謝曼曼，劉武康，丁承超，董慶利，陳國薇，曾海娟，郭 亮，劉 箐*

單核增生性李斯特菌hly缺失菌株的構(gòu)建及生物特性的初步鑒定

謝曼曼，劉武康，丁承超，董慶利，陳國薇，曾海娟，郭 亮，劉 箐*

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

為研究單核增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）hly基因?qū)Χ玖Φ挠绊?，利用同源重組原理，使用穿梭載體，構(gòu)建單核細(xì)胞增生性李斯特菌野生菌株EGD-e的hly基因缺失菌株EGD-eΔhly。細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn)證明缺失菌株生長狀態(tài)與親本無差異，但EGD-eΔhly喪失溶血活性，細(xì)胞侵襲能力降低約90%，在107cells/mL腹腔注射條件下不表現(xiàn)動物毒性。在轉(zhuǎn)錄水平上EGD-eΔhly的毒力基因inlC、prfA的表達(dá)量分別下降了81%和76%，actA、plcB的表達(dá)量分別提高了2.7 倍和1.8 倍。hly缺失菌株的成功構(gòu)建及生物特性的初步研究結(jié)果為研究Lm致病機(jī)理提供依據(jù)。

單核增生性李斯特菌；hly基因；同源重組；生物特性

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種營細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患的食源性致病菌，廣泛存在于生鮮或即食食品中[1-2]。Lm可穿透人體的三大屏障——腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，導(dǎo)致腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)[3]，是研究胞內(nèi)寄生菌與宿主之間的相互作用的重要模式菌[4]。在寄生及繁殖的不同階段中，Lm有多個(gè)毒力因子來協(xié)助其進(jìn)行機(jī)體的感染繼而發(fā)揮致病作用[5]，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與Lm致病性與毒力相關(guān)因子，其中多是表面蛋白或者是分泌蛋白[6-7]。編碼這些蛋白的毒力基因（hly、plcA、plcB、mpl、actA、inlA和inlB）主要位于細(xì)菌染色體上的2 個(gè)毒力島上[8]。其中hly基因編碼溶菌素（listeriolysion O，LLO）是一個(gè)主要毒力因子[9]。

LLO是一種由529 個(gè)氨基酸組成具有溶血活性的成孔蛋白，屬膽固醇依賴性溶細(xì)胞素家族的成員[10]。它在Lm從初級和次級吞噬體逃逸中以及在宿主細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)菌增殖中都起到關(guān)鍵的作用[11-12]?；趆ly基因在Lm致病性中起到的重要作用，構(gòu)建Lm的hly缺失減毒菌株不僅對于研究開發(fā)Lm減毒疫苗研究等有重要意義[13-14]。而且，對于研究LLO在細(xì)胞內(nèi)囊泡逃逸過程及其在Lm在細(xì)胞與細(xì)胞間的感染機(jī)理具有一定指導(dǎo)意義[15]。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建hly基因敲除菌株EGD-eΔhly；并從生長狀態(tài)、毒力基因轉(zhuǎn)錄水平、宿主致死率等方面研究hly基因缺失菌株的生物特性，為食源性致病菌Lm致病機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

單核細(xì)胞增生李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e、英諾克李斯特菌（Listeria innocua，Li）、Caco-2結(jié)腸腺癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保藏；穿梭質(zhì)粒pKSV7質(zhì)粒由華中師范大學(xué)羅勤博士饋贈；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T Vector購于日本TaKaRa公司；6～8 周齡小鼠購于第二軍醫(yī)大學(xué)。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組抽提試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑 日本TaKaRa公司；DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 引物

本實(shí)驗(yàn)中使用的引物參照GenBank中公布的序列（ID：986837）設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物序列和對應(yīng)酶切位點(diǎn)如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

9500型普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、7500型實(shí)時(shí)熒光定量（quantitative real-time，qRT）-PCR儀 美國應(yīng)用生物公司；DyCP-31CN型電泳儀、MicroPulser電轉(zhuǎn)儀 美國伯樂公司；SpectraMax M2型酶標(biāo)儀 美國分子設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 hly敲除菌株的建立

