何小用，王大明，孫文敬,,*，崔鳳杰,，錢靜亞,，齊向輝，余泗蓮

變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

何小用1，王大明2,3，孫文敬1,2,*，崔鳳杰1,2，錢靜亞1,2，齊向輝1，余泗蓮2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，從2-酮基葡萄糖酸工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全長(zhǎng)基因kguK，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了重組菌株大腸桿菌BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的誘導(dǎo)下，該重組菌株表達(dá)了一個(gè)特異的分子質(zhì)量約為36.0 ku融合蛋白，且該蛋白的Western-Blot鑒定結(jié)果顯示為陽(yáng)性。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該蛋白是一種由305 個(gè)氨基酸殘基組成的親水性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中，存在著與pfkB家族蛋白類似的保守結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例分別為35.73%、12.79%和51.48%。

變形假單胞菌；2-酮基葡萄糖酸激酶；kguK基因；克隆；表達(dá)；生物信息學(xué)

假單胞菌（Pseudomonas）[1-4]屬于氧化細(xì)菌（oxidative bacteria）[5-6]，其細(xì)胞質(zhì)膜的周質(zhì)側(cè)存在著與呼吸鏈相連的葡萄糖直接氧化系統(tǒng)[7-10]。該系統(tǒng)由膜結(jié)合的葡萄糖脫氫酶和膜結(jié)合的葡萄糖酸脫氫酶[11-14]組成，能夠在細(xì)胞的周質(zhì)空間中催化氧化葡萄糖為食品抗氧化劑D-異抗壞血酸合成的前體——2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）[15-19]。2KGA既可積累于假單胞菌的培養(yǎng)液中，也可被轉(zhuǎn)運(yùn)至其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而被分解代謝[7,20]。因此，開展2KGA代謝機(jī)理的研究對(duì)2KGA的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

到目前為止，有關(guān)2KGA的分解代謝的基因調(diào)控研究主要集中于惡臭假單胞菌（P. putida）[21-22]和致病性的銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）[23]，幾乎沒有涉及到其他的假單胞菌，更未涉及到沙雷氏菌（Serratia）[24]、克雷伯氏菌（Klebsiella）[25-26]、醋酸桿菌（Acetobacter）[27]等能夠生產(chǎn)2KGA的細(xì)菌菌株。相關(guān)研究結(jié)果[21-23]表明：由kguT、kguK、kguE和kguD等結(jié)構(gòu)基因組成的kgu操縱子與2KGA的胞內(nèi)磷酸化過程密切相關(guān)，這些基因分別編碼2KGA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（2-ketogluconate transporter，KguT）、2KGA激酶（2-ketogluconate kinase，KguK）、2KGA異構(gòu)酶（2-ketogluconate epimerase，KguE）和2KGA還原酶（2-ketogluconate reductase，KguD）。另外，阻遏蛋白PtxS調(diào)控kgu操縱子的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)調(diào)控其自身的合成[28-29]。

本研究以國(guó)內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)的主要用菌變形假單胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01[30]為材料，對(duì)其KguK的編碼基因kguK進(jìn)行克隆和表達(dá)，并通過生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測(cè)KguK蛋白的基本生物學(xué)特性，為后續(xù)的KguK蛋白純化、鑒定及其酶學(xué)特性研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為2KGA高效生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

變形假單胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01 本實(shí)驗(yàn)室選育保藏；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、E. coli BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a（+） 本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMD19-T 寶生物工程（大連）公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為15.0 g/L的瓊脂。

1.1.3 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×Pfu PCR MasterMix天根生化科技（北京）有限公司；Anti-6×His antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG、W-TMB顯色試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、5×Protein Loading Buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶、DNA A-Tailing Kit、DL5 000 DNA Marker、Premixed Protein Marker（Low）寶生物工程（大連）公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-18M型冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XMTD-8222型恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；C1000 TouchTM型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、PowerPac Basic型電泳儀、GelDocTMXR+型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DYCZ-40A型電泳儀 北京市六一儀器廠；QL-901型旋渦混合器、TS-2型脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UVG20型防紫外割膠儀 上海領(lǐng)成生物科技有限公司；FMB40型雪花制冰機(jī)、DC-2006型低溫恒溫槽 上海比朗儀器有限公司；HYL-C型組合式搖床 太倉(cāng)市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 變形假單胞菌JUIM01基因組DNA的提取

