黃欽耿，梁 玲，陳巧紅，吳松剛，黃建忠*

小菜蛾moricin在畢赤酵母中的表達及抑菌活性分析

黃欽耿，梁 玲，陳巧紅，吳松剛，黃建忠*

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108）

抗生素的過度使用給自然生態(tài)帶來諸多不利影響，尋找合適的抗生素的替代物，從而減少抗生素的使用正成為當(dāng)下的研究熱點。以來自于小菜蛾的特異性抗菌肽moricin為研究對象，研究其酵母異源表達水平和抑菌性能及生化特性，為進一步的開發(fā)利用提供理論支持。根據(jù)已有的小菜蛾抗菌肽moricin特異性基因信息，采用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增其成熟肽基因mor-3，并克隆至pGAPZα A質(zhì)粒中，構(gòu)建組成型分泌表達載體pGAPZα A-mor3，線性化片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168菌株，高質(zhì)量濃度Zeocin篩選獲得高拷貝重組轉(zhuǎn)化子。以yPD為培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，重組蛋白獲得高效表達，分子質(zhì)量約為5 kD，與理論預(yù)測的基本一致；發(fā)酵60 h，上清液中重組蛋白表達量達248.98 mg/L，而且耐熱性能良好，同時具備較強的耐強酸及強堿的能力，特別在強酸環(huán)境中活性保持穩(wěn)定，體現(xiàn)了較好的機體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性潛力；對部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有抑菌作用，特別是對革蘭氏陰性菌具備特異性較強的抑制作用，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為6.25 μg/mL，而對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度僅為124.49 μg/mL。獨特的抑菌性能和理化特點，使其具備廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景及良好的社會與環(huán)保效益。

抗菌肽；moricin；畢赤酵母；高效表達；抑菌活性；生化特性

抗菌肽是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的天然免疫的重要介質(zhì)，是宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，在生物體遭受外界異物刺激或病原微生物感染時能夠快速產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽[1-2]?？咕牡膩碓捶浅V泛，而且種類繁多，功能多樣，自1962年Kiss等[3]首次從鈴蟾皮膚分泌物中分離出鈴蟾抗菌肽以來，短短幾十年中，在植物、微生物、昆蟲、兩棲類以及哺乳動物等中已發(fā)現(xiàn)和鑒定抗菌肽一千多種，其中昆蟲來源的抗菌肽已經(jīng)超過兩百種[4-8]?？咕膶τ诩毦?、真菌、原蟲、病毒等具有非特異性的抑制作用，能抑殺癌變細胞，而且可作為免疫效應(yīng)分子來啟動、調(diào)節(jié)生物體的一系列免疫反應(yīng)[2,4,9-10]。另外，抗菌肽殺菌機制與傳統(tǒng)抗生素不同，多數(shù)抗菌肽通過細胞膜電荷的區(qū)別進行選擇性殺傷，所以其對正常哺乳動物細胞幾乎無毒性，而且由于細胞膜具有的高度保守性，故耐藥的產(chǎn)生尤其困難甚至幾乎不可能，被認為是一類天然的肽類抗生素[11-13]。也正是由于抗菌肽獨特的抗菌機理、高效廣譜的抑菌活性以及綠色安全的特性，使其成為最具開發(fā)前景的新型抗菌藥物[14-15]。隨著對抗菌肽作用機理及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的不斷深入，在抗生素廣泛及過度使用且已引起一系列不利情況的今天，抗菌肽越來越顯示出了其在藥物開發(fā)、食品工業(yè)、植物抗病及飼料科學(xué)等領(lǐng)域的獨特應(yīng)用價值[8,16-18]，特別是在推行無抗養(yǎng)殖、保證食品健康的過程中，抗菌肽的應(yīng)用研究更是備受青睞。

由于天然抗菌肽的表達量低、提取過程復(fù)雜，導(dǎo)致難以大量獲得；而化學(xué)合成的成本高、價格昂貴，且對多數(shù)微生物宿主存在一定的毒性，這也導(dǎo)致抗菌肽的規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用一直受到制約。所以，選用合適宿主，利用基因工程手段進行抗菌肽異源表達的研究一直備受關(guān)注[19]。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻譯及后修飾功能完善以及便于培養(yǎng)等特點，使得其表達體系成為抗菌肽代謝工程研究中應(yīng)用最為廣泛和重要的表達體系之一[20-22]。

本實驗以蛋白酶缺陷畢赤酵母（Pichia pastoris）菌株SMD1168為宿主，采用pGAPZα A質(zhì)粒為模板構(gòu)建真核表達載體，將特異性的小菜蛾抗菌肽moricin的成熟肽基因整合至畢赤酵母基因組中，利用GAP啟動子及α-factor分泌信號肽進行組成型分泌表達，以期獲得具有抗菌活性功能的重組蛋白，并對其相關(guān)抗菌性能及生化特性進行研究，為進一步開發(fā)特異性抗生素替代物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10F’、E. coli CMCC44103、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923，由工業(yè)微生物教育部工程研究中心保存。

P. pastoris SMD1168、表達載體pGAPZα A 美國Invitrogen公司；pMD19-T Simple vector 日本TaKaRa公司；含特異性小菜蛾抗菌肽moricin完整基因序列的重組質(zhì)粒pEASY-mor由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所提供。

1.1.2 工具酶和試劑

pfu Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶AvrⅡ、EcoRⅠ、KpnⅠ、小牛腸堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP）、DNA ligation kit、DNA ladder Marker、預(yù)染低分子質(zhì)量蛋白Marker 日本TaKaRa公司；博來霉素（Zeocin，pGAPZα A載體自帶的選擇性標記） 美國Sigma公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、Tricine、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母粉 生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海美季生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 引物設(shè)計與合成

moricin成熟肽基因聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）上下游引物均帶有酶切位點和保護堿基，而且上游引物中融合起始密碼子ATG，具體如下：

mor3-F：5’-CGGAATTCCGGCGCCCAAGGTCAAC GTC-3’（劃線部分為EcoRⅠ酶切位點）

mor3-R：5’-GGGGTACCCCCTACCCCTGGTTCCT-3’（劃線部分為KpnⅠ酶切位點）

同時，合成一對驗證引物：Alpha-F：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’AOX1-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，調(diào)pH值至7.0，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

LLB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基NaCl添加量減半，調(diào)pH值至7.5。

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，pH值自然，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

YPDS培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、1 mol/L山梨醇，pH值自然，蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 美國Applied Biosystems公司；電轉(zhuǎn)化儀、光密度掃描儀 美國Bio-Rad公司；自動凝膠圖像分析儀 上海培清科技有限公司；離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；核酸及蛋白電泳儀 北京市六一儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 特異性抗菌肽moricin3成熟肽基因mor-3的擴增及純化

采用mor3-F/R為引物對，以pEASy-mor質(zhì)粒為模板，采用pfu Taq DNA聚合酶按如下體系進行PCR擴增：10×pfu Buffer 5 μL、mor3-F與mor3-R各2 μL、模板0.5 μL（約50 ng）、酶1 μL，加ddH2O補至50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃條件下保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將其目的條帶割膠回收、純化并進行測序驗證。

1.3.2 重組表達載體pGAPZα A-mor3的構(gòu)建

對PCR回收產(chǎn)物及抽提的pGAPZα A空載體分別進行EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切，分別回收酶切的目的基因及載體片段，然后進行T4 DNA連接酶連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli TOP10F’感受態(tài)細胞，采用LLB（含50 μg/mL Zeocin）平板進行抗性篩選，并用驗證引物進行菌液PCR陽性重組子鑒定，送交上海生工測序驗證。

1.3.3 重組表達載體pGAPZα A-mor3轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168

將獲得的重組載體用AvrⅡ線性化并進行回收后，取20 μL線性化的載體與80 μL的畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細胞混合，冰中放置30 min后，電轉(zhuǎn)儀（電壓2 000 V、電容25 μF）電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化后的SMD1168細胞涂布含100 μg/mL Zeocin的YPDS平板，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。單克隆出現(xiàn)后，采用煮沸-凍融法進行菌落PCR驗證，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子。同時，采用含100～300 μg/mL的Zeocin的YPDS平板進行mor-3基因多拷貝整合的篩選，用于獲得高效表達特異性抗菌肽moricin3的重組菌株。

1.3.4 重組菌目的蛋白的組成型表達

挑取抗高質(zhì)量濃度Zeocin的克隆，于裝有30 mL YPD液體培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，至OD600nm為3～4時，按20%移種量（10 mL種子液轉(zhuǎn)接于40 mL YPD培養(yǎng)基中）轉(zhuǎn)接，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)60 h，收集上清液。采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定上清液中的總蛋白濃度。采用光密度掃描儀掃描十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠中目的條帶所占總蛋白百分比，計算上清液中重組蛋白的表達量。采用Tricine-SDS-PAGE（16.5%分離膠、10%成層膠、4%積層膠）分析產(chǎn)物分泌表達情況。

