趙 雯，騰軍偉，張 健，趙 笑，姜云蕓，楊貞耐*

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1胞外多糖的發(fā)酵制取、流變學(xué)特性和應(yīng)用

趙 雯，騰軍偉，張 健，趙 笑，姜云蕓，楊貞耐*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

針對(duì)1 株從傳統(tǒng)酒曲中分離篩選得到的高產(chǎn)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）解淀粉芽孢桿菌GSBa-1，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定了菌株的最優(yōu)產(chǎn)EPS發(fā)酵條件：培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、蔗糖40 g/L、氯化鈉10 g/L；發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量4%，在此條件下EPS產(chǎn)量為326.45 mg/L。對(duì)EPS的流變特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該EPS溶液的黏度較低，具有濃度依賴(lài)性和剪切變稠的特性，隨著溫度升高，黏度降低。采用激光光散射儀輔助測(cè)量EPS的分子形態(tài)：得到EPS在水溶液中重均分子質(zhì)量為4.993×105g/mol，回旋半徑為48.34 nm，流體力學(xué)半徑為64.62 nm，結(jié)構(gòu)參數(shù)為0.748，該分子可能為緊密的球狀結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡觀察驗(yàn)證了EPS的球狀結(jié)構(gòu)。將該EPS加入到酸性乳飲料中，既不會(huì)增加其黏度，又具有良好的穩(wěn)定特性，表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1 EPS可以作為一種新型的食品穩(wěn)定劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

胞外多糖；流變特性；激光光散射；酸性乳飲料

胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是由微生物（細(xì)菌、真菌、微藻類(lèi)和酵母）在其生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中分泌到外界環(huán)境中的一種長(zhǎng)鏈、高分子物質(zhì)[1]。通常EPS具有良好的水溶性、穩(wěn)定性、保水性、增稠性、凝膠性以及乳化特性，是潛在的食品穩(wěn)定劑[2-3]。在食品中，EPS一方面可以作為增稠劑，賦予食品良好的口感，另一方面可以作為穩(wěn)定劑，結(jié)合水并限制物料的脫水收縮[4]。此外，不同的微生物可形成不同類(lèi)型的EPS，既具有不同的功能特性，也可以耐受更大范圍的溫度、pH值以及離子強(qiáng)度，可以適應(yīng)不同的食品加工過(guò)程[5]。目前常見(jiàn)的微生物EPS有黃原膠、結(jié)冷膠、琥珀酰聚糖等。

微生物EPS的產(chǎn)量受其生長(zhǎng)環(huán)境的影響顯著。溫度、壓力、甚至是光照強(qiáng)度都會(huì)直接影響EPS的產(chǎn)量[6-7]。不同的氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽離子以及pH值不僅會(huì)影響EPS的產(chǎn)量，甚至?xí)绊懫浣M成和理化性質(zhì)。苛刻的外界環(huán)境可能會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)進(jìn)而降低EPS產(chǎn)量，但也有可能刺激微生物分泌大量多糖以保護(hù)自身不受不良環(huán)境因素傷害。目前關(guān)于微生物EPS的報(bào)道中，多糖的產(chǎn)量從0.002 2 g/L到86.3 g/L不等[8]。

酸性含乳飲料因其清爽自然的口感以及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而頗受消費(fèi)者歡迎，但是其加工過(guò)程的殺菌工藝和酸性環(huán)境，易導(dǎo)致料液組織狀態(tài)不穩(wěn)定，出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀、脂肪球上浮等現(xiàn)象[9]。通常情況下膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性依賴(lài)于外界環(huán)境條件（pH值、溫度、離子強(qiáng)度等）、蛋白質(zhì)-多糖的比例和濃度。當(dāng)外界環(huán)境條件相同時(shí)，多糖的類(lèi)型便成為了決定體系均一的主要因素[10-11]。目前少有關(guān)于適用于酸性乳飲料中具有良好穩(wěn)定性又不會(huì)增加漿料黏稠度的多糖類(lèi)穩(wěn)定劑的報(bào)道[12]。

