方樂成 夏慧敏

(南京林業(yè)大學,南京，210037)

麻文俊

(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所)

張新葉

(湖北省林業(yè)科學研究院)

基于SSR標記的楸樹遺傳多樣性及核心種質構建1)

方樂成 夏慧敏

(南京林業(yè)大學,南京，210037)

麻文俊

(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所)

張新葉

(湖北省林業(yè)科學研究院)

利用SSR標記對192個楸樹種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系研究。試驗篩選出13對引物對192份供試材料進行擴增，共獲得89個等位基因位點，有效等位基因平均為3.795 9，Shannon’s多樣性指數(shù)平均值為0.506 6；Nei’s遺傳多樣性平均值為0.667 7。用MEGA6.0軟件對192份楸樹材料進行遺傳距離分析，通過聚類分析構建出供試材料楸樹種質資源間的聚類圖。利用SSR分子標記，采用多次聚類結合位點優(yōu)先的取樣策略，比較了樣本數(shù)不同的4個核心樣本群的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s指數(shù)和Nei’s遺傳多樣等參數(shù)，初步構建了192份楸樹種質材料的46份核心種質。核心種質保留了初始種質23.96%的樣品。

楸樹；微衛(wèi)星；分子標記；遺傳多樣性；核心種質

楸樹(CatalpabungeiC.A.Mey.)屬紫葳科梓樹屬，落葉喬木，原產中國，已有三千多年的栽培歷史，是中國特有的珍貴用材樹種以及著名的園林觀賞樹種[1]。由于其材質優(yōu)良、適應性強、用途廣泛、生長快，自古便有"木王"的美稱，是用于建立復合農林業(yè)建設的理想樹種[2]。由于楸樹自花不孕，種子發(fā)芽率低，扦插生根困難，再加上人們對它的長期采伐利用，導致楸樹資源破壞嚴重[3]。因此，全面了解楸樹資源狀況，構建核心種質，對我國楸樹資源的合理開發(fā)利用有重要的理論價值和實踐意義。

核心種質是種質資源的核心子集，能夠通過最少數(shù)的遺傳資源，最大限度地保存整個資源群體的遺傳多樣性[4]。Frankel[5]首先提出核心種質的概念并將其作為研究種質資源的關鍵。由于基于形態(tài)學的傳統(tǒng)研究思路和方法存在很多先天不足，種質資源基礎研究一直效率低下，隨著分子標記和測序技術的快速發(fā)展，基因組學理論和研究方法不斷深入到種質資源研究領域中，為種質資源的研究方法開拓了新的思路[6]。運用分子標記可以闡述物種起源演化，評估資源基因結構多樣性，而新一代測序技術[7]的應用能夠進行基因挖掘并且在全基因組水平上比較不同種質資源的基因組差異。鑒于此，本研究選用SSR標記對我國不同地區(qū)的楸樹資源進行研究，分析其遺傳多樣性，目的在于對楸樹進行核心種質的初步構建并為楸樹種質資源的收集利用和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試楸樹資源共192份，其中包括洛陽楸樹基因庫資源85份，南陽楸樹基因資源64份，偃師楸樹基因資源15份，鄂西北楸樹基因資源28份。選取各楸樹資源幼嫩葉片5～6片，用75%酒精擦拭后，放入冰盒帶回實驗室，于冰箱-80 ℃保存，用于DNA樣品提取。

1.2 分子標記

DNA提取：采用改良的CTAB-SDS結合法提取楸樹葉片DNA，用1%的瓊脂糖凝膠以及ND-2000紫外分光光度儀檢測DNA濃度，合格的DNA樣品保存于-20 ℃用于后續(xù)實驗。

SSR引物篩選：根據(jù)中國林科院林業(yè)所提供的3 646個SSR位點信息，應用引物設計軟件Primer premier5.0共設計出85對引物，由上海捷瑞公司合成。為了得到清晰的SSR指紋圖譜，隨機選取6個楸樹DNA樣品作為模板DNA，從合成的85對引物中篩選出13對效果較好的引物,具體信息見表1。