將低溫保存的變形假單胞菌JUIM01菌株涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取JUIM01菌株的單菌落接種于30 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后取適量菌液8 000 r/min離心收集菌體，并用無(wú)菌水洗滌菌體2 次。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取變形假單胞菌JUIM01基因組DNA，并在-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已公布的其他假單胞菌kguK基因的完整序列和變形假單胞菌JUIM01基因組的部分測(cè)序結(jié)果，采用同源比對(duì)的方法設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的PCR引物如下：

P1：5’-CGGGATCCATGGCCATGTTCGTGGCCGA GCAGT-3’

P2：5’-GGAATTCTCAACCGCCGAAGCGGTCTTC GT-3’

其中，下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。

引物的合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.3 目的基因片段的擴(kuò)增

以變形假單胞菌JUIM01的基因組DNA為模板，采用引物P1和P2擴(kuò)增kguK基因的全長(zhǎng)片段。

PCR體系（25.0 μL）：2×Pfu PCR MasterMix 12.5 μL、引物P1（10 μmol/L）1.0 μL、引物P2（10 μmol/L）1.0 μL、基因組DNA 0.5 μL、ddH2O 10.0 μL。

PCR程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1.3.4 變形假單胞菌kguK基因的克隆與測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書，對(duì)切膠獲取的目的條帶進(jìn)行純化回收。參照DNA A-Tailing Kit和pMD19-T Vector Cloning Kit說明書，將純化得到的kguK基因片段加A尾，并進(jìn)行T-A克隆，然后轉(zhuǎn)化E. coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞。在含有100 μg/mL的氨芐青霉素的LB平板（取40.0 μL的2.0 g/100 mL的X-Gal和7.0 μL的20.0 g/100mL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG）混合后均勻涂布于平板表面）上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性單克隆。參照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書，提取重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ）驗(yàn)證后，將陽(yáng)性克隆子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 異源表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK進(jìn)行雙酶切，然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物；切膠獲取kguK基因條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA片段。此后，在T4 DNA連接酶作用下，將回收的目的基因片段與經(jīng)過上述相同處理的表達(dá)載體pET-28a（+）連接（16 ℃連接16 h），并用該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞。取100 μL的轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。從平板上挑取陽(yáng)性單克隆，接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。參照質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書，提取重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.3.6 重組菌的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

利用重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。從平板上挑取陽(yáng)性單克隆至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min），然后以2%的接種量轉(zhuǎn)接至相同的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min）。當(dāng)培養(yǎng)液的OD600nm達(dá)到0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，在20 ℃、200 r/min的條件下誘導(dǎo)表達(dá)12 h。

1.3.7 SDS-PAGE分析與Western-Blot鑒定

取經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)液1.0 mL，8 000 r/min離心2 min收集菌體，并用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌2 次，然后使菌體重懸于100 μL的PBS緩沖液中。取20.0 μL的重懸菌液與5.0 μL的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液充分混勻，于100 ℃水中煮沸5 min。待樣品冷卻后，對(duì)其全細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

以Anti-6×His antibody（抗6×His單克隆兔抗）為一抗、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG（IgG/HRP羊抗兔）為二抗，以預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)PageRulerTMPrestained Protein Ladder為Marker，對(duì)經(jīng)SDS-PAGE分離的KguK融合蛋白進(jìn)行Western-Blot鑒定。