本研究針對(duì)一株從傳統(tǒng)酒曲中篩選得到的產(chǎn)EPS的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GSBa-1，采用響應(yīng)面優(yōu)化其培養(yǎng)基的組成，旨在提高該菌株產(chǎn)EPS的能力。進(jìn)一步研究其流變學(xué)特性，探討其作為穩(wěn)定劑應(yīng)用于酸性乳飲料中的可行性，為EPS的產(chǎn)業(yè)化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并冷凍保存。

胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、碳酸鈣、七水合硫酸鎂、濃硫酸、重蒸酚、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、無(wú)水乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；果膠、羥丙基淀粉酯、羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）、大豆多糖河南千志商貿(mào)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉20 g/L，于121 ℃高溫滅菌20 min。

細(xì)菌基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；CR21GⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；HZQ-Q氣浴恒溫?fù)u床 哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；Elx800型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；S20型數(shù)顯pH計(jì)瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

挑取-80 ℃冰箱中甘油管保藏的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1，于LB固體平板劃線活化，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取少量單一菌落接種到細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量30%，于30 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h作為種子液。

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)EPS的分離提取

EPS的提取方法參照Wang Ji等[13]稍作改動(dòng)。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵結(jié)束后，100 ℃水浴加熱15 min，以滅活可能會(huì)降解多糖的酶類(lèi)。向發(fā)酵液中加入80% TCA，調(diào)節(jié)TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)至4%。室溫振蕩4 h后，4 ℃、10 000 r/min離心40 min，以除去破碎的細(xì)胞和蛋白質(zhì)。向上清液中加入2 倍體積的無(wú)水乙醇置于4 ℃冰箱中過(guò)夜。4 ℃、10 000 r/min離心40 min，去上清液，用蒸餾水溶解沉淀，裝入截留分子質(zhì)量為8～14 kD的透析袋中，每8 h換一次水，透析48 h。

1.3.3 EPS含量的確定

采用苯酚-硫酸法測(cè)透析液中EPS含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L的葡萄糖溶液，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝0.008 78x+0.009 9，R2＝0.999 4。

1.3.4 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)EPS單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)影響EPS產(chǎn)量的主要因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別選定氮源、碳源、蔗糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、無(wú)機(jī)鹽離子和初始培養(yǎng)基的pH值作為單因素。

1.3.4.1 碳源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

以1.1節(jié)中酵母浸粉為唯一碳源的基礎(chǔ)上，分別添加果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖，添加量為10 g/L，接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，分別測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.4.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

向1.1節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入10、20、30、40、50 g/L的蔗糖，接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，分別測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.4.3 氮源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

在1.1節(jié)的基礎(chǔ)上，分別選取蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、脫脂奶粉來(lái)替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，添加量為10 g/L。接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，分別測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

在1.1節(jié)的基礎(chǔ)上，在接種量4%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定不同的發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）條件下EPS產(chǎn)量。

1.3.4.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

在1.1節(jié)的基礎(chǔ)上，在接種量4%、發(fā)酵溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min的條件下，測(cè)定不同的發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60、72 h）條件下EPS產(chǎn)量。

1.3.4.6 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

在1.1節(jié)的基礎(chǔ)上，分別選取氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、碳酸鈣、氯化鎂作為無(wú)機(jī)鹽，添加量為10 g/L。接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，分別測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.4.7 初始培養(yǎng)基pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

在1.1節(jié)的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基pH值分別為5、6、7、8、9。接種量4%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，分別測(cè)定EPS產(chǎn)量。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和蔗糖質(zhì)量濃度3 個(gè)因素，以EPS產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)Design-Expert 8.0.5b軟件，分析該菌株產(chǎn)EPS最佳發(fā)酵條件，得到最優(yōu)條件后，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明模型的有效性。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology

1.3.6 流變學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定

分別配制0.3、0.5、1.0 mg/mL EPS溶液，使用流變儀（CC10號(hào)轉(zhuǎn)子）分別測(cè)定其在不同的剪切速率（0～300 s-1）以及不同溫度（0～70 ℃）條件下的流變學(xué)行為。

