王婧怡，姚丹丹，趙國琦，鄔彩霞，馬錢波，徐軍，唐晨陽

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草的化感作用

王婧怡，姚丹丹，趙國琦，鄔彩霞*，馬錢波，徐軍，唐晨陽

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

黃花草木樨水浸提液具有化感除草作用，為了進(jìn)一步開展黃花草木樨化感抑草的研究，闡明黃花草木樨中所含化感物質(zhì)的化感抑制機(jī)理，本實驗采用生物檢測法以黃花草木樨水浸提液處理多花黑麥草和蘇丹草種子，并對其萌發(fā)和幼苗生長過程中的重要生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，與對照相比，黃花草木樨水浸提液能顯著降低多花黑麥草和蘇丹草種子的發(fā)芽率、根長、根干重、莖長和莖葉干重等生長指標(biāo)(P<0.05)；能顯著降低多花黑麥草和蘇丹草的葉綠素含量(P<0.05)，顯著提高多花黑麥草和蘇丹草的淀粉和可溶性蛋白含量(P<0.05)；顯著提高蘇丹草可溶性糖含量，顯著降低黑麥草可溶性糖含量(P<0.05)；蘇丹草和黑麥草在4和6 d處理組的CAT活性與對照差異顯著(P<0.05)，8 d時恢復(fù)至對照水平；蘇丹草處理組和黑麥草處理組的POD活性均先降低后升高。

黃花草木樨水浸提液；蘇丹草；多花黑麥草；化感；機(jī)理

目前農(nóng)田雜草控制仍以化學(xué)除草劑為主，化學(xué)除草劑的廣泛使用帶來了環(huán)境污染、甚至導(dǎo)致人畜傷害等一系列問題[1-2]。過度依賴和長期大量使用單一除草劑，使得雜草產(chǎn)生抗藥性，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和可持續(xù)發(fā)展[3-5]。因此，研發(fā)有效控制雜草的環(huán)保手段一直備受關(guān)注[6]。植物化感作用是指植物通過自身分泌的次生代謝物質(zhì)影響周邊其他植物的生長發(fā)育，不會帶來農(nóng)藥殘留等環(huán)境問題。研究表明，在田間噴灑芥菜(Brassicajuncea)的水提物能夠顯著抑制多種雜草的生長[7]；向日葵(Echinochloacrusgalli)水浸提液可以抑制稗草(Echinochloacrus-galli)的生長[8]。因此，近年來利用植物的化感特性來抑制雜草的生長已被廣泛研究和應(yīng)用。

黃花草木樨(Melilotusofficinalis)是抗逆性很強(qiáng)的豆科植物，主要分布于東北、華北、西北、西藏、四川及長江流域以南的各個省份。鄔彩霞等[9]研究表明，黃花草木樨水浸提液能夠顯著抑制藜(Chenopodiumalbum)、籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)、稗草(Echinochloacrus-galli)、車前草(Plantagoasiatica)以及山苦荬(Ixerischinensis)等種子的萌發(fā)和幼苗的生長，并于春秋兩季在田間施用黃花草木樨干草粉，發(fā)現(xiàn)單位面積雜草數(shù)量顯著降低，驗證了黃花草木樨田間抑草效果。汪之波等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃花草木樨水浸提液能夠抑制3種雜草蒲公英(Taraxacummongolicum)、馬齒莧(Portulacaoleracea)以及巴天酸膜(Rumexpatientia)種子的萌發(fā)，并且對萌發(fā)后根和苗的生長產(chǎn)生影響。因此，利用黃花草木樨的化感作用進(jìn)行田間雜草防除具有很好的應(yīng)用前景。為了深入開展黃花草木樨化感抑草的研究，有必要對黃花草木樨的化感作用機(jī)理進(jìn)行闡明。已有研究表明，大部分化感物質(zhì)抑制其他植物的主要作用表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)和幼苗生長[11-13]，因此本實驗用黃花草木樨水浸提液處理多花黑麥草(Loliummultiflorum)和蘇丹草(Sorghumsudanense)種子，重點(diǎn)分析了其種子萌發(fā)和幼苗生長過程中的重要生理生化指標(biāo)，以期探明黃花草木樨化感抑草的生理生化機(jī)制，為進(jìn)一步開展黃花草木樨的田間雜草防除提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃花草木樨于2015年10月中旬播于江蘇省揚(yáng)州大學(xué)揚(yáng)子津校區(qū)試驗田，于2016年5月中旬盛花期采集新鮮植株制備水浸提液。多花黑麥草和布魯諾蘇丹草種子購于百綠集團(tuán)。