1.3.8 變形假單胞菌KguK蛋白的序列分析

采用DNAMAN軟件進(jìn)行基因序列和氨基酸序列的分析比對(duì)；使用ExPASy的ProtParam工具對(duì)kguK編碼的蛋白質(zhì)KguK的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；應(yīng)用ExPASy的ProtScale工具在線分析蛋白的疏水性；應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0、SignalP 4.1 Server、Kinasephos和PSORT WWW Server中的PSORT Prediction在線工具分別預(yù)測(cè)目的基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、激酶磷酸化修飾位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位；利用PSIPRED V3.3在線分析工具分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用ExPASy中COILS工具預(yù)測(cè)KguK蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；使用InterProScan在線工具對(duì)KguK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)進(jìn)行分析；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹；應(yīng)用Swiss-Model在線工具進(jìn)行同源模建，并用PDBsum Generate在線蛋白檢測(cè)工具對(duì)預(yù)測(cè)的蛋白模型進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 變形假單胞菌kguK基因片段的克隆

圖1 變形假單胞kguK基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of kguK PCR amplification products from P. plecoglossicida

以變形假單胞菌JUIM01的基因組為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了一段長(zhǎng)度約為900 bp的核酸片段（圖1）。

采用DNA A-Tailing Kit對(duì)切膠回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選和質(zhì)粒提取等步驟，得到了重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK。在該質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜（圖2）中，存在2 條得到明顯分離的條帶，其中一條在大約900 bp處，另一條在大約2 700 bp處，與預(yù)期的結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK得到了正確的構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pMD19-T-kguK

圖3 變形假單胞KguK的基因序列及氨基酸序列Fig. 3 Gene and amino acid sequences of KguK from P. plecoglossicida

由圖3可知，克隆的基因片段的核苷酸序列長(zhǎng)度為918 bp。DNAMAN分析結(jié)果表明，克隆的基因片段具有一個(gè)完整開放閱讀框，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究克隆的基因片段與P. putida NBRC 14164、P. putida KT2440、P. aeruginosa UCBPP-PA14、P. aeruginosa NCGM 1900和P. fluorescens F113的編碼KguK的基因片段在核苷酸序列上的一致性分別為71.91%、71.59%、67.61%、67.51%和64.37%，初步認(rèn)為該序列為變形假單胞菌JUIM01編碼KguK的基因序列。本研究克隆的變形假單胞菌JUIM01的kguK基因序列已被遞交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KU168043。

2.2 異源表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T-kguK和表達(dá)載體pET-28a（+）分別進(jìn)行雙酶切處理，經(jīng)電泳分離、DNA回收、連接、轉(zhuǎn)化、抗性篩選和質(zhì)粒提取等步驟，得到了重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果（圖4）表明：重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK的單酶切（BamHⅠ處理）產(chǎn)物顯示為長(zhǎng)度約為6 300 bp的單一條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符；重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK的雙酶切（BamHⅠ和EcoRⅠ處理）產(chǎn)物顯示為長(zhǎng)度分別為5 400 bp左右和900 bp左右的2 條條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。上述研究結(jié)果證明，基因kguK已成功構(gòu)建到表達(dá)載體pET-28a（+）-kguK中。

圖4 重組質(zhì)粒pET-28a（＋）-kguK酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 4 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pET-28a(+)-kguK

2.3 重組菌的構(gòu)建及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖5 重組菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK全細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the whole-cell proteins extracted from E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguK

利用重組質(zhì)粒pET-28a（+）-kguK轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選得到了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。SDS-PAGE分析結(jié)果（圖5）表明：在相同的誘導(dǎo)條件下，重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表達(dá)出分子質(zhì)量約為36.0 ku的融合蛋白（其中標(biāo)簽蛋白的分子質(zhì)量約為3.5 ku），而E. coli BL21（DE3）和E. coli BL21（DE3）/ pET-28a（+）的全細(xì)胞蛋白中沒有該蛋白的存在。

圖6 重組菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表達(dá)的融合蛋白的Western-Blot分析Fig. 6 Western-Blot analysis of the protein expressed by E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK

對(duì)經(jīng)過SDS-PAGE分離的重組蛋白進(jìn)行Western-Blot鑒定，結(jié)果如圖6所示。E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK表達(dá)的融合蛋白的鑒定結(jié)果顯示為陽(yáng)性，進(jìn)一步證明了變形假單胞菌JUIM01的kguK基因在E. coli BL21（DE3）中的成功表達(dá)。

2.4 變形假單胞菌KguK蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 變形假單胞菌KguK的基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