1.3.7 激光光散射測(cè)定

配制0.4 mg/mL的EPS溶液，45 ℃水浴加熱4 h，輕輕攪動(dòng)至完全溶解，過(guò)0.22 μm的濾膜。置于無(wú)塵處理過(guò)的石英池（25 mm）中，通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)激光光散射儀在40 ℃、功率22 mW、波長(zhǎng)632.8 nm條件下測(cè)定EPS流體力學(xué)半徑（hydrodynamic redius，Rh）、重均分子質(zhì)量（weight-average molecular weight，mw）和均方回轉(zhuǎn)半徑（ridus of gyration，Rg）。結(jié)合Rg和Rh，可以計(jì)算結(jié)構(gòu)參數(shù)：ρ＝Rg/Rh。ρ是多聚體或膠體的重要特征參數(shù)，取決于高分子的鏈結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和多分散性，與分子質(zhì)量無(wú)關(guān)。

1.3.8 TEM觀察

采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）對(duì)EPS的分子形態(tài)進(jìn)行觀察。將EPS溶于無(wú)菌水中至終質(zhì)量濃度0.5 mg/L，振搖4 h使其充分溶解，過(guò)0.22 μm濾膜。取一滴EPS溶液滴于覆有薄碳層的鋼絲膜上，室溫蒸發(fā)除水。200 kV條件下觀察EPS形態(tài)。

1.3.9 EPS在酸性乳飲料中的應(yīng)用

1.3.9.1 調(diào)制酸性乳飲料

巴氏殺菌奶3.6%，蔗糖5%，分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的EPS、果膠、CMC、羥丙基淀粉酯和大豆多糖，混合均勻后冷卻到20 ℃以下，用10%檸檬酸調(diào)pH值至5.5。20 MPa均質(zhì)后分裝于牛奶瓶，100 mL/瓶，巴氏殺菌（75 ℃、15 min）后室溫保存，通過(guò)測(cè)定其保水率來(lái)評(píng)估其穩(wěn)定性[14]。

1.3.9.2 保水率測(cè)定

在有刻度的試管中，準(zhǔn)確加入調(diào)制好的飲料20 mL，記錄試管質(zhì)量m0，加入樣品后的質(zhì)量m1。4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，準(zhǔn)確稱(chēng)量沉淀物質(zhì)量m2，根據(jù)下式計(jì)算保水率：

1.3.9.3 黏度測(cè)定

用布氏流變儀測(cè)定各酸性乳飲料黏度。選用34號(hào)轉(zhuǎn)子，剪切速率5 r/min，變量范圍為0～120 s-1。測(cè)定其黏度變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

碳源一直是影響EPS產(chǎn)量的重要因素。不同的碳源種類(lèi)對(duì)于同一菌株或者同一菌株對(duì)于不同的碳源，EPS產(chǎn)量都不相同。Polak-Berecka等[15]指出當(dāng)使用乳糖作為碳源，Lactobacillus rhamnosus R的EPS產(chǎn)量相比于葡萄糖作為碳源會(huì)有大幅下降。

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of carbon source on the yield of EPS

由圖1可知，以蔗糖作為碳源時(shí)EPS產(chǎn)量最大，因此選擇蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，此時(shí)最優(yōu)產(chǎn)量為139.04 mg/L。

2.1.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

圖2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of sucrose concentration on the yield of EPS

由圖2可知，隨著蔗糖質(zhì)量濃度增加，可供菌體利用轉(zhuǎn)化的糖類(lèi)底物質(zhì)量濃度增加，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量為176 mg/L。繼續(xù)增加蔗糖質(zhì)量濃度，則會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生滲透脅迫，抑制菌體生長(zhǎng)，因此在本試驗(yàn)中選取40 g/L為最適的蔗糖質(zhì)量濃度。