EGD-eΔhly菌株的構(gòu)建，原理如圖1。

圖1 EGD-eΔhly菌株構(gòu)建原理Fig. 1 Schematic illustration of the principle for EGD-eΔhly mutant construction

1.3.1.1 hly基因上下游同源臂的擴(kuò)增及連接

將EGD-e接種于BHI培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜，收集菌體使用細(xì)菌基因組抽提試劑盒獲得基因組。使用hly 5’F、hly 5′R、hly 3′F和hly 3’R引物以抽提的基因組為模板擴(kuò)增hly的上下游同源臂。得到的PCR片段電泳后割膠回收，使用酶XbalⅠ對片段進(jìn)行單酶切，并電泳割膠回收。產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶連接，電泳割膠回收。

1.3.1.2 同源臂連接pMD19-T Vector并導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞

得到的上下游連接產(chǎn)物鏈接pMD19-T Vector并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，得到的菌懸液涂布于含100 μL/mL Amp平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，對應(yīng)的陽性克隆菌液使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，同時(shí)菌液-80 ℃保存。

1.3.1.3 pKSV7重組質(zhì)粒的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)化

將連有同源臂的pMD19-T Vector與pKSV7質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并割膠回收，產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶16 ℃條件下過夜連接并導(dǎo)入Lm感受態(tài)細(xì)胞。將陽性克隆的質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切鑒定并測序，測序過程由華大基因公司完成，將序列比對正確的脫鹽質(zhì)粒與Lm感受態(tài)混勻，每200 μL Lm（1×1011CFU/mL）感受態(tài)的質(zhì)粒用量約1 μg，電轉(zhuǎn)化條件2.25 kV/cm、4 ms。電轉(zhuǎn)后將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入3～5 mL的BHI培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)約2 h，離心收集菌體后涂布于含10 μg/mL克拉霉素（clarithromycin，Cam）的BHI平板，30 ℃條件下培養(yǎng)，挑取菌落進(jìn)行鑒定，將陽性克隆的菌液凍存。

1.3.1.4 hly基因缺失突變株的篩選與鑒定

將含有重組質(zhì)粒的Lm轉(zhuǎn)接到BHI（含10 μg/mL Cam）液體培養(yǎng)基中，41 ℃條件下按1∶100（V/V，下同）連續(xù)轉(zhuǎn)接10 次，將末代細(xì)菌培養(yǎng)物劃線于BHI（含10 μg/mL Cam）平板上，41 ℃條件下過夜培養(yǎng)；挑取BHI（含10 μg/mL Cam）平板上的單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中30 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)并按1∶100轉(zhuǎn)接8 次，取末代培養(yǎng)物劃線于BHI平板，30 ℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定將疑似突變株分別劃線于抗性平板和非抗性平板，含Cam的抗性BHI平板上不生長，無抗性BHI平板上可生長的為疑似突變株，對疑似突變株進(jìn)行PCR鑒定以確定突變株。

1.3.2 生長曲線測定

挑取EGD-e、EGD-eΔhly單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)，按1∶100轉(zhuǎn)接至裝100 mL新鮮BHI培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取200 μL于酶標(biāo)板中測定OD600nm值，共記錄12 h，得到的數(shù)據(jù)繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.3.3 溶血活性的測定

溶血活性的測定參照Sivaranjani等[16]進(jìn)行，挑取EGD-e、EGD-eΔhly、Li的單菌落于BHI中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長早期（OD600nm約為0.6）。將Lm培養(yǎng)物4 ℃、5 500 r/min離心10 min。取0.1 mL上清液樣品加入到1 mL溶血素緩沖液（0.145 mol/L NaCl、0.02 mol/L CaCl2）中，并加入0.025 mL脫纖維羊血。設(shè)置0.1 mL培養(yǎng)基用作陰性對照，0.1 mL 1% Triton-100X作為陽性對照。將混合物于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，5 500 r/min離心10 min。使用分光光度計(jì)測定上清液的OD540nm值[17]。

1.3.4 毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)測定

提取EGD-e和EGD-eΔhly RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于qRT-PCR檢測。其中以Lm的16S rRNA為內(nèi)參基因，按照試劑盒配置體系，設(shè)定反應(yīng)程序參數(shù)測定Lm主要毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，基因名稱及引物詳細(xì)序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 Caco-2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