1.2 黃花草木樨水浸提液的制備

取盛花期黃花草木樨新鮮植株100 g，剪成2 cm小段，用1000 mL蒸餾水4 ℃浸提72 h，獲得10%(質(zhì)量/體積，weight/volume)的水浸提液[9]。水浸提液經(jīng)過定量濾紙和孔徑0.45 μm的濾膜雙重過濾后，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3 化感作用測定

采用培養(yǎng)皿砂培法，在直徑為12 cm×12 cm的發(fā)芽盒中加入90 g石英砂，每皿分別均勻播入經(jīng)1%次氯酸鈉消毒的多花黑麥草和蘇丹草種子100粒，試驗組(CS)每個培養(yǎng)皿加20 mL 黃花草木樨水浸提液，對照組(CK)加等量蒸餾水，每個處理5次重復(fù)。然后試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，放入25 ℃光照培養(yǎng)箱(智能光照培養(yǎng)箱ZGX-300C，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件12 h/d光照，12 h/d黑暗處理，光照強(qiáng)度4000 lx。

1.4 測定項目及方法

萌發(fā)率：播種3和7 d后計算所有發(fā)芽種子的百分率為萌發(fā)率。

苗長與根長：播種6 d后從每個培養(yǎng)皿中隨機(jī)取10株多花黑麥草、蘇丹草測定其根長及苗長,取平均值。發(fā)芽數(shù)低于10株的只取發(fā)芽的幼苗測苗長和根長，并取該相應(yīng)幼苗的平均值。

莖葉干物質(zhì)重與根干物質(zhì)重：播種6 d后從每個培養(yǎng)皿中隨機(jī)取10株多花黑麥草、蘇丹草，將幼苗的地上部分和地下部分分離,分別在105 ℃殺青3 h，然后烘干至恒重。

植物全株過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、可溶性糖(soluble sugar)含量、可溶性蛋白(soluble protein)含量，均于播種4,6和8 d后采樣,使用南京建成生物有限公司提供的試劑盒進(jìn)行測定。

植物全株淀粉(starch)含量，播種4,6和8 d后采樣，采用蒽酮比色法測定。

植物全株葉綠素含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量，播種4,6和8 d后采樣,采用乙醇浸提法測定。

1.5 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行初步處理后,用 SPSS 軟件(SPSS Ver. 17. 0 for Windows)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析[14]，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花草木樨水浸提液對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

如表1所示，黃花草木樨水浸提液處理能顯著抑制蘇丹草和黑麥草兩種供試種子的萌發(fā)(P<0.05)，對蘇丹草和黑麥草3 d發(fā)芽抑制率分別達(dá)到85.49%和96.51%，7 d發(fā)芽抑制率分別達(dá)到79.78%和91.97%，可見對黑麥草種子萌發(fā)的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草。

黃花草木樨水浸提液處理能顯著抑制蘇丹草和黑麥草兩種供試植物幼苗根和莖的生長(P<0.05)，對根長的抑制率分別為95.14%和96.99%，對莖的抑制率分別為83.41%和94.92%；黑麥草和蘇丹草根、莖的干重均顯著低于對照組(P<0.05)，對蘇丹草和黑麥草根干重的抑制率分別為17.39%和95.45%，對蘇丹草和黑麥草莖干重的抑制率分別為66.21%和87.32%，由此可見黃花草木樨水浸提液對黑麥草幼苗生長的抑制作用要高于蘇丹草。

表1 黃花草木樨水浸提液對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

注：同列不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

Note： Values with the different letters in the same column are significantly different at the 0.05 probability level, determined by LSD multiple range test (P<0.05).