2.1.3 氮源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

生物量是影響EPS產(chǎn)量的一個(gè)主要因素。研究表明氮源的添加有益于細(xì)胞生長(zhǎng)，增加菌體密度，促進(jìn)菌體細(xì)胞將糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為多糖[16]。De等[17]研究指出向MRS培養(yǎng)基中添加(NH4)2HPO4后，Rhzobium radiobacter CGMCC 12099產(chǎn)凝膠多糖是無(wú)氮源添加的2.1 倍。

圖3 氮源種類(lèi)對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source on the yield of EPS

由圖3可知，胰蛋白胨作為氮源時(shí)，EPS產(chǎn)量最高，為226.24 mg/L。其次為大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨和脫脂乳粉，因此，選擇胰蛋白胨作為氮源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of the fermentation temperatures on the yield of the EPS

由圖4可知，在35 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值214.11 mg/L。但是隨著溫度升高，EPS產(chǎn)量下降，可能是高溫導(dǎo)致菌體合成多糖的酶活力下降。因此選擇35 ℃為最適的發(fā)酵溫度。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of fermentation time on the yield of EPS

如圖5所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在36 h時(shí)，EPS的產(chǎn)量達(dá)到最大值243.62 mg/L。36 h后多糖的產(chǎn)量呈現(xiàn)大幅度下降，可能是由于酶解或者培養(yǎng)環(huán)境理化參數(shù)的改變[18]。發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菌體自溶，分解代謝多糖的酶分泌到胞外，進(jìn)而降低EPS產(chǎn)量，因此在后續(xù)的試驗(yàn)中選取36 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.1.6 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中的金屬離子會(huì)影響菌體生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶類(lèi)。一方面直接影響與菌體糖代謝直接相關(guān)的酶類(lèi)活性，另一方面調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH值、氧化還原電位等來(lái)影響EPS的生成[19]。當(dāng)微生物生長(zhǎng)缺乏微量元素時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，但過(guò)量又會(huì)對(duì)微生物機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。因此，需要控制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽離子的種類(lèi)和比例。

由圖6可知，氯化鈣對(duì)EPS產(chǎn)量的影響最明顯，添加量為10 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量為153.12 mg/L。

圖6 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of inorganic salt ions on the yield of EPS

2.1.7 初始培養(yǎng)基pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

每種菌株都有其最適的生長(zhǎng)和產(chǎn)EPS pH值范圍。pH值大小同樣會(huì)影響微生物生長(zhǎng)過(guò)程中代謝酶和產(chǎn)物生成酶的活性。只有在最適pH值范圍內(nèi)，才能最大程度提高酶促反應(yīng)的速率，使微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成速率達(dá)到最大[20]。

圖7 初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of initial pH on the yield of EPS

由圖7可知，隨著pH值的不斷升高，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，最適pH值為7，此時(shí)EPS產(chǎn)量為176.99 mg/L，明顯高于其他pH值條件。這與大多數(shù)研究結(jié)果相一致[21-22]。

通過(guò)以上單因素試驗(yàn)?zāi)軌虻贸霰驹囼?yàn)的最佳培養(yǎng)基組成為：蔗糖40 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵最佳條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with response values

根據(jù)Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。通過(guò)Design-Expert響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件分析，共有16 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以蔗糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為自變量，以EPS產(chǎn)量為響應(yīng)值，不同試驗(yàn)條件下所得的EPS產(chǎn)量如表2所示。