表1 楸樹SSR引物序列及特征

SSR分析：利用篩選出來的13對引物對192個DNA樣品進行含熒光堿基的PCR反應，產物交由美吉生物公司用ABI3730毛細管電泳檢測多態(tài)性，原始數(shù)據(jù)運用genemapper v3.7軟件分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用POPGENE V1.31軟件計算Nei’s遺傳距離[8]、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、擴增位點的多態(tài)性信息量以及香農信息指數(shù)等指標評價13對引物在192個楸樹資源中的遺傳多樣性。運用非加權算數(shù)平均法(UPGMA)，對192份材料進行聚類分析，并在MEGA6.0軟件中顯示出聚類圖[9]。

1.4 核心種質構建

本試驗采取多次聚類，以隨機取樣策略為對照策略[10]，應用位點優(yōu)先的取樣方法[11]。通過UPGMA方法進行遺傳距離分析，用MEGA6.0軟件構建聚類圖，根據(jù)樹形圖，從分類水平最低的兩個相近的遺傳材料中選擇具有最多稀有等位基因數(shù)的材料，如果兩個相近的遺傳材料具有相等數(shù)目的稀有等位基因，則優(yōu)先選擇稀有等位基因頻率值較小的，如果這兩個值仍然相同則隨機選擇，組內只有一個材料的直接選入，對所取出的材料再次聚類，直到取得的遺傳材料數(shù)量占總數(shù)的20%～30%，構成核心種質的樣本群[12]。

1.5 核心種質評價

對核心種質和初始種質的有效等位基因數(shù)、Shannon’s多樣性信息指數(shù)、遺傳多樣性等指標進行t檢驗，以此評價核心種質的代表性。

2 結果與分析

2.1 SSR分子標記遺傳多樣性

采用SSR標記對192份楸樹資源的多樣性進行分析。13對SSR引物共檢測到89個等位基因，其中88個為多態(tài)性等位基因，多態(tài)率達99%，每對引物獲得的等位基因數(shù)從3(28和47號引物)到16(62號引物)個不等，平均6.85個，擴增所得的產物大小在150～500 bp。

擴增結果發(fā)現(xiàn)，有的楸樹資源產生了特有的條帶，可作為重要的分子性狀用于品種鑒定。192份楸樹資源經(jīng)13對引物擴增產生的89條多態(tài)性譜帶中，特有性譜帶有4條，占4.49%。其中，55號引物在基因資源“9.2.3(鄂西北)”上有一條特有帶，79號引物也在該資源上有一條特有帶；而70號引物在基因資源“西峽8號”和“7.1(鄂西北)”上各有一條特有譜帶(表2)。

表2 192份楸樹種質的特有SSR標記

運用13對引物對各楸樹樣品的STR分型數(shù)據(jù)，結合POPGENE軟件的數(shù)據(jù)類型，用英文字母表示不同的帶型，形成可鑒定各品種的特征指紋代碼。

2.2 楸樹種質的聚類抽樣

運用POPGENE軟件分析192份楸樹種質資源的遺傳多樣性。192份楸樹資源的Shannon’s指數(shù)平均為0.506 6，有效等位基因平均為3.795 9，Nei’s遺傳多樣性的值平均為0.667 7。從群體間遺傳多樣性分析來看：洛陽的Shannon’s指數(shù)和Nei’s遺傳多樣性最高，分別為0.498 3和0.649 7；其次是鄂西北，分別是0.475 8和0.614 4；南陽是0.492 7和0.587 5；偃師最低，Shannon’s指數(shù)和Nei’s遺傳多樣性量分別是0.459 3和0.593 6。

對192份楸樹材料進行遺傳距離分析，用MEGA 6.0構建出這192份供試材料的聚類圖(圖1)。該聚類圖能夠很好地體現(xiàn)了各材料之間的親緣關系。根據(jù)聚類圖，大致可將192份楸樹資源可分為4大類。