采用ExPASy的ProtParam工具進(jìn)行的分析結(jié)果表明：KguK蛋白由305 個(gè)氨基酸殘基組成，其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為37 個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為31 個(gè)。該蛋白的理論分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為32.5 ku和5.47，分子式為C1417H2265N423O429S14。KguK蛋白在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為40.78（＞40），說明該蛋白在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定。KguK的脂溶性指數(shù)為92.20，總平均親水指數(shù)為-0.032，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白，但親水性較低。采用ExPASy的ProtScale工具對(duì)KguK蛋白進(jìn)行疏水性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性蛋白，預(yù)測(cè)結(jié)果與上述結(jié)果一致。

2.4.2 變形假單胞菌KguK的跨膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位、信號(hào)肽及潛在激酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用TMHMM Server v. 2.0進(jìn)行的預(yù)測(cè)顯示，KguK蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。利用PSORT Prediction進(jìn)行的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，KguK蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。采用SignalP 4.1 Server對(duì)KguK蛋白的氨基酸序列進(jìn)行N端信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白無(wú)信號(hào)肽。

采用NetPhos2.0在線分析工具對(duì)KguK蛋白中潛在的蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸的激酶磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：KguK蛋白中可能存在10 個(gè)絲氨酸激酶磷酸化修飾位點(diǎn)（第50、99、100、103、106、130、132、150、160、283位氨基酸）、4 個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化修飾位點(diǎn)（第167、193、197、230位氨基酸）和2 個(gè)酪氨酸激酶磷酸化修飾位點(diǎn)（第223、299位氨基酸）。

2.4.3 變形假單胞菌KguK的二級(jí)結(jié)構(gòu)及卷曲螺旋預(yù)測(cè)

通過PSIPRED V3.3在線分析工具對(duì)KguK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：KguK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有α-螺旋、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲3 種結(jié)構(gòu)，所占比例分別為35.73%、12.79%和51.48%。

卷曲螺旋是蛋白質(zhì)中2～7 條α-螺旋鏈互相纏繞形成類似麻花狀結(jié)構(gòu)的總稱，存在于轉(zhuǎn)錄因子、膜蛋白、酶等蛋白質(zhì)中，具有分子識(shí)別、膜通道和代謝調(diào)控等生物學(xué)功能。使用COILS server預(yù)測(cè)了蛋白KguK的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：在3 種不同的窗口寬度下的檢測(cè)值均較低，表明KguK蛋白中可能不存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4.4 變形假單胞菌KguK的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)分析

InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)整合了蛋白家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)等數(shù)據(jù)庫(kù)資源，如SMART、Pfam、TIGRFAMs、ProDom、PROSITE、PRINTS等常用數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。使用InterProScan在線工具分析KguK蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，結(jié)果表明，KguK蛋白存在PfkB蛋白結(jié)構(gòu)域，具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，受體基團(tuán)為醇基，其保守位點(diǎn)位于第244～257個(gè)氨基酸殘基之間。

2.4.5 變形假單胞菌KguK的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖7 KguK蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 7 Phylogenetic tree of KguK proteins from Pseudomonas

通過BLAST搜索，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了變形假單胞菌KguK的同源序列，然后利用ClustW軟件進(jìn)行多序列同源性多重比對(duì)，采用MEGA6.0軟件對(duì)7 個(gè)不同來(lái)源的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析結(jié)果（圖7）表明，變形假單胞菌JUIM01的KguK與P. putida NBRC 14164的KguK的同源性較高，在氨基酸序列上的一致性達(dá)73.82%。

2.4.6 變形假單胞菌KguK的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

利用Swiss-Model在線預(yù)測(cè)工具，采用自動(dòng)模式對(duì)變形假單胞菌JUIM01的KguK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建，選取與KguK蛋白同源性最高的PfkB蛋白（4du5.1A）為模板，模擬KguK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 變形假單胞菌JUIM01蛋白KguK的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 8 Tertiary structure of KguK from P. plecoglossicida JUIM01 predicted by Swiss-model

圖9 變形假單胞菌JUIM01蛋白KguK的拉氏構(gòu)象圖Fig. 9 Ramachandran diagram of KguK from P. plecoglossicida JUIM01

采用PDBsum Generate工具對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖9所示。根據(jù)構(gòu)象的穩(wěn)定性，拉氏構(gòu)象圖被分為4 個(gè)區(qū)域，即最佳區(qū)、次允許區(qū)、一般區(qū)和不允許區(qū)。一般認(rèn)為，最佳區(qū)達(dá)90%以上、不允許區(qū)低于1%的模型結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較好。對(duì)變形假單胞菌KguK三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型的評(píng)估結(jié)果顯示，上述4 個(gè)區(qū)域的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分別為93.7%、6.3%、0.0%和0.0%，表明所構(gòu)建的KguK蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的質(zhì)量較高。

3 結(jié) 論

采用PCR技術(shù)，從工業(yè)生產(chǎn)菌株變形假單胞菌JUIM01克隆了與2KGA代謝密切相關(guān)的KguK的全長(zhǎng)基因，其核苷酸序列長(zhǎng)度為918 bp。利用所克隆的基因kguK，構(gòu)建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-kguK。在IPTG的誘導(dǎo)下，該重組菌表達(dá)了一個(gè)特異性的分子質(zhì)量約為36.0 ku的融合蛋白（其中標(biāo)簽蛋白的分子質(zhì)量約為3.5 ku）。該重組蛋白的Western-Blot鑒定結(jié)果顯示為陽(yáng)性，進(jìn)一步證明了變形假單胞菌JUIM01的kguK基因在E. coli BL21（DE3）中的成功表達(dá)。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：變形假單胞菌KguK是由305 個(gè)氨基酸殘基組成的親水性蛋白，理論分子質(zhì)量為32.5 ku，定位于細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。變形假單胞菌KguK存在一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，與pfkB家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域類似。在該蛋白的氨基酸序列上，存在著16 個(gè)潛在的激酶磷酸化修飾位點(diǎn)。在該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲3 種結(jié)構(gòu)形式所占的比例分別為35.73%、12.79%和51.48%。

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Cloning, Expression and Bioinformatic Analysis of 2-Ketogluconate Kinase Gene from Pseudomonas plecoglossicida

HE Xiaoyong1, WANG Daming2,3, SUN Wenjing1,2,*, CUI Fengjie1,2, QIAN Jingya1,2, QI Xianghui1, YU Silian2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The full-length sequence of 2-ketegluconate kinase gene (kguK) from was cloned from an industrial 2KGA producer of Pseudomonas plecoglossicida JUIM01 and expressed in the recombinant strain Escherichia coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguK with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside induction. The specific fusion protein KguK had a molecular weight of about 36.0 ku, which was confirmed by Western-Blot. The bioinformatics analysis showed that KguK in P. plecoglossicida was a hydrophilic protein with 305 amino acid residues. It was located in the cytoplasm, having a conserved domain similar to that of the pfkB family. The predicted secondary structure contained 35.73% of α-helixes, 12.79% of extended strand and 51.48% of random coil.

Pseudomonas plecoglossicida; 2-ketegluconate kinase (KguK); kguK gene; cloning; expression; bioinformatics

10.7506/spkx1002-6630-201716002

Q781

A

1002-6630（2017）16-0010-07

何小用, 王大明, 孫文敬, 等. 變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 10-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716002. http://www.spkx.net.cn

HE Xiaoyong, WANG Daming, SUN Wenjing, et al. Cloning, expression and bioinformatic analysis of 2-ketogluconate kinase gene from Pseudomonas plecoglossicida[J]. Food Science, 2017, 38(16): 10-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716002. http://www.spkx.net.cn

2016-11-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571885）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA022103）；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（贛知發(fā)[2015]64號(hào)）；江西省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（20142BCB24024）；江西省科技平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010DTZ01900）；德興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（德科發(fā)[2015]44號(hào)）

何小用（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hxy9808@126.com

*通信作者：孫文敬（1964—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)楣I(yè)生物技術(shù)。E-mail：juswj@163.com