2.2.2 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓帮@著性分析

以EPS產(chǎn)量作為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)表進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到EPS產(chǎn)量（Y）對(duì)編碼自變量X1、X2、X3的二次多項(xiàng)回歸方程：Y＝320.20+ 19.38X1+37.38X2-22.00X3+21.75X1X3-98.85X12-89.85X22-67.10X32。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，在設(shè)計(jì)的水平內(nèi)，模型的F值為106.46，影響顯著。函數(shù)的相關(guān)系數(shù)R2為0.982 2，R2值越接近1說(shuō)明誤差的影響越小，表明該函數(shù)可以較好地模擬發(fā)酵過(guò)程。校正系數(shù)R2Adj為0.959 2，說(shuō)明95.92%的響應(yīng)值變化可以用該模型來(lái)表示。失擬項(xiàng)的F值為3.60，P＝0.213 6＞0.05，即失擬不顯著，表明該函數(shù)關(guān)系可以充分的表現(xiàn)真實(shí)的發(fā)酵情況。通過(guò)比較各因素的F值，可以得出其對(duì)EPS產(chǎn)量的影響由大到小分別為：X2＞X3＞X1。其中，模型的一次項(xiàng)X2影響極顯著，X1和X3對(duì)EPS產(chǎn)量影響顯著，二次項(xiàng)X12、X22、X32極顯著，交互項(xiàng)X1X3顯著，其他交互項(xiàng)不顯著。以上結(jié)果表明各影響因素對(duì)發(fā)酵條件的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

由圖8a可知，等高線近似圓形，表明蔗糖質(zhì)量濃度和發(fā)酵溫度交互作用不顯著。將發(fā)酵時(shí)間控制為0 h時(shí)，蔗糖質(zhì)量濃度設(shè)定為固定值，隨著發(fā)酵溫度的逐漸升高，EPS產(chǎn)量先增大后減小，在發(fā)酵溫度25～45 ℃范圍內(nèi)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大。

由圖8b可知，發(fā)酵時(shí)間和蔗糖質(zhì)量濃度的等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明二者交互作用顯著。固定發(fā)酵溫度為0 ℃時(shí)，固定發(fā)酵時(shí)間為一固定值，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的升高，EPS產(chǎn)量提高。

由圖8c可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的等高線圖接近圓形，說(shuō)明二者交互作用不顯著。固定蔗糖質(zhì)量濃度為零，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，EPS的產(chǎn)量先增大后減少。

圖8 各因素交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 8 Response surface and contour plots showing the effects of various factors on the yield of EPS

綜上可知，響應(yīng)值Y存在最大值，該值越大說(shuō)明發(fā)酵水平越穩(wěn)定，確定最大穩(wěn)定點(diǎn)。因此發(fā)酵最佳條件為蔗糖質(zhì)量濃度40 g/L、發(fā)酵時(shí)間36 h、發(fā)酵溫度35 ℃。帶入擬合的函數(shù)式，得到預(yù)測(cè)的EPS產(chǎn)量為327.594 mg/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用模型條件進(jìn)行發(fā)酵，3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)取平均值，所得到的結(jié)果為326.45 mg/L，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明該模型適用于模擬實(shí)際情況。

2.3 EPS的流變特性

圖9 不同質(zhì)量濃度EPS溶液在不同剪切速率（A）和溫度（B）條件下的黏度Fig. 9 Viscosity of EPS solution as a function of shearing rate and temperature

由圖9A可知，1 mg/mL EPS溶液仍表現(xiàn)出了較低的黏度。0.3、0.5、1.0 mg/mL EPS溶液黏度隨著剪切速率的升高而升高，表現(xiàn)出剪切增稠的現(xiàn)象。此現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道[15-17]，隨著剪切速率的增加可能會(huì)打破原本堅(jiān)硬規(guī)則的結(jié)構(gòu)，致使黏度增加。由圖9B可知，隨著溫度的升高其黏度下降，這與大多數(shù)報(bào)道相符，高溫會(huì)打破分子原本的規(guī)則結(jié)構(gòu)使其呈現(xiàn)較為稀松的構(gòu)象[23-25]，降低其分子間的接觸頻率。另一方面高溫同樣也會(huì)導(dǎo)致EPS內(nèi)部的分子發(fā)生重排，打破其結(jié)構(gòu)完整性[26]。