圖1 192份楸樹種質資源的聚類分析

第一類(Ⅰ)包括41份楸樹種質資源，其中洛陽39份(1012等)，占第一類資源的95.1%，偃師1份(7-5)，南陽1份(新野4號)，各約占第一類的2.44%；第二類(Ⅱ)包括91份楸樹種質資源，其中洛陽42份(3103等)，占46.15%，南陽35份(鎮(zhèn)平3號等)，占第二類的38.46%，偃師12份(3-1等)，約占13.19%，鄂西北2份(9.1，8.1)，占第二份總數(shù)的2.2%；第三類(Ⅲ)包括52份楸樹資源，其中洛陽3份(6019，1049，3422)，占第三類總數(shù)的5.77%，南陽27份(鎮(zhèn)平1號等)，占第三類總數(shù)的51.92%，鄂西北22份(7.1等),約占第三類總數(shù)42.3%；第四類(Ⅳ)6份楸樹種質資源，其中洛陽1份(9008)，南陽1份(淅川2號)，各占第四類的16.67%，鄂西北4份(9.2.3，9.3.1，9.5.2，13.1)，占第四類總數(shù)的66.67%。

表3 樣品群間的遺傳多樣性比較

全部192個楸樹樣品，經(jīng)過4次聚類抽樣，最后得到一個由46個樣品組成的核心樣本群，并用等位點數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s指數(shù)等指標評價4個樣品群的遺傳多樣性。

經(jīng)過統(tǒng)計，樣品群4的等位點數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon’s指數(shù)、Nei’s遺傳多樣性值等指標均是最高，可以作為最后的核心種質。

核心種質保留了初始種質23.96%的樣品，其中有效等位基因數(shù)為84，保留率為94.38%；有效等位點數(shù)為3.934 3，保留率為103.6%；Shannon’s指數(shù)為0.510 0，保留率為101.8%；Nei’s遺傳多樣性值為0.665 5保留率為99.7%。

46個核心種質：4018、9024、1008、1039、鎮(zhèn)平3號、西峽3號、淅川9號、9.2.1、3212、2-1、8-5、9008、7-8、5016、JS1、7-5、6025、130、1117、4023、1-52、3422、4021、8-12、內鄉(xiāng)1號、鎮(zhèn)平5號、淅川3號、內鄉(xiāng)13號、淅川6號、鄧州3號、西峽8號、鄧州17號、唐河2號、鄧州18號、臥龍2號、臥龍1號、南召13號、9.1.3、7.4、7.1、5.6、9.5.3、9.3.1、9.2.3、12.5、12.1。其中洛陽種質資源15份，占核心種質總數(shù)的32.6%；南陽種質資源16份，占核心種質總數(shù)的34.8%；偃師種質資源5份，占總數(shù)的10.9%；鄂西北種質資源10份占核心種質總數(shù)的21.7%。

2.3 楸樹核心種質有效性分析檢驗

對2個群體的有效等位基因、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s指數(shù)分別作t檢驗。從表4中t測驗的結果可以看出核心種質的有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s指數(shù)在概率0.05水平上與初始種質差異不顯著，可見核心種質能很好的代表原始種質。

表4 初始種質和核心種質的t測試結果

保留種質是指去除核心種質后初始種質中剩余的部分，它可以作為核心種質的后備資源，當無法在核心種質中匹配到所需性狀時，即可從其中尋找。將保留種質與核心種質在樣品數(shù)，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s指數(shù)幾個方面比較分析。

從表5可知核心種質的有效等位基因數(shù)、Shannon’s指數(shù)均高于保留種質，應該優(yōu)先使用。

分別對保留種質的有效等位基因、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s指數(shù)進行t檢驗，結果如表6所示。從表6中可以看出，在概率0.05水平上保留種質與核心種質差異不顯著，即核心種質較好的保留了全部種質的遺傳多樣性，丟失不顯著。

表5 核心種質與保留種質遺傳多樣性比較

表6 保留種質和核心種質的t測試結果

3 結論與討論

核心種質構建就是用科學的方法從整個種質資源中選出一部分樣本，以最小的遺傳資源數(shù)量來代表整個遺傳資源的多樣性，國內外不同植物核心種質庫的構建，通常選擇整個樣本群的5%～30%，但總量不超過3 000份[14]。原始群體的大小和遺傳結構是影響核心種質取樣比例的關鍵因素，總資源多且遺傳多樣性小的物種，取樣比例可以適當縮小，反之則增加取樣比例[15]。本研究所使用的原始群體數(shù)量較少，同時為了盡量減少遺傳多樣性的丟失，將核心種質的總體取樣比例設置在25%。