1.3.5 重組菌發(fā)酵上清液的抗菌活性分析及最低抑菌濃度的測定

采用改良的瓊脂孔穴擴散法[23]進行抗菌活性的分析。分別接種S. aureus ATCC25923和E. coli CMCC44103的斜面，并制備菌懸液，其OD600nm為10；然后，取0.4 mL菌懸液至70 mL、50 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻后，倒入21 cm×14 cm×0.3 cm的玻璃平板的長方體槽內(nèi)，靜置冷卻至完全凝固，放入白瓷盒內(nèi)。用滅菌的打孔器（直徑8 mm）打孔，每孔加入20 μL重組菌發(fā)酵表達上清液，同時加入等體積的pGAPZα A空載體轉(zhuǎn)化的SMD1168細胞表達上清液和原始SMD1168細胞表達上清液為陰性對照，加入5 μL 100 mg/mL Amp為陽性對照，加樣后，小心地將白瓷盒移入4 ℃冰箱放置2 h。將含有待測樣品的玻璃平板轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，觀察并測量抑菌圈直徑。采用管碟法測定重組菌表達上清液的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[24]。

1.3.6 重組菌發(fā)酵上清液的溫度及酸堿敏感性分析

溫度耐受性分析：將重組菌發(fā)酵上清液分別沸水浴處理10、20、30 min，以未處理為對照組，分別檢測不同處理樣品對E. coli CMCC44103抑菌活性。

酸堿敏感性分析：取相同體積的重組菌發(fā)酵上清液分別用1 mol/L的HCl或NaOH溶液處理10、20、30 min，作用結(jié)束后，分別用等體積1 mol/L的NaOH或HCl溶液進行中和，以未經(jīng)處理的重組菌上清液為對照，測定不同處理方式、不同處理時間的樣品對E. coli CMCC44103的抑菌活性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟肽基因mor-3的克隆及鑒定

圖1 成熟肽mor-3基因的PCR擴增Fig. 1 PCR Amplification of mor-3 gene

以pEASY-mor質(zhì)粒為模板，PCR擴增成熟肽基因mor-3，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，獲得大小約為100 bp的單一條帶，與預(yù)測的條帶大?。?29 bp）基本一致（圖1）。PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示，成熟肽基因總長度129 bp（含終止密碼子），可編碼42 個氨基酸與從小菜蛾基因組中克隆的另外2 個moricin的成熟肽基因存在3 個氨基酸的突變，分別位于成熟肽的第10位（R10K）、14位（R14H）、17位（R17K），其與pEASY-mor完整基因的成熟肽序列完全一致，說明抗菌肽moricin3的成熟肽基因（mor-3）克隆成功。

2.2 表達載體pGAPZα A-mor3的構(gòu)建與鑒定

圖2 重組載體的菌落PCR驗證Fig. 2 Identification of recombinant plasmids by colony PCR

圖3 表達載體pGAPZαA-mor3的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pGAPZ α A-mor3 by restriction enzyme digestion

分別回收EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切的mor-3基因片段與空載體pGAPZα A，連接轉(zhuǎn)化后，對抗性平板獲得的單克隆以Alpha-F/AOX1-R為引物對進行菌落PCR驗證，同時以空載體pGAPZα A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為陰性對照（理論大小約為265 bp），陽性克隆大小約為400 bp，與理論預(yù)測大?。?94 bp）基本一致（圖2）。挑取陽性克隆進行質(zhì)粒抽提，并進行EcoRⅠ單酶切及EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切的驗證，同時，以pGAPZα A質(zhì)粒為陰性對照進行同樣的酶切，電泳結(jié)果顯示：陽性克隆雙切出現(xiàn)大小分別為129 bp與3 100 bp的條帶，單酶切出現(xiàn)約為3 200 bp單一條帶，而pGAPZα A質(zhì)粒單酶切和雙酶切均只有一條帶。結(jié)果說明，重組表達載體pGAPZα A-mor3構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 重組菌酵母組成型表達及重組蛋白表達量的確定

圖4 重組菌上清液的Tricine-SDS-PAGE分析Fig. 4 Analysis of culture supernatant of recombinant P. pastoris by Tricine-SDS-PAGE

參考Tricine-SDS-PAGE說明書，重組菌的發(fā)酵上清液得到較好的分離，結(jié)果顯示，在重組菌上清液中分子質(zhì)量約為5.0 kD的蛋白獲得表達，而且其與預(yù)測的抗菌肽蛋白分子質(zhì)量（4.7 kD）基本一致，原始SMD1168菌株及線性化空載體pGAPZα A轉(zhuǎn)化的SMD1168菌株在相應(yīng)位置均無明顯亮帶。表明重組蛋白在畢赤酵母SMD1168成功獲得表達（圖4），以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標，OD595nm為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線方程：y＝0.020 4x+0.314 9（R2為0.996 7）。發(fā)酵60 h上清液樣品，稀釋20 倍，測得OD595nm為0.953，經(jīng)光密度掃描儀掃描目的蛋白占總蛋白的比例為39.8%，計算得到重組moricin3蛋白的表達量為248.98 mg/L。

2.4 重組蛋白的抑菌活性分析及最低抑菌濃度測定

圖5 重組菌上清液對E. coli CMCC44103（a）及S. aureus ATCC25923（b）的抑菌活性檢測Fig. 5 Antibacterial activity of culture supernatant of recombinant P. pastoris against E. coli (a) and S. aureus (b)

采用改良瓊脂擴散法進行抑菌活性的檢測，圖5結(jié)果顯示：重組菌表達的moricin3抗菌肽對革蘭氏陰性菌——E. coli CMCC44103體現(xiàn)了非常好的抑菌活性，能夠形成較大的、清晰明確的抑菌圈，發(fā)酵60 h，上清液抑菌圈直徑最大，達到19.3 mm（圖5a中5號孔）；而對革蘭氏陽性菌——S. aureus ATCC25923抑菌活性則較差，抑菌圈較小，而且抑菌圈邊緣模糊，最大抑菌圈直徑也為發(fā)酵60 h后的上清液，僅為5.3 mm（圖5b中5號孔）。

采用管碟法測定重組菌上清液表達的抗菌肽moricin3對E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC值。結(jié)果顯示：抗菌肽moricin3對E. coli CMCC44103的MIC值為6.25 μg/mL，體現(xiàn)了較強的抑菌效果；抗菌肽moricin3對S. aureus ATCC25923的MIC值為124.49 μg/mL。

2.5 重組菌上清液中表達的抗菌肽moricin3對溫度及酸堿的耐受特性分析

表1 高溫及酸堿對重組菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響Table 1 Effects of high temperature and acid-base on antibacterial activity of culture supernatant of recombinant strain

將重組菌表達上清液分別沸水浴和1 mol/L的HCl及NaOH溶液處理10、20、30 min，同時，以未處理的重組菌發(fā)酵上清液為陽性對照，采用改良的瓊脂擴散法測定處理樣品對E. coli CMCC44103的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示：沸水浴處理對重組菌發(fā)酵上清液對E. coli CMCC44103的敏感性影響不大，抑菌圈直徑無明顯差別，表明重組菌上清液中表達的moricin3具有一定的耐高溫性能，體現(xiàn)了較好的熱穩(wěn)定性。另外，1 mol/L HCl處理10、20、30 min對重組菌發(fā)酵上清液的抑菌活性基本沒有影響，處理30 min，活性仍保持95%以上（表1），說明抗菌肽moricin3具有較好的耐酸能力，而且在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定；不同的是，同樣濃度的NaOH溶液處理10 min，moricin3的抑菌活性仍能保持近95%，達到94.8%，但當(dāng)處理時間延長，其抑菌活性顯著下降，處理20 min，抑菌圈直徑減少2.6 mm，抑菌活性降低至86.5%，處理時間達到30 min，抑菌圈直徑減少6.1 mm，抑菌活性大幅度降低，僅為未處理對照的68.4%（表1），說明重組菌上清液中的moricin3雖具備一定的耐受強堿性能，但在強堿性環(huán)境中的抑菌活性隨處理時間呈明顯下降趨勢，說明在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差。

3 討 論

一般生物體自然條件表達和分泌的抗菌肽的含量非常低，直接從體內(nèi)獲得天然抗菌肽的成本非常高昂，而且過程繁瑣?；瘜W(xué)合成的技術(shù)難度大，而且活性往往得不到保證。利用基因工程技術(shù)，采用細菌或酵母生產(chǎn)抗菌肽就體現(xiàn)了具大的優(yōu)勢，特別是酵母表達體系，其遺傳背景清晰，便于利用基因工程手段對進行理性化的改造獲得更具特性的抗菌肽產(chǎn)品，而且發(fā)酵條件簡單，適合高密度發(fā)酵，非常適合工業(yè)化的生產(chǎn)、純化或是制備含有獨特抗菌機制抗菌肽的飼用酵母微生態(tài)制劑。moricin為強堿性抗菌肽，由42 個氨基酸組成，是一種雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性多肽，具有廣譜的抗菌活性，最早由Hara和yamakawa于1995年在家蠶中發(fā)現(xiàn)[25]，如今，moricin已經(jīng)從其他多個鱗翅目昆蟲中被發(fā)現(xiàn)[26-27]。在鱗翅目昆蟲中，家蠶的天然免疫系統(tǒng)是研究最清楚的[28-30]，在抗菌肽moricin方面也有比較多的報道，同樣為鱗翅目昆蟲，關(guān)于小菜蛾抗菌肽，特別是moricin抗菌肽的研究報道卻比較少。

本研究在前期相關(guān)基因鑒定的基礎(chǔ)上[27,31]，從小菜蛾基因組中克隆到一個具有廣譜抗菌活性的moricin家族抗菌肽moricin-3基因，其較從小菜蛾基因組中獲得的此家族的另外兩個抗菌肽moricin-1與moricin-2基因相比，其成熟肽基因有3 個氨基酸的突變，這些氨基酸差異直接導(dǎo)致了其在凈電荷、等電點及疏水性等理化性質(zhì)的不同，而這可能對其抗菌譜及抑菌性能都有影響。

抗菌肽分子作為一類多肽，宿主本身具備的蛋白酶對其表達量及穩(wěn)定性都有較大影響[32-33]，鑒于此，本研究采用蛋白酶缺陷型酵母SMD1168為宿主，以非誘導(dǎo)型分泌質(zhì)粒pGAPZα A為載體，將moricin3成熟肽整合至宿主染色體中，并通過高質(zhì)量濃度Zeocin（300 μg/mL）抗性篩選高拷貝重組菌，實現(xiàn)了目的基因的高效分泌表達，重組菌發(fā)酵上清液中表達量達248.98 mg/L。采用改良的瓊脂擴散法，對重組菌發(fā)酵上清液進行了抑菌活性檢測，對E. coli與S. aureus都有抑菌活性，實驗室條件限制，未能進行更廣泛的檢菌測定，但其仍表現(xiàn)了較為廣譜的抗菌潛力，特別是對于革蘭氏陰性菌，其對E. coli的MIC值是對革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌的近二十分之一。不僅如此，重組菌表達的小菜蛾抗菌肽moricin3具備非常好的熱穩(wěn)定性及酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，這不僅對小菜蛾抗菌肽moricin3后續(xù)的動物實驗、抗菌機理及小菜蛾自身免疫機制等研究具有重要意義，也使得其非常具有開發(fā)成為一類主抗革蘭氏陰性菌抗菌藥物或酵母制劑的潛力。特別在開發(fā)抗菌肽酵母制劑方面，較好的熱穩(wěn)定性使得其能耐受飼料制粒時的高溫，而且在規(guī)模化生產(chǎn)、高溫濃縮的時候保持抗菌肽活性而不造成工程菌的擴散導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問題；本身具備的獨特抑菌及選擇性殺傷機制，病原菌不易甚至不可能產(chǎn)生耐藥性；良好的酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，使其具備更好的機體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性。moricin3抗菌肽具備的高效、獨特的分子特性、綠色安全、不易產(chǎn)生耐藥性的特點使得其可成為抗生素的替代物之一，從而能夠減少抗生素和化學(xué)藥物的使用及殘留，減少對自然生態(tài)的危害，為人們提供健康食品的同時促進可持續(xù)發(fā)展，具備良好的社會效益及環(huán)境效益。

4 結(jié) 論

本研究利用組成型分泌表達策略在蛋白酶缺陷型畢赤酵母SMD1168中成功表達了小菜蛾特異性抗菌肽moricin，利用抗性梯度篩選方法獲得高拷貝的重組菌，并實現(xiàn)了外源抗菌肽基因在畢赤酵母宿主中的高效表達，同時，對表達的抗菌肽的抑菌活性及耐酸堿和熱穩(wěn)定性進行相關(guān)研究，得到如下結(jié)論：1）以載體pGAPZα A為基礎(chǔ)，通過PCR、酶切、連接等技術(shù)手段，成功構(gòu)建含有小菜蛾特異性抗菌肽成熟肽基因mor-3的組成型表達載體pGAPZα A-mor3；2）以蛋白酶缺陷型畢赤酵母SMD1168為宿主，成功將mor-3基因整合至宿主染色體上，結(jié)合高質(zhì)量濃度的Zeocin（300 μg/mL）獲得mor-3基因多拷貝整合的工程菌株，并實現(xiàn)高效分泌表達，搖瓶發(fā)酵上清液抗菌肽moricin3表達量達248.98 mg/L；3）抑菌活性實驗表明，重組菌表達上清液中的抗菌肽moricin3可能對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌都有抑菌活性，其中對E. coli CMCC44103和S. aureus ATCC25923的MIC分別達到6.25 μg/mL和124.49 μg/mL，顯示了對革蘭氏陰性菌有特異性較強的抑菌活性的潛力；4）重組菌上清液中表達的抗菌肽moricin3具有較好的熱穩(wěn)定性，沸水浴30 min，抑菌活性保持99%，體現(xiàn)了較好的耐高溫性能；5）重組菌上清液中表達的抗菌肽moricin3具備較好的耐酸堿性能，而且在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定，1 mol/L的HCl溶液處理30 min，活性仍保持95%以上；但在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，在強堿性環(huán)境中的抑菌活性隨處理時間呈明顯下降趨勢，1 mol/L的NaOH溶液處理30 min，抑菌活性僅為對照的68.4%，良好的酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，使其具備更好的機體內(nèi)環(huán)境適應(yīng)性潛力。

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High-Level Expression and Antibacterial Properties of Antimicrobial Peptide Moricin in Pichia pastoris

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, WU Songgang, HUANG Jianzhong*
(Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China)

The excessive use of antibiotics has brought about many adverse effects to natural ecology. Finding suitable alternatives to antibiotics to reduce the use of antibiotics is becoming a research hotspot. The aim of this study was to highly express the antimicrobial peptide moricin derived from the diamondback moth Plutella xylostella in Pichia pastoris, and study its antibacterial properties and biochemical properties. The mature peptide gene mor-3 of moricin from Plutella xylostella (L.) was amplified by PCR, and then cloned into the pGAPZα A vector, and an expression plasmid of pGAPZα A-mor3 was constructed. The linearized plasmid pGAPZα A-mor3 was transformed into P. pastoris SMD1168 by electroporation, and the high copy recombinant transformants were screened out by using high concentration of Zeocin. The molecular mass of the recombinant protein expressed in P. pastoris SMD1168 was approximately 5 kD, corresponding to the theoretical molecular mass of this target peptide. Up to 248.98 mg/L recombinant protein in the supernatant after 60 h fermentation was obtained. The recombinant protein in the supernatant showed obvious antibacterial activity against several microorganisms detected by an improved agar diffusion method, including Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The minimum inhibitory concentration (MIC) against E. coli CMCC44103 was 6.25 μg/mL, while that against S. aureus ATCC25923 was only 124.49 μg/mL. It showed potent antibacterial activity against both Gram-positive and Gramnegative bacteria, especially Gram-negative bacteria. In addition, the recombinant protein also had good thermal stability, and strong resistance to acid and alkali. In particular, the antimicrobial activity was maintained in an acidic environment, and so it had good adaptability to the animal intestinal environment. Due to these unique antibacterial properties and biochemical characteristics it has a broad development and application prospect with good social and environmental benefits.

10.7506/spkx1002-6630-201716006

Q812

A

1002-6630（2017）16-0036-07

2016-10-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2015AA021005）

黃欽耿（1984—），男，高級工程師，博士研究生，研究方向為微生物生化及食品微生物工程。E-mail：quenyhuang@163.com *通信作者：黃建忠（1966—），男，教授，博士，研究方向為微生物工程及其工程化。E-mail：hjz@fjnu.edu.cn

黃欽耿, 梁玲, 陳巧紅, 等. 小菜蛾moricin在畢赤酵母中的表達及抑菌活性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 36-42. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

HUANG Qingeng, LIANG Ling, CHEN Qiaohong, et al. High-level expression and antibacterial properties of antimicrobial peptide moricin in Pichia pastoris[J]. Food Science, 2017, 38(16): 36-42. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716006. http://www.spkx.net.cn

Key words: antimicrobial peptides; moricin; Pichia pastoris; efficient expression; antimicrobial activity; biochemical characteristics