2.4 EPS的光散射測(cè)定結(jié)果

通過(guò)光散射測(cè)量高分子的mw、Rg以及第二維里系數(shù)（A2）；確定高分子的形狀。

圖10 0.4 mg/mL EPS溶液靜態(tài)光散射的Zimm圖Fig. 10 Zimm plot of 0.4 mg/mL EPS solution

如圖10所示，0.4 mg/mL的EPS溶液在小散射角度沒(méi)有發(fā)生彎曲，說(shuō)明該溶液中分子沒(méi)有發(fā)生聚集。當(dāng)只有一個(gè)質(zhì)量濃度的光散射數(shù)據(jù)時(shí)，如果質(zhì)量濃度足夠低，該濃度下數(shù)據(jù)點(diǎn)成直線，該直線可以看做Zimm圖中c為0的線，可以根據(jù)該直線的斜率與截距計(jì)算mw、Rg。EPS在水溶液中mw為4.993×105g/mol，Rg為48.34 nm。

通過(guò)光散射儀在90°測(cè)得的EPS在水溶液中的Rh為64.62 nm。經(jīng)計(jì)算得ρ為0.748，對(duì)于單分散體系來(lái)說(shuō)，ρ等于0.775為致密球體。ρ在1.5～1.8之間為柔性無(wú)規(guī)則卷曲的鏈狀結(jié)構(gòu)。ρ大于2為舒展的鏈結(jié)構(gòu)[27]。因此推測(cè)該EPS可能為致密的球體結(jié)構(gòu)。

2.5 EPS的TEM觀察結(jié)果

圖11 0.4 mg/mL的EPS溶液在TEM下的圖像Fig. 11 Transmission electron microscope images of 0.4 mg/mL EPS solution

如圖11所示，EPS在水溶液中，40 000 倍放大觀察，呈現(xiàn)黑色球體或橢圓形結(jié)構(gòu)，在灰色背景下分子直徑在30～150 nm范圍內(nèi)。這與Ren Wei等[28]TEM觀察Paenibacillus bovis sp. nov BD3526的EPS結(jié)構(gòu)相一致。這種球形結(jié)構(gòu)在嗜熱鏈球菌、變異鏈球菌和枯草芽孢桿菌EPS的結(jié)構(gòu)解析中也曾有過(guò)報(bào)道[29]。這種球形結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致溶液低黏度的主要原因，相比于桿狀或者片狀的EPS，球狀的EPS在水溶液中具有較低的溶脹特性，分子間相互作用較少，不易使溶液增稠[30-32]。

2.6 EPS在酸性乳飲料中的應(yīng)用

圖12 EPS溶液及常見(jiàn)穩(wěn)定劑對(duì)酸性乳飲料保水性的影響Fig. 12 Effect of EPS solution and several common stabilizers on the water retention of acid beverage

由圖12可知，當(dāng)EPS添加量為0.1%時(shí)，具有和大豆多糖、羥丙基淀粉酯相似的保水特性。隨著EPS含量的增加，其保水率略有下降，當(dāng)EPS含量超過(guò)0.3%時(shí)，其保水性下降幅度較大?？赡苁且?yàn)榇諩PS樣品中含有雜質(zhì)，阻礙了其分子之間的相互作用[33-34]。

圖13 不同含量的EPS和穩(wěn)定劑添加對(duì)酸性乳飲料的黏度影響Fig. 13 Effect of different concentrations of EPS solution and stabilizers on the viscosity of acid beverage

如圖13所示，當(dāng)含量超過(guò)0.4%時(shí)，CMC表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。果膠雖然具有較為明顯的穩(wěn)定性?xún)?yōu)勢(shì)，但是隨著含量增加，果膠具有較為明顯的增稠作用，同時(shí)羥丙基淀粉酯也會(huì)使料液黏度增加，羥丙基淀粉酯在0.1%的添加量情況下，溶液黏度達(dá)到30 Pa?s，而EPS只有12 Pa?s。隨著EPS含量的增加，酸性乳飲料的黏度表現(xiàn)出了先下降后上升的趨勢(shì)。