胰酶消化下的Caco-2細(xì)胞，使用含20%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM重懸，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后均勻平鋪12 孔板底部，2.0×105cells/孔，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，2.5% CO2）過夜。取對數(shù)生長期的細(xì)菌，按感染復(fù)數(shù)為100∶1接種于孔板中共培養(yǎng)2 h。每孔更換0.5 mL 200 μg/mL含20% FBS的DMEM配置的的慶大霉素溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min以清除胞外菌。吸出慶大霉素溶液，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗2 次，每孔加入1 mL 1% Triton X-100充分吹打，收集于1.5 mL無菌離心管中，稀釋后取100 μL涂布于BHI固體培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.6 致死率測定

取對數(shù)生長期的EGD-eΔhly 6 000 r/min離心4 min，使用無菌PBS重懸配置成濃度為107cells/mL菌懸液。3 組6～8 周齡小鼠，每組8 只，每只腹腔注射200 μL菌懸液，其中對照組注射200 μL PBS，每天記錄小鼠死亡狀況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究涉及的生物特性實(shí)驗(yàn)除生長曲線測定外，均設(shè)置3 個(gè)平行，重復(fù)3 次。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad軟件統(tǒng)計(jì)，采用最小顯著性差異法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGD-eΔhly菌株的構(gòu)建

2.1.1 上下游同源臂的擴(kuò)增及連接PMD-19T

圖2 hly上下游片段的克隆Fig. 2 Cloning of hly up-stream and down-stream sequence

使用hly 5’和hly 3’引物擴(kuò)增同源臂PCR凝膠電泳結(jié)果如圖2A所示，hly 5’片段條帶位置在900 bp左右，hly 3’片段條帶位置在700 bp左右。按照NCBI上提供的序列，2 個(gè)條帶應(yīng)分別為880、724 bp，結(jié)果符合預(yù)期。圖2B為hly 5’和hly 3’片段連接到pMD-19T后導(dǎo)入大腸桿菌的菌落PCR鑒定結(jié)果，共挑取6 個(gè)菌落，其中4、5泳道出現(xiàn)陽性條帶，條帶位置與預(yù)期目標(biāo)條帶1 604 bp相符。

2.1.2 PKSV7重組質(zhì)粒的構(gòu)建與電轉(zhuǎn)化

圖3 pKSV7重組質(zhì)粒鑒定Fig. 3 Identification of pKSV7 recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

構(gòu)建好的pMD-19T與PKSV7質(zhì)粒均使用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和SamⅠ進(jìn)行雙酶切，使用T4連接酶連接切開的PKSV7與hly上下游重組片段得到重組的不含hly的重組質(zhì)粒PKSV7-Δhly，經(jīng)電轉(zhuǎn)化將PKSV7-Δhly載體導(dǎo)入到單核增生性李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，增菌后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆出現(xiàn)的條帶大小理論值為1 604 bp。鑒定結(jié)果如圖3，鑒定實(shí)驗(yàn)使用引物hly 5’F和hly 3’R，挑取的10 個(gè)菌落有6 個(gè)出現(xiàn)明顯條帶，條帶位置在1 600 bp左右，符合預(yù)期。

2.1.3 同源重組菌的篩選

圖4 EGD-eΔhly鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of EGD-eΔhly by PCR

帶有PKSV7-Δhly質(zhì)粒的EGD-e菌株，經(jīng)氯霉素抗性和溫度篩選得到EGD-eΔhly菌株，菌株不含hly基因，設(shè)計(jì)hly基因上引物hly KO F與hly KO R，經(jīng)PCR擴(kuò)增、鑒定，缺失菌株無條帶，而沒有發(fā)生重組的菌株經(jīng)擴(kuò)增、凝膠電泳會出現(xiàn)對應(yīng)的理論值為535 bp的條帶。挑取9 個(gè)單菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果如圖4，其中10泳道為陽性對照，1、5、9泳道對應(yīng)的菌株為目標(biāo)菌株。

