(jìn)省外或國(guó)外的綠豆材料以拓寬內(nèi)蒙古地區(qū)的遺傳背景。

聚類分析發(fā)現(xiàn)，各組內(nèi)聚類均呈現(xiàn)出一定的地域相關(guān)性，即地域相近或緯度相近地區(qū)材料間遺傳關(guān)系較近，來自同一地理區(qū)域的品種聚在一起的機(jī)率比較大。如第2亞群第3小組的16 份種質(zhì)中有14 份來自內(nèi)蒙古東部地區(qū)，其中來自哲里木盟和昭烏達(dá)盟的種質(zhì)各自聚在一起；來自昭烏達(dá)盟的綠豆種質(zhì)除小綠豆（C0628）和小綠豆（C0631）外，其余均聚為一類，其他地區(qū)種質(zhì)也呈現(xiàn)相類似的情形，如呼和浩特的6 份種質(zhì)、包頭的3 份種質(zhì)均被聚在相同類群中。此外，不同地區(qū)來源品種間也存在相互聚集的情況，如第1亞群中的7 份種質(zhì)分別來自哲里木盟、土默特旗等7 個(gè)不同地區(qū)，體現(xiàn)出內(nèi)蒙古綠豆種質(zhì)可能來源于共同的祖先以及品種之間較近的親緣關(guān)系，或在基因進(jìn)化的過程中，不同地理來源的品種為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生了一定的基因交流?？梢奡SR分子標(biāo)記技術(shù)能夠在一定程度上反映品種的地理來源情況，來自相同地理?xiàng)l件和生態(tài)環(huán)境的種質(zhì)在分子水平上的遺傳相似度較高。但從遺傳距離分析，地理來源不同的品種遺傳距離卻比較相近，如興安盟綠豆（C0611）和伊克昭盟小綠豆（C0640）2 個(gè)品種間的遺傳距離為0，土默特旗灰綠豆（C3770）和東勝市綠豆（C3781）遺傳距離為0.223 1。來源不同的綠豆品種地理距離遠(yuǎn)而遺傳距離卻比較相近，這可能與品種具有相似的環(huán)境條件或常年引種及相近的選擇標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

DNA指紋圖譜能夠在分子水平上反映出生物個(gè)體間差異，多態(tài)性豐富、環(huán)境穩(wěn)定性強(qiáng)，在品種真?zhèn)舞b定、種權(quán)保護(hù)、產(chǎn)地溯源研究中發(fā)揮重要作用[27-30]。本研究將10 個(gè)SSR標(biāo)記擴(kuò)增的電泳結(jié)果按照一定規(guī)律制成類似于人類指紋的圖譜即SSR指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)化即形成了分子身份證，具有高度的遺傳穩(wěn)定性及個(gè)體特異性，對(duì)綠豆品種真?zhèn)舞b定及身份識(shí)別具有重要意義。然而本研究中選用的10 對(duì)核心引物并未將參試的92 個(gè)品種完全區(qū)分開，少數(shù)品種的指紋圖譜及分子身份證不具備唯一性。究其原因，一方面可能是由于綠豆種質(zhì)的基因組結(jié)構(gòu)特性決定的；另一方面可能是因?yàn)榫G豆種質(zhì)研究起步較晚，多態(tài)性引物的開發(fā)還不夠全面，目前公開的綠豆SSR引物多態(tài)性水平較低，鑒別能力較弱，同時(shí)也可能是因?yàn)閰⒃嚻贩N全部來自內(nèi)蒙古地區(qū)，品種間遺傳背景相似，甚至在長(zhǎng)期的發(fā)展種植過程中出現(xiàn)“同種異名”情況。

4 結(jié) 論

本研究利用10 對(duì)SSR引物對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)92 份綠豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平上揭示了內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種的遺傳多樣性，初步明確了現(xiàn)階段內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平，為內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新提供參考；構(gòu)建了92 份綠豆品種的SSR指紋圖譜及分子身份證，為綠豆品種真?zhèn)舞b定提供理論基礎(chǔ)，對(duì)綠豆品種溯源管理及原產(chǎn)地保護(hù)具有重要意義。研究結(jié)果表明，雖然內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆種質(zhì)資源多樣性相較豐富，但仍存在一定程度的近交現(xiàn)象，因此今后的研究一方面要加大對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)質(zhì)綠豆資源的收集及保存，保護(hù)資源的遺傳多樣性；另一方面需加強(qiáng)種質(zhì)創(chuàng)新，引進(jìn)和利用其他地區(qū)豐富的綠豆種質(zhì)資源，拓寬綠豆育種的遺傳基礎(chǔ)。

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Genetic Diversity Analysis and DNA Fingerprint Construction Based on Fluorescent Labeled SSR Markers for Mungbean Varieties (Vigna radiate L.) from Inner Mongolia

ZHAO yanan1, WANG ying1,2, ZHANG Dongjie1,*, WANG Lixia3,*, ZUO Zhaohang1(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China; 3. Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Objective: The aim of this study was to analyze the genetic diversity of mungbean varieties from Inner Mongolia region and to establish a simple sequence repeat (SSR) fingerprinting database for providing scientific evidence to explore the genetic background of mungbean germplasms and authenticate mungbean varieties. Methods: A total of 92 mungbean varieties from Inner Mongolia area were taken to establish their genetic diversity and DNA fingerprint maps by using 10 pairs of SSR primers. Results: A total of 58 alleles were detected, and each pair of primers detected 3–10 alleles with an average of 5.8. The genetic diversity coefficients among the 92 mungbean varieties varied from 0.033 4–1.000 0 with an average of 0.46. Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) clustering analysis showed that these mungbean varieties were clustered into 2 groups at theof genetic similarity coefficient of 0.294 4. SSR fingerprinting database and molecular identification of the 92 mungbean cultivars were established, and it was found that most of the tested varieties, with different SSR fingerprints, which could be molecularly discriminated from each other, could serve as cultivars-specific patterns and as an important basis for cultivar identification. Conclusions: There was a high level of genetic diversity among mungbean germplasms from Inner Mongolia, but a certain degree of inbreeding also existed. Therefore, further efforts are needed to develop new mungbean breeding materials. SSR fingerprinting and molecular identification using fluorescent labeled SSR marker technique is of great significance for genetic authentication, identity validation, traceability management and origin protection of mungbean varieties.

10.7506/spkx1002-6630-201716007

S522

A

1002-6630（2017）16-0043-08

2017-01-08

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B02）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開發(fā)重大項(xiàng)目（GA14B104）；

大慶科技局創(chuàng)新項(xiàng)目（sjh-2013-65）；黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2017-Y50）

趙雅楠（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zyn658@163.com

*通信作者：張東杰（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：byndzdj@126.com

王麗俠（1972—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭秤枚狗N質(zhì)資源。E-mail：wanglixia03@caas.cn

趙雅楠, 王穎, 張東杰, 等. 內(nèi)蒙古地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性SSR分析及DNA指紋圖譜構(gòu)建[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 43-50. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716007. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yanan, WANG Ying, ZHANG Dongjie, et al. Genetic diversity analysis and DNA fingerprint construction based on fluorescent labeled SSR markers for mungbean varieties (Vigna radiate L.) from Inner Mongolia[J]. Food Science, 2017, 38(16): 43-50. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716007. http://www.spkx.net.cn

Key words: fluorescent labeled SSR markers; mungbean varieties; genetic diversity analysis; fingerprint construction