綜上可知，大豆多糖具有較好的穩(wěn)定性，并且隨著含量的增加，不會(huì)改變料液的黏度。CMC含量大于0.4%時(shí)，可以在不增大料液黏度的前提下具有良好的穩(wěn)定性。但與之相比，添加0.3%粗EPS可以具有與0.3% CMC相同的黏度，但是穩(wěn)定性明顯優(yōu)于CMC，其中果膠和羥丙基淀粉酯會(huì)明顯增加料液稠度，并不適合單獨(dú)應(yīng)用于酸性乳飲料。綜合結(jié)果表明，該EPS具有低黏度以及良好的穩(wěn)定性，具有作為新型食品穩(wěn)定劑的潛力。

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)一株從傳統(tǒng)的江米酒酒曲中篩選得到的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳的發(fā)酵條件為：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、蔗糖20 g/L、氯化鈣10 g/L、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量4%。在此條件下EPS產(chǎn)量為326.45 mg/L。經(jīng)驗(yàn)證該模型可靠。

使用哈克流變儀對(duì)不同質(zhì)量濃度的EPS溶液進(jìn)行流變學(xué)測(cè)定，結(jié)果表明該EPS溶液具有較低的黏度，且其黏度隨著質(zhì)量濃度和剪切速率的增加而增加，隨著溫度升高而降低。根據(jù)光散射儀測(cè)定該EPS的流體流體力學(xué)半徑和回旋半徑，推測(cè)該EPS為緊密的球狀分子。采用TEM對(duì)該EPS分子進(jìn)行形態(tài)觀察，驗(yàn)證了該EPS球狀結(jié)構(gòu)。

將提取得到的EPS作為穩(wěn)定劑添加于酸性乳飲料中，該產(chǎn)品的穩(wěn)定性與添加大豆多糖的酸性乳飲料相接近，其黏度高于大豆多糖，與添加CMC的酸性乳飲料相接近。綜合研究表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1 EPS具有作為食品穩(wěn)定劑的應(yīng)用前景。

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Production of Exopolysaccharide by Fermentation with Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, Its Rheological Characterization and Application

ZHAO Wen, TENG Junwei, ZHANG Jian, ZHAO Xiao, JIANG Yunyun, YANG Zhennai*
(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The present study was carried out to optimize the fermentation conditions for exopolysaccharide (EPS) production by Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, isolated and screened from the traditional rice wine starter. The optimal fermentation conditions obtained by single factor experiments and response surface analysis were as follows: the culture medium consisted of peptone 10 g/L, yeast extract powder 5 g/L, sucrose 40 g/L, and NaCl 10 g/L and the fermentation was performed for 36 h at 35 ℃ with an inoculum size of 4% at a shaking speed of 160 r/min. The maximal production of EPS of 326.45 mg/L was obtained under the above conditions. The results of rheological studies indicated that the aqueous solution of the EPS had low viscosity, which increased with increasing its concentration and shearing rate. Measurement of molecular parameters by multi-angle laser light scattering showed that the weight-average molecular mass (mw) of the EPS was 4.993 × 105g/mol, the radius of gyration (Rg) 48.34 nm, hydrodynamic radius (Rh) 64.62 nm, and Rg/Rhratio (ρ) 0.748, indicating that the EPS molecule may be present as compact spheres. This was also confirmed by transmission electron microscope. The application of this EPS in acid milk beverage showed that the use of the EPS could improve the stability of the beverage without increasing its viscosity, indicating that the EPS from Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1 can be potentially used as a novel food stabilizer.

exopolysaccharide; rheological characterization; laser light scattering; acid milk beverage

10.7506/spkx1002-6630-201716001

TS201.3

A

1002-6630（2017）16-0001-09

趙雯, 騰軍偉, 張健, 等. 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1胞外多糖的發(fā)酵制取、流變學(xué)特性和應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 1-9. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716001. http://www.spkx.net.cn

2016-10-06

國(guó)家自然基金科學(xué)面上項(xiàng)目（31371804）

趙雯（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail：13614317400@163.com

*通信作者：楊貞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及加工技術(shù)。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn

ZHAO Wen, TENG Junwei, ZHANG Jian, et al. Production of exopolysaccharide by fermentation with Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1, its rheological characterization and application[J]. Food Science, 2017, 38(16): 1-9. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716001. http://www.spkx.net.cn