2.2 EGD-eΔhly生長曲線

圖5 EGD-eΔhly生長曲線Fig. 5 Growth curve of EGD-eΔhly

如圖5所示，EGD-eΔhly與EGD-e在過夜培養(yǎng)，1∶100接菌37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)的條件下，生長曲線基本重合，前3 h為生長初期，后經(jīng)歷對數(shù)期，并在10 h到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)OD600nm約為0.61，各時(shí)期的生長速率基本一致。說明hly基因的缺失對EGD-e的生長不造成影響。

2.3 EGD-eΔhly溶血活性

hly基因編碼溶血素蛋白LLO，是參與EGD-e溶血效應(yīng)的基因，使用溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置的陰性對照OD540nm為0.118，與Li、EGD-eΔhly無顯著性差異（P＞0.05），EGD-e與陰性對照有顯著性差異。

圖6 溶血實(shí)驗(yàn)Fig. 6 Hemolysis assay

2.4 SyBR Green熒光染料法毒力基因qRT-PCR

圖7 毒力基因qRT-PCRFig. 7 mRNA expression levels of virulence genes assayed with qRT-PCR

如圖7所示，以野生株EGD-e基因表達(dá)水平為對照，將對照組每個(gè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平設(shè)為1，則與野生株EGD-e比，突變株EGD-eΔhly目的基因轉(zhuǎn)錄水平大于1為表達(dá)上調(diào)，反之則為下調(diào)。其中hly基因信號值比較低，與對照組有顯著性差異（P＜0.001），驗(yàn)證hly基因成功敲除，同時(shí)hly敲除還導(dǎo)致inlC和prfA基因的下調(diào)，數(shù)值分別降為0.19和0.24，下降了81%和76%。相反的，基因actA、plcB表現(xiàn)上調(diào)，與對照組有顯著性差異（P＜0.001），表達(dá)量分別提高了2.7 倍和1.8 倍。

2.5 Caco-2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)與小鼠致死率

EGD-eΔhly菌株細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8A所示，EGD-eΔhly小鼠致死結(jié)果如圖8B，hly基因敲除后，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測到的菌落顯著降低，在腹腔注射200 μL 1.0×107cells/mL條件下，其致死結(jié)果與對照組（PBS注射組）一致，均未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。而EGD-e注射組在第3天出現(xiàn)小鼠死亡，至第7天死亡率達(dá)100%，大部分死亡發(fā)生在注射后的第3、4、5天。說明hly基因敲除后，EGD-e的毒性下降。hly編碼的蛋白LLO能夠作用于包裹細(xì)菌的囊泡，使細(xì)菌從囊泡逃逸進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)以擴(kuò)散增殖[18]。失去hly基因的EGD-e LLO蛋白不能正常表達(dá)，細(xì)菌不能從囊泡中逃逸并轉(zhuǎn)染其他細(xì)胞，毒性大大降低，小鼠的死亡率降低。

圖8 EGD-eΔhly與EGD-e的毒力鑒定Fig. 8 Identification of virulence of EGD-eΔhly and EGD-e

3 討 論

利用同源重組技術(shù)構(gòu)建缺失菌株，是實(shí)驗(yàn)室研究基因功能的常用手段?？蒲腥藛T使用該方法已成功構(gòu)建Lm inlA、inlB、actA、prfA等基因缺失菌株[19-20]。本研究通過構(gòu)建帶有hly基因上下游片段的質(zhì)粒利用同源重組刪除Lm染色體上約1 600 bp hly基因序列，成功構(gòu)建hly缺失菌株EGD-eΔhly。生物特性研究證明缺失菌株的生長不受影響而毒力大大降低，表現(xiàn)為細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中檢測到的細(xì)菌數(shù)量下降約90%，而且在較高濃度（1.0×107cells/mL）腹腔注射條件下不表現(xiàn)出動物致死現(xiàn)象。有研究[21]使用山羊體內(nèi)分離的Lm構(gòu)建hly基因缺失菌株，結(jié)果顯示與野生型相比敲除菌株的半數(shù)致死量（LD50）從1.47×104cells/mL上升至2.15×109cells/mL，毒力降低，與本實(shí)驗(yàn)相符。缺失菌株毒力的下降表明它對人和動物的致病性降低，為研制疫苗以預(yù)防李斯特疾病和或者作為疫苗載體提供研究基礎(chǔ)[22]。