由表2可以看出,用黃花草木樨水浸提液處理幼苗后，蘇丹草和黑麥草植株內(nèi)的葉綠素含量均發(fā)生了明顯的變化。處理4，6和8 d后，處理組中總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b的含量均顯著低于對照組(P<0.05)。用黃花草木樨水浸提液處理蘇丹草4 d，總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b分別降低了90.20%、89.73%和91.67%，處理蘇丹草6 d，分別降低了91.96%、92.86%和89.29%，處理蘇丹草8 d，分別降低了94.57%、95.04%和93.02%；用黃花草木樨水浸提液處理黑麥草4 d，分別降低了92.42%、92.16%和93.33%，處理黑麥草6 d，分別降低了97.63%、98.09%和96.30%，處理黑麥草8 d，分別降低了97.61%、98.98%和94.79%?？梢婋S著時間的增加，黃花草木樨水浸提液對蘇丹草葉綠素生成的抑制作用不斷增強(qiáng)，對黑麥草中葉綠素生成抑制作用在4 d達(dá)到最大值，6 d抑制作用稍有減弱，且對黑麥草植株中葉綠素合成的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草。

表2 黃花草木樨水浸提液對幼苗中葉綠素的影響

注：同列不同大寫字母表示同一時間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，同行不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

Note： Values with different uppercase letters show significant differences between different treatments at 0.05 level, values with different lowercase letters show significant differences between different time at 0.05 level.

2.2 黃花草木樨水浸提液對種子幼苗生理性狀的影響

從圖1可看出，蘇丹草對照組和處理組中的淀粉含量均隨著時間的延長表現(xiàn)出降低趨勢，且處理組淀粉含量均顯著高于對照組(P<0.05)，處理組中8與4 d相比，8 d淀粉含量降低了55.64%，而對照中8 d淀粉含量降低了82.63%；黑麥草對照組和處理組中的淀粉含量均隨著時間的延長表現(xiàn)出降低趨勢，且處理組淀粉含量均顯著高于對照組(P<0.05)，處理組中8與4 d相比，8 d淀粉含量降低了51.53%，而對照中8 d降低了77.78%。可見蘇丹草和黑麥草對照組中淀粉含量降低幅度均比處理組大，且對黑麥草淀粉分解的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草。

圖1 黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草淀粉含量的影響Fig.1 Effect of M. officinalis queous extract on starch of L. multiflorum and S. sudanense 不同大寫字母表示同一時間不同處理之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。Values with different uppercase letter show significant differences between different treatments at 0.05 level, values with different lowercase letters show significant differences between different time at 0.05 level. CK: 對照組Control；CS: 處理組Treatment of M. officinalis queous extract. 下同The same below.

由圖2可以看出,用黃花草木樨水浸提液處理幼苗后，蘇丹草和黑麥草植株內(nèi)的可溶性糖含量均發(fā)生了顯著的變化。蘇丹草對照組和處理組中可溶性糖含量均隨著時間的延長顯著降低(P<0.05)，且處理組4、6和8 d可溶性糖含量均顯著高于對照組(P<0.05)，分別上升了61.90%、91.44%和56.09%；黑麥草對照組和處理組中可溶性糖含量均隨著時間的延長顯著降低(P<0.05)，且處理組4、6和8 d可溶性糖含量均顯著低于對照組(P<0.05)，分別降低了49.16%、71.80%和42.65%。

圖2 黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of M. officinalis queous extract on soluble sugar of L. multiflorum and S. sudanense

從圖3可以看出，蘇丹草對照組中6 d可溶性蛋白與4 d相比顯著升高(P<0.05)，但與8 d相比無顯著性變化，處理組中6 d可溶性蛋白與4 d相比顯著降低(P<0.05)，但與8 d相比無顯著性變化；黑麥草對照組中6 d可溶性蛋白與4 d相比顯著升高(P<0.05)，但與8 d相比無顯著性變化，處理組中6 d可溶性蛋白與4 d相比顯著升高(P<0.05)，但與8 d相比有下降趨勢但差異不顯著。蘇丹草處理組在4 d恢復(fù)至對照水平，黑麥草在8 d恢復(fù)至對照水平，可見蘇丹草的抗逆性要強(qiáng)于黑麥草。

圖3 黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of M. officinalis queous extract on soluble protein of L. multiflorum and S. sudanense

由圖4可以看出,蘇丹草對照組中CAT活性顯著下降(P<0.05)，處理組中CAT活性先升高后降低且差異顯著(P<0.05)，4 d處理組顯著低于對照組(P<0.05)，6 d處理組顯著高于對照組(P<0.05)，8 d處理組與對照組間無顯著性差異；黑麥草處理組在4和6 d的CAT活性均顯著高于對照組(P<0.05)，8 d高于對照組，但差異不顯著。

從圖5可以看出，蘇丹草對照組中POD活性先降低后升高，且差異顯著(P<0.05)，處理組POD活性顯著上升(P<0.05)。處理組POD活性均低于對照組，且在4 d處理組顯著低于對照組；黑麥草對照組和處理組中POD活性均先降低后升高，且差異顯著(P<0.05)，在4和8 d，處理組均顯著低于對照組(P<0.05)，在6 d，處理組顯著高于對照組(P<0.05)。

圖4 黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草過氧化氫酶的影響Fig.4 Effect of M. officinalis queous extract on CAT of L. multiflorum and S. sudanense

3 討論與結(jié)論

植物葉片中的葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，涉及一系列復(fù)雜的生理生化過程。植物可以通過捕獲光能來進(jìn)行體內(nèi)有機(jī)物的合成，其單位面積上葉綠素含量的高低可以反映環(huán)境脅迫狀況以及植物光合能力強(qiáng)弱。因此，可以通過測定植物中葉綠素的含量來判斷植物的生長情況[15]。很多實驗表明，逆境脅迫會打破植物正常的新陳代謝，導(dǎo)致葉綠素含量下降[16-17]，本實驗得出了類似的結(jié)果，處理組的葉綠素含量均低于對照組。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能有以下3個：一是黃花草木樨水浸提液中的化感物質(zhì)造成了氧化脅迫，例如:產(chǎn)生了大量的氧自由基，直接破壞了葉綠素分子；二是化感物質(zhì)導(dǎo)致葉綠素酶活性增強(qiáng)，加快了葉綠素的分解；三是化感物質(zhì)抑制葉綠素相關(guān)酶或其中間產(chǎn)物合成減少[18]。此外，香豆素對黑麥草植株中葉綠素合成的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草，可見蘇丹草的抗逆性要強(qiáng)于黑麥草。

植物種子在萌發(fā)最初階段所需的物質(zhì)和能量需要從胚乳中儲藏養(yǎng)料的分解中獲取，其中主要儲存物質(zhì)為淀粉[19]。本實驗研究中，香豆素處理的淀粉含量顯著高于對照，很顯然黃花草木樨水浸提液中的化感物質(zhì)阻止了淀粉的水解。此外，香豆素對黑麥草淀粉分解的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草，可見蘇丹草的抗逆性要強(qiáng)于黑麥草。

植物在逆境脅迫下會在細(xì)胞內(nèi)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以此來調(diào)節(jié)細(xì)胞體內(nèi)的滲透勢，達(dá)到水分平衡，同時還能保護(hù)細(xì)胞內(nèi)代謝活動所需的酶類活性。彭曉邦等[20]研究發(fā)現(xiàn)，核桃葉水浸提液處理下的黃芩種子中可溶性蛋白含量升高。在本試驗得出了相同的結(jié)果，這可能是在逆境脅迫下，植物體內(nèi)誘導(dǎo)合成一類新的蛋白質(zhì)或者提高原有的蛋白質(zhì)含量，來提高植物的抗逆性[21]。蘇丹草處理組在4 d恢復(fù)至對照水平，而黑麥草在8 d恢復(fù)至對照水平，可見蘇丹草的抗逆性要強(qiáng)于黑麥草。

植物體內(nèi)的可溶性糖與植物的抗逆性和適應(yīng)性相關(guān)，是植物的代謝產(chǎn)物。本研究顯示，處理組蘇丹草中可溶性糖含量均高于對照組，這與李坤等[22]用葡萄根系浸提液對葡萄幼苗實驗結(jié)果一致，說明植物可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)可溶性糖含量來抵御逆境[23]。而黑麥草處理組可溶性糖含量均低于對照組，這與劉蘇嬌等[24]用供試豆科牧草水浸提液處理降低了多花黑麥草的可溶性糖含量結(jié)果一致，這可能是由于多花黑麥草的抗性相較于蘇丹草較弱，導(dǎo)致可溶性糖合成受阻，降低了其含量，進(jìn)而無法提供種子萌發(fā)所需能量和物質(zhì)轉(zhuǎn)換的基礎(chǔ)，從而抑制了種子的萌發(fā)，甚至導(dǎo)致種子死亡。

在正常生長條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡中，但在逆境脅迫下會產(chǎn)生活性氧的積累，進(jìn)而會刺激某些抗逆基因的表達(dá)，建立防御系統(tǒng)，CAT和POD可以將H2O2分解為無毒的H2O和O2，有效清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。整個保護(hù)酶系統(tǒng)的防御能力和保護(hù)酶之間彼此協(xié)調(diào)的綜合結(jié)果有關(guān)，CAT和POD一起維持植物組織過氧化氫的平衡[25]。本實驗蘇丹草和黑麥草處理前期處理組與對照組間存在顯著性差異，后恢復(fù)對照水平，由此可見黃花草木樨水浸提液能引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基濃度的改變，刺激了植株體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)抵御不利傷害，但隨著處理時間的延長，植株可通過自身的保護(hù)酶系統(tǒng)消化活性氧自由基，恢復(fù)至對照水平。

4 結(jié)論

黃花草木樨水浸提液可以通過降低多花黑麥草和蘇丹草種子的發(fā)芽率、根長、根干重、莖長和莖葉干重等生長指標(biāo)，減少植株體內(nèi)葉綠素含量以及改變滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和酶活性等生理生化指標(biāo)來影響黑麥草和蘇丹草的生長。黃花草木樨的抑草能力具有選擇性，蘇丹草與黑麥草均為禾本科，但對其作用機(jī)理影響上存在差別，對黑麥草的抑制作用要強(qiáng)于蘇丹草。黃花草木樨水浸提液在種子萌發(fā)和幼苗生長初期可以很大限度地起到抑制作用，隨著處理時間的延長,黑麥草和蘇丹草會通過自身的機(jī)制抵抗抑制，逐漸恢復(fù)生命力，具有時效性。此外，黃花草木樨水浸提液對根的抑制作用要強(qiáng)于莖。據(jù)此，分析提純黃花草木樨水浸提液中主效化感物質(zhì)，再將其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化研制開發(fā)出新型生物源除草劑。

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Allelopathic effects of an aqueous extract ofMelilotusofficinalisonLoliummultiflorumandSorghumsudanense

WANG Jing-Yi, YAO Dan-Dan, ZHAO Guo-Qi, WU Cai-Xia*, MA Qian-Bo, XU Jun, TANG Chen-Yang

CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China

The aqueous extract ofMelilotusofficinalisis known to inhibit weed growth. To study in detail the allelopathic inhibition of grass growth and elucidate the allelopathic mechanism, an aqueous extract ofM.officinaliswas applied to seeds and seedlings ofLoliummultiflorumandSorghumsudanenseand its effects on their growth were evaluated by measuring several important physiological and biochemical indexes. The aqueous extract ofM.officinalissignificantly (P<0.05) reduced the germination rate, root length, root dry weight, stem length, stem and leaf dry weight of both test species, compared with their respective controls. The aqueous extract ofM.officinalissignificantly reduced the chlorophyll content and increased the starch and soluble protein contents (P<0.05) of both test species. Treatment with the aqueous extract ofM.officinalissignificantly (P<0.05) increased the soluble sugars content inS.sudanenseand significantly (P<0.05) reduced the soluble sugars content inL.multiflorum. The catalase activity inS.sudanensetreated with theM.officinalisextract differed significantly (P<0.05) from that of its control, but returned to control levels after 8 days. The peroxidase activity inS.sudanensetreated with theM.officinalisaqueous extract first decreased and then increased.

Melilotusofficinalisqueous extract;Sorghumsudanense;Loliummultiflorum; allelopathy; mechanism

10.11686/cyxb2017113

http://cyxb.lzu.edu.cn

2017-03-15；改回日期：2017-04-10

國家自然科學(xué)基金(31101764)資助。

王婧怡(1992-)，女，江蘇鎮(zhèn)江人，在讀碩士。E-mail: 1009317930@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: cxwu@yzu.edu.cn

王婧怡, 姚丹丹, 趙國琦, 鄔彩霞, 馬錢波, 徐軍, 唐晨陽. 黃花草木樨水浸提液對蘇丹草和黑麥草的化感作用. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(8): 85-92.

WANG Jing-Yi, YAO Dan-Dan, ZHAO Guo-Qi, WU Cai-Xia, MA Qian-Bo, XU Jun, TANG Chen-Yang. Allelopathic effects of an aqueous extract ofMelilotusofficinalisonLoliummultiflorumandSorghumsudanense. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 85-92.