隨著核心種質在遺傳育種中的作用受到廣泛的認同，大多數(shù)農作物和園林植物都展開了核心種質的構建工作。傳統(tǒng)的核心種質構建方法，是比較不同種質資源在植物學、形態(tài)學、農藝、品質性狀上的差異來剔除親緣關系相近的樣品并且抽取核心種質[15]。但是這些表型性狀易受外界因素影響，尤其是數(shù)量性狀受到氣候、地理位置等環(huán)境因素影響而表現(xiàn)不穩(wěn)定。分子標記數(shù)據(jù)不受環(huán)境等因素的影響，可以作為植物形態(tài)性狀和植物生理特性的有效補充。AFLP、RAPD、SSR等分子標記技術廣泛應用于育種工作，使育種工作者能從DNA水平上區(qū)分植物樣品并構建核心種質[16]。

然而，由于分子生物學實驗費用較高，對于種質資源原始群體龐大的物種，很難對每一個樣品都用分子標記檢測其多樣性信息，董玉琛[17]認為大樣本群的核心種質構建可以分兩步進行，首先根據(jù)表型數(shù)據(jù)構建初選樣品群，再對初選的樣品群進行分子標記分析，最終建立核心種質。本實驗由于總體樣本量較少，所以直接采用分子標記分析的方法，但是擴大了取樣比例。

目前，在分子水平上對林木進行核心種質構建研究較少，尤其是在楸樹的種質資源構建方面，目前只有石欣等運用ISSR標記對10個類型的156個單株楸樹進行了遺傳分析[18]，以及郝明灼等利用ISSR與SRAP結合的方法對138份楸樹材料進行了分析[19]。本試驗首次利用13對楸樹SSR引物，對192份楸樹種質資源進行擴增，13對引物共檢測到89個等位基因，其中88個為多態(tài)性等位基因，多態(tài)百分率達99%。根據(jù)統(tǒng)計結果，洛陽群體的Shannon’s指數(shù)與遺傳多樣性最高，可能與樣本數(shù)量以及洛陽的地理位置有關，由于洛陽樣本數(shù)量最多，且洛陽地勢西高東低，境內山川丘陵交錯，地形復雜多樣，全年氣候四季分明，在適宜楸樹生長的基礎上一定程度的豐富了洛陽楸樹資源的遺傳多樣性。

核心種質在構建中需要的不是最大化等位基因多樣性，而是種質間的遺傳距離，因為遺傳距離越大，說明種質間差異越大，對育種越有利。本實驗使用的多次聚類法正是基于Nei’s遺傳距離，用UPGMA方法進行遺傳距離分析，從分類水平最低的兩個遺傳材料中選出合適的樣品，將種質間的遺傳距離作為優(yōu)先參考。

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Genetic Diversity Analysis and Primary Core Collection ofCatalpabungeiGermplasm with SSR Markers//

Fang Lecheng, Xia Huimin

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China);

Ma Wenjun

(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry);

Zhang Xinye

(Hubei Academy of Forestry)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：1-5.

Constructing core collection is a useful way to improve efficiency of conserve and manage species germplasm. We used SSR markers for the genetic diversity analysis and genetic relationship research with 192Catalpabungeigermplasm, selected 13 pairs of SSR primers, amplified all of the 192 samples by these 13 pairs of primers, and found 89 alleles. The average effective number of allele (Ne) was 3.795 9, average of Shannon’s diversity index (I) was 0.506 6, and Nei’s genetic diversity (H) average number was 0.667 7. The analysis of genetic distance of 192C.bungeisamples with MEGA6.0, and the construction of the dendrogram ofCatalpasamples by cluster analysis was conducted. With SSR markers and the sampling strategy of multiple cluster binding loci preferential, we primarily constructed 4 core sample groups with different numbers. In these 4 groups, 46 core collection of the total 192 collectedCatalpatrees were compared by the parameters including the number of allele, effective number of allele, Shannon’s index and Nei’s genetic diversity. The core collections retained 23% of the original collections.

Catalpabungei; SSR; Molecular marker; Genetic diversity; Core collection

方樂成，男，1988年7月生，南京林業(yè)大學林學院，博士研究生。E-mail:651282772@qq.com。

張新葉，湖北省林業(yè)科學研究院，研究員。E-mail:1641135733@qq.com。

2017年1月25日。

S792.21

1)林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404101)。

責任編輯：潘 華。