Lm有多個(gè)毒力因子共同表現(xiàn)Lm毒性，其中由hly編碼的LLO是一種成孔毒素，與菌體從逃逸囊泡進(jìn)入胞質(zhì)有關(guān)，是細(xì)菌得以在胞液內(nèi)增殖的先決條件[23]。本研究對hly基因敲除后其他主要毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化做了初步探索。其中inlC和prfA基因表現(xiàn)為下調(diào)，actA、plcB表現(xiàn)為上調(diào)。PrfA是Lm絕大多數(shù)毒力基因（包括prfA本身）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)劑蛋白[24-25]，該基因的低轉(zhuǎn)錄可能對其他毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)造成影響。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)inlC基因的下調(diào)。inlC編碼的蛋白InlC屬內(nèi)化素家族[26]，能夠通過減輕皮質(zhì)張力，使質(zhì)膜形成突起，從而促進(jìn)Lm在細(xì)胞間的傳播[27]，而hly基因的缺失，進(jìn)入囊泡內(nèi)的菌體不能復(fù)制逃逸，可能不需要更多的InlC以促進(jìn)細(xì)菌向鄰近細(xì)菌的轉(zhuǎn)染而降低轉(zhuǎn)錄水平。plcA、plcB基因與hly基因的正常表達(dá)在細(xì)菌逃逸過程中是必須的，研究證明在缺乏LLO時(shí)，plcB基因表達(dá)的蛋白PC-PLC對于細(xì)胞二級雙膜空泡的消散是必不可少的[28]。hly基因缺失，可能會出現(xiàn)plcB基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)以增強(qiáng)細(xì)菌逃逸。actA基因編碼一種肌動蛋白，已證明與Lm進(jìn)入細(xì)胞相關(guān)[29]，其上調(diào)的原因還不明確。迄今為止鑒定出的李斯特菌的毒力調(diào)節(jié)蛋白僅有PrfA，但明顯的細(xì)菌各個(gè)毒力因子間的相互聯(lián)系比較復(fù)雜，還需要進(jìn)一步研究。

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Construction and Biological Characterization of hly Gene Knockout Listeria monocytogenes Mutant Strains

XIE Manman, LIU Wukang, DING Chengchao, DONG Qingli, CHEN Guowei, ZENG Haijuan, GUO Liang, LIU Qing*
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

This study aimed to elucidate the effect of hly gene on the virulence of Listeria monocytogenes. We constructed a hly gene knockout mutant strain EGD-eΔhly from wild-type L. monocytogenes EGD-e by using a shuttle vector through homologous recombination. Biological characterization showed that there was no difference between the growth status of the mutant and parent strains. However, the mutant strain lost hemolytic activity, the cell invasion ability was decreased and there was no toxicity observed in animals receiving intraperitoneal injection at a concentration of 107cells/mL. At the transcriptional level, the knockout of hly gene down-regulated the expression levels of virulence genes inlC and prfA by 81% and 76% respectively and up-regulated the expression levels of actA and plcB genes by 2.7 and 1.8 times, respectively. This paper may provide a basis for the study of the pathogenic mechanism of Lm.

Listeria monocytogenes; hly gene; homologous recombination; biological characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201716003

TS201.3

A

1002-6630（2017）16-0017-06

謝曼曼, 劉武康, 丁承超, 等. 單核增生性李斯特菌hly缺失菌株的構(gòu)建及生物特性的初步鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 17-22. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716003. http://www.spkx.net.cn

XIE Manman, LIU Wukang, DING Chengchao, et al. Construction and biological characterization of hly gene knockout Listeria monocytogenes mutant strains[J]. Food Science, 2017, 38(16): 17-22. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716003. http://www.spkx.net.cn

2016-12-08

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371776）；上海理工大學(xué)微創(chuàng)勵(lì)志創(chuàng)新基金項(xiàng)目（YS30809101）；上海理工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目

謝曼曼（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理。E-mail：xiemanman880224@163.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理、疫苗及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn