張楠楠，薛冬，崔曉霞，趙晉銘，郭娜，王海棠，邢邯

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大豆組成型三重反應(yīng)基因的克隆與功能分析

張楠楠，薛冬，崔曉霞，趙晉銘，郭娜，王海棠，邢邯

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095）

【目的】植物激素乙烯參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及生物與非生物脅迫過(guò)程。組成型三重反應(yīng)基因作為乙烯受體下游一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，結(jié)合乙烯受體共同參與乙烯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究通過(guò)對(duì)大豆（）的組成型三重反應(yīng)基因進(jìn)行克隆和誘導(dǎo)表達(dá)分析，以及在大豆發(fā)狀根中過(guò)表達(dá)該基因后進(jìn)行疫霉根腐病的抗性分析，探究在大豆與疫霉菌互作過(guò)程中的功能?！痉椒ā坷猛纯寺〉姆椒?，以擬南芥的序列為探針，在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源性最高的基因即為大豆的（），并從Williams82中將克隆出來(lái)。對(duì)進(jìn)行多重序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和疫霉菌的誘導(dǎo)表達(dá)分析。構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體pBinGFP2:。應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得大豆發(fā)狀根，經(jīng)GFP熒光篩選得到大豆過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性發(fā)狀根和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的陰性對(duì)照發(fā)狀根。對(duì)過(guò)表達(dá)發(fā)狀根和陰性對(duì)照發(fā)狀根侵染疫霉菌后，檢測(cè)病斑長(zhǎng)度、疫霉生物量和抗性相關(guān)基因的表達(dá)?！窘Y(jié)果】根據(jù)同源序列比對(duì)結(jié)果，將與擬南芥（）同源性最高（75.3%）的大豆基因命名為，從Williams82中克隆得到的CDS序列。該基因的CDS序列全長(zhǎng)2 511 bp，編碼836個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，蛋白質(zhì)量為92.35 kD，等電點(diǎn)為6.51。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵特征。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，GmCTR1與菜豆（）、蒺藜苜蓿（）的CTR1親緣關(guān)系十分相近，在同一個(gè)分支上，且與菜豆的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果表明，在大豆疫霉菌P6497侵染后，受誘導(dǎo)逐漸上調(diào)表達(dá)，在侵染48 h后表達(dá)水平達(dá)到最高，隨后表達(dá)量降低。利用酶切連接方法將的CDS序列構(gòu)建到植物過(guò)表達(dá)載體pBinGFP2中，PCR和酶切驗(yàn)證獲得了重組質(zhì)粒pBinGFP2:。對(duì)發(fā)狀根接種疫霉菌后發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)減弱了對(duì)疫霉根腐病的抗性，疫霉菌侵染36 h后過(guò)表達(dá)發(fā)狀根與對(duì)照相比病斑長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)。過(guò)表達(dá)發(fā)狀根中疫霉菌的生物量與對(duì)照相比增加，與大豆抗病反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低?！窘Y(jié)論】在大豆與疫霉菌的互作過(guò)程中發(fā)揮一定的負(fù)調(diào)控作用。

大豆；；表達(dá)分析；疫霉根腐病抗性；大豆發(fā)狀根

0 引言

【研究意義】由大豆疫霉菌（）侵染引起的大豆疫霉根腐病是世界范圍內(nèi)的土傳性病害，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和質(zhì)量。植物激素乙烯能夠響應(yīng)植物的生物脅迫，對(duì)植物的抗病過(guò)程發(fā)揮作用。因此，挖掘乙烯信號(hào)通路中對(duì)大豆疫霉根腐病抗性起作用的關(guān)鍵基因，明確其作用機(jī)制，對(duì)于大豆抗病分子育種意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】乙烯是植物體內(nèi)一類十分重要的氣體激素，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和多個(gè)生理過(guò)程，如果實(shí)成熟、衰老、種子萌發(fā)，以及病原菌侵染和脅迫反應(yīng)等[1]。由乙烯介導(dǎo)的調(diào)控過(guò)程通過(guò)乙烯的生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)水平實(shí)現(xiàn)。乙烯的生物合成是由Yang cycle來(lái)完成的。乙烯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由乙烯受體及下游一系列調(diào)控因子來(lái)調(diào)控[2]。在擬南芥中，乙烯的感知是通過(guò)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與膜相結(jié)合的乙烯受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這些乙烯受體在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起負(fù)向調(diào)控作用，并且在功能上冗余，其雙、三和四突變體都會(huì)造成植物體對(duì)乙烯的持續(xù)性響應(yīng)[3]。組成型三重反應(yīng)（）基因作為乙烯信號(hào)通路中一個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與植物的乙烯信號(hào)響應(yīng)和傳遞。CTR1蛋白與乙烯受體蛋白互作共同負(fù)向調(diào)控植物乙烯反應(yīng)。在沒有乙烯存在時(shí)，擬南芥（）的5個(gè)乙烯受體協(xié)同作用激活CTR1，阻礙乙烯的傳遞，使植物表現(xiàn)出乙烯響應(yīng)不敏感；當(dāng)存在乙烯時(shí)，受體通過(guò)與乙烯相結(jié)合來(lái)阻礙CTR1的激活，從而啟動(dòng)下游的乙烯信號(hào)傳遞[4]。編碼的是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游MAPKKK家族中Raf亞家族的一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它對(duì)于乙烯信號(hào)途徑受體下游組分的激活和信號(hào)傳遞具有十分關(guān)鍵的作用。在擬南芥中篩選鑒定到了突變體，它在幼苗期和成熟植株中均表現(xiàn)出持續(xù)的乙烯響應(yīng)，這表明編碼了一個(gè)負(fù)調(diào)控乙烯信號(hào)途徑的蛋白質(zhì)[1]。迄今為止，已對(duì)較多植物的進(jìn)行克隆并進(jìn)行功能研究。在擬南芥中是單拷貝的，通過(guò)磷酸化過(guò)程負(fù)調(diào)控所有乙烯受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。番茄（）的由多基因家族構(gòu)成，包含了4個(gè)——、、和，它們參與不同的組織發(fā)育和生理過(guò)程。長(zhǎng)度是的2倍，二者的基因結(jié)構(gòu)高度保守，外顯子和內(nèi)含子數(shù)目完全一致。在擬南芥突變體中超量表達(dá)能恢復(fù)正常的乙烯信號(hào)傳遞，表明與功能上具有保守性。此外，能被乙烯誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，并且受果實(shí)成熟的誘導(dǎo)[5]。與、同源性較高，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中持續(xù)表達(dá)而不被乙烯誘導(dǎo)。蛋白互作試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LeCTR2與Ⅰ類乙烯受體LeETR1、LeETR2特異性互作。在番茄植株中過(guò)表達(dá)的N端結(jié)構(gòu)會(huì)改變植株的生長(zhǎng)特性，影響乙烯響應(yīng)基因、的表達(dá)，但不會(huì)影響到乙烯的合成。同時(shí)，過(guò)表達(dá)的番茄對(duì)灰霉病的感病性增強(qiáng)[6-7]；和在葉片中的表達(dá)量高于果實(shí)，也不受乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)[8]。利用VIGS技術(shù)得到的煙草（）沉默植株，在煙草花葉病毒侵染后表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)，受乙烯誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶表達(dá)顯著上調(diào)。與正常煙草相比，受侵染部位病原菌的擴(kuò)展受到明顯抑制。說(shuō)明煙草植株持續(xù)的乙烯響應(yīng)對(duì)于病原菌侵染后的過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）具有促進(jìn)作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫和器官發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。從小麥（）中克隆得到的表達(dá)受干旱、鹽脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)，在煙草中過(guò)量表達(dá)小麥會(huì)造成植株耐鹽性明顯下降，表明負(fù)調(diào)控植物耐鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10]。木瓜的-介導(dǎo)的乙烯信號(hào)傳遞參與果實(shí)的成熟和軟化過(guò)程。果實(shí)成熟后期表達(dá)上調(diào)，而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1-甲基環(huán)丙烯處理后，基因表達(dá)水平降低且果實(shí)的軟化程度減弱。這表明在木瓜的成熟過(guò)程中起作用[11]。此外，一系列文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了黃瓜[2]、西葫蘆[12]、月季[13]、獼猴桃[14]、蘋果[15]和梨[16]等植物中的功能，這些參與植物的花器官分化、發(fā)育和果實(shí)成熟等生理過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量的研究表明，在植物的生長(zhǎng)、果實(shí)成熟以及逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用。但目前對(duì)于在大豆的生長(zhǎng)和生理過(guò)程中的作用研究有限，特別是對(duì)大豆抗病過(guò)程的影響更是所知甚少。因此，探究大豆在大豆疫霉根腐病抗性過(guò)程中所起的作用，進(jìn)一步明確其抗病機(jī)制和信號(hào)傳遞過(guò)程，對(duì)于大豆抗病分子育種意義重大?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用同源克隆的方法從栽培大豆中克隆得到的CDS全長(zhǎng)序列，通過(guò)GmCTR1的序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析和大豆疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)分析，應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得大豆發(fā)狀根，對(duì)過(guò)表達(dá)陽(yáng)性發(fā)狀根的抗病性分析開展功能研究，為進(jìn)一步探究大豆與疫霉菌互作過(guò)程的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院完成。

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

供試大豆品種Williams 82和Williams由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供。試驗(yàn)所需大豆疫霉菌株P(guān)6497由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王源超教授提供。植物表達(dá)載體pBinGFP2由植物保護(hù)學(xué)院竇道龍教授提供。發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院邢邯教授實(shí)驗(yàn)室保存。

挑選籽粒飽滿的大豆Williams 82種子播種于混有蛭石和營(yíng)養(yǎng)土的塑料杯中，每杯8粒，置于25℃，相對(duì)濕度60%，16 h/8 h光周期條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待幼苗生長(zhǎng)至兩片真葉完全展開后，取嫩葉液氮速凍保存用于目的基因的克隆。

將籽粒飽滿無(wú)病斑的大豆Williams種子在與上述相同條件下培養(yǎng)至兩片真葉完全展開后將大豆幼苗拔出并清洗根部蛭石，注意保存植株完整。將V8培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d的大豆疫霉菌用注射器吸打成勻漿，用手術(shù)刀在大豆根部劃出1 cm長(zhǎng)的傷口后接種適量疫霉菌，在接種后0、12、24、36、48和72 h后取傷口上下2 cm長(zhǎng)的根部組織，用液氮速凍保存于-80℃冰箱備用。

1.2 基因克隆與序列分析

利用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取大豆Williams 82葉片的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以擬南芥（）基因序列為探針在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.phytozome.net）中進(jìn)行BLAST搜索，選擇同源性最高的基因命名為。利用高保真酶（Vazyme）PCR擴(kuò)增目的片段后切膠回收，膠回收試劑盒（AxyGen）回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接至pEASY-Blunt（TransGen）克隆載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5（TransGen），挑選陽(yáng)性克隆菌液送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果用BioXM2.6軟件進(jìn)行分析；利用在線軟件ExPASy（http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html）分析蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)；利用NCBI的CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ docs/cdd_search.html）程序分析氨基酸序列；利用DNAMAN程序進(jìn)行多重序列比對(duì)；利用MEGA 6程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物GmCTR1-1-F/R（表1）。

1.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以測(cè)序正確的質(zhì)粒pEASY-GmCTR1為模板，添加酶切位點(diǎn)的特異性引物GmCTR1-2-F/R（表1），利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收擴(kuò)增的目的片段。將目的片段與植物表達(dá)載體pBinGFP2分別用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ雙酶切后，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒后用pBinGFP2-F和GmCTR1-2-R引物進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證得到重組質(zhì)粒。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化與篩選

利用電擊法將重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599。挑取K599的陽(yáng)性克隆，置于含有卡那霉素（濃度為50 μg·mL-1）的液體LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24 h，4 000 r/min離心3 min收集菌體，用10 mmol·L-1MgCl2重懸菌體，并稀釋至OD600=0.6備用。挑選籽粒飽滿表面無(wú)病斑創(chuàng)傷的Williams種子用氯氣消毒，滅菌ddH2O浸泡24 h后去種皮種植于含有7%瓊脂培養(yǎng)基的組培瓶中，置于25℃，16 h/8 h光周期條件的培養(yǎng)室生長(zhǎng)5 d。在超凈臺(tái)中剪下生長(zhǎng)良好的大豆子葉，用無(wú)菌手術(shù)刀在每個(gè)子葉背面挖洞，然后平鋪于含有頭孢和羧芐霉素（濃度均為200 μg·mL-1）的White培養(yǎng)基中，將稀釋好的K599菌液滴入挖好的洞內(nèi)，25℃暗培養(yǎng)20 d。利用體視鏡進(jìn)行GFP熒光篩選獲得大豆陽(yáng)性發(fā)狀根。

1.5 大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的抗病性鑒定

經(jīng)GFP熒光篩選后挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的過(guò)表達(dá)發(fā)狀根與對(duì)照發(fā)狀根組織各5個(gè)，置于平鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。在長(zhǎng)滿疫霉菌絲的V8培養(yǎng)基邊緣處切取1 mm3疫霉菌塊接種到發(fā)狀根組織上，置于24℃暗培養(yǎng)箱中。接種后進(jìn)行表型觀察與病斑測(cè)量。將V8培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)4 d的疫霉菌邊緣切取少量菌塊，置于液體V8培養(yǎng)基中，24℃暗培養(yǎng)3 d。用滅菌自來(lái)水清洗大豆疫霉菌后，倒入15 mL滅菌自來(lái)水進(jìn)行12 h的暗培養(yǎng)。利用顯微鏡觀察游動(dòng)孢子的萌發(fā)情況后稀釋疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液至濃度為105個(gè)/mL。用游動(dòng)孢子懸浮液侵染大豆發(fā)狀根組織，于侵染12和24 h后取樣，用液氮速凍保存于-80℃冰箱中備用。

在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.phytozome.net）中搜索獲得大豆-1,3-葡聚糖酶基因（）、病程相關(guān)基因非表達(dá)子基因（）、病程相關(guān)蛋白基因（）和（）序列。利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

表1 試驗(yàn)所用引物序列

下劃線部分表示酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基Restriction sites and protective bases are underlined

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

參照SYBR Green Master Mix（Vazyme）試劑的說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以大豆（GenBank登錄號(hào)為TC204137）作為內(nèi)參基因，對(duì)基因的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用GraphPad prism 5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1

根據(jù)同源序列比對(duì)結(jié)果，將與擬南芥（）同源性最高（75.3%）的大豆基因命名為。經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)長(zhǎng)度在2 500 bp左右的特異性條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示目的條帶與Phytozome 11.0大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列吻合，證明已成功克隆到了。

的CDS序列全長(zhǎng)為2 511 bp，編碼836個(gè)氨基酸的多肽，其蛋白質(zhì)量為92.35 kD，等電點(diǎn)為6.51。與結(jié)構(gòu)相似，均含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。

應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)顯示（圖2），GmCTR1的氨基酸序列與擬南芥、番茄、水稻（）、蒺藜苜蓿（）、煙草、小麥的CTR1氨基酸的羧基末端保守性較強(qiáng)，都含有CTR1典型的作用位點(diǎn)基序Ⅰ——ATP binding site和基序Ⅱ——active site。

M：DNA marker；1：PCR產(chǎn)物PCR products of GmCTR1

圖2 GmCTR1與其他植物CTR1氨基酸序列多重比對(duì)

用MEGA 6對(duì)GmCTR1與其他植物的CTR1氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果表明大豆CTR1與菜豆（）、蒺藜苜蓿的CTR1在同一分支上，與菜豆CTR1的親緣關(guān)系最近。

圖3 大豆GmCTR1與其他植物CTR1蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2受大豆疫霉侵染誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析接種大豆疫霉菌后的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)受疫霉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量在48 h達(dá)到最高，是對(duì)照的5.4倍，而后表達(dá)水平下降（圖4）。

2.3 大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的獲得與鑒定

將重組質(zhì)粒pBinGFP2:利用電擊法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌株。通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在大豆品種Williams中轉(zhuǎn)化。通過(guò)GFP熒光篩選獲得了大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根（圖5-A），說(shuō)明重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入了發(fā)狀根組織。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)陽(yáng)性發(fā)狀根（OE：下同）與空質(zhì)粒對(duì)照發(fā)狀根（EV：下同）中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示大豆陽(yáng)性發(fā)狀根中的表達(dá)水平顯著升高，表明通過(guò)GFP熒光篩選的大豆發(fā)狀根中過(guò)量表達(dá)了（圖5-B）。

**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

2.4 大豆過(guò)表達(dá)發(fā)狀根對(duì)大豆疫霉根腐病的抗性分析

2.4.1 病斑分析 將通過(guò)GFP熒光篩選的大豆過(guò)表達(dá)陽(yáng)性發(fā)狀根和對(duì)照發(fā)狀根接種大豆疫霉菌發(fā)現(xiàn)，在侵染36 h后發(fā)狀根出現(xiàn)褐色病斑，過(guò)表達(dá)發(fā)狀根的發(fā)病程度較重（圖6-A），過(guò)表達(dá)發(fā)狀根的病斑長(zhǎng)度為12.84 mm，對(duì)照病斑長(zhǎng)度為9.06 mm（圖6-B），說(shuō)明過(guò)表達(dá)后發(fā)狀根組織的抗病性減弱。

2.4.2 疫霉生物量測(cè)定 用濃度為1×105個(gè)/mL的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子處理發(fā)狀根組織，測(cè)定12和24 h后大豆發(fā)狀根中疫霉生物量的相對(duì)變化。結(jié)果表明，在游動(dòng)孢子侵染24 h后，對(duì)照發(fā)狀根與過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性發(fā)狀根中疫霉生物量的變化差異明顯，過(guò)表達(dá)陽(yáng)性發(fā)狀根中疫霉生物量達(dá)到對(duì)照的2倍（圖6-C）。

2.4.3 抗性基因表達(dá)分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析過(guò)表達(dá)陽(yáng)性發(fā)狀根和對(duì)照發(fā)狀根在大豆疫霉菌侵染后抗性信號(hào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的發(fā)狀根中、、和的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比在侵染12 h后沒有顯著差異，24 h后基因表達(dá)受到明顯抑制，下調(diào)40倍，下調(diào)5倍，下調(diào)10倍，下調(diào)35倍（圖7）。

A：體視鏡下觀察大豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的綠色熒光蛋白（GFP）；a：過(guò)表達(dá)發(fā)狀根（OE）；b：空質(zhì)粒對(duì)照發(fā)狀根（EV）。B：過(guò)表達(dá)發(fā)狀根（OE）與對(duì)照發(fā)狀根（EV）中GmCTR1的相對(duì)表達(dá)量

A：大豆疫霉菌侵染36 h后的病斑表型；B：病斑長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：大豆發(fā)狀根受疫霉侵染12和24 h后疫霉菌的生物量測(cè)定

圖7 大豆發(fā)狀根在大豆與疫霉菌互作過(guò)程中抗性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

作為乙烯信號(hào)通路中的一個(gè)負(fù)向調(diào)控因子從栽培大豆中分離得到，該基因編碼836個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。與擬南芥[1]、番茄[5]和黃瓜[2]等植物的結(jié)構(gòu)十分相似，都包含了15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，GmCTR1與其他植物的CTR1都含有CTR1蛋白的典型結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明，屬于真核生物CTR1類基因，與菜豆、苜蓿等植物親緣關(guān)系十分相近，屬于同一個(gè)分支。

本研究對(duì)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在大豆疫霉菌P6497侵染W(wǎng)illiams后上調(diào)表達(dá)，在侵染48 h的表達(dá)量達(dá)到最大值，72 h后基因表達(dá)水平下降。前人研究顯示，Williams在接種P6497疫霉菌3和5 d后，對(duì)的表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)下降。這一結(jié)果是對(duì)大豆與疫霉菌互作后期表達(dá)的分析，本研究探究了疫霉菌侵染早期的表達(dá)情況。綜上所述，參與了大豆和疫霉菌的互作過(guò)程[17]。

過(guò)量表達(dá)后減弱了對(duì)大豆疫霉菌的抗性，大豆過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性發(fā)狀根在接種疫霉菌后與對(duì)照相比發(fā)病程度加重，病斑明顯變長(zhǎng)，疫霉菌的生物量增加，表明負(fù)調(diào)控大豆對(duì)疫霉菌的抗性。這與煙草和番茄中的研究結(jié)果相同。在煙草花葉病毒侵染煙草過(guò)程中，沉默植株由于乙烯的持續(xù)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)，受乙烯誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶表達(dá)顯著上調(diào)，與野生型相比表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)[9]。番茄中過(guò)表達(dá)的N端，能激活植株的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)灰霉病菌侵染后過(guò)表達(dá)植株感病性增強(qiáng)[6]。大豆GmCTR1的N端和C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄湓谡{(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)中所起的具體作用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

當(dāng)植物遭受病原菌侵染時(shí)，乙烯釋放量增加，激活抗病物質(zhì)幾丁質(zhì)酶、PDF1.2、Harpin蛋白產(chǎn)生和積累，同時(shí)引發(fā)程序性細(xì)胞死亡過(guò)程[18-20]。大豆疫霉根腐病的抗性與-1,3-葡聚糖酶活性呈正相關(guān)[21]，-1,3-葡聚糖酶通過(guò)水解真菌細(xì)胞壁的主要成分-1,3-葡聚糖來(lái)抑制真菌生長(zhǎng)。作為調(diào)控植物病害抗性的關(guān)鍵基因，對(duì)植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）起調(diào)控作用。NPR1是水楊酸、茉莉酸和乙烯介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑的交叉節(jié)點(diǎn)，與TGA、WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控基因表達(dá)和植物抗性[22-25]。病程相關(guān)蛋白是病原菌侵染后植物產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)。大豆中PR1a、PR4、PR6和PR10等PR蛋白在機(jī)械損傷和大豆疫霉菌侵染過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)[26]。PR5屬于類甜味蛋白，參與植物病原菌互作過(guò)程中相關(guān)代謝物的合成過(guò)程，對(duì)卵菌綱病原菌的侵染具有積極作用[27]。大豆疫霉菌侵染后，、、和在過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性發(fā)狀根中表達(dá)量與對(duì)照相比顯著下調(diào)，這進(jìn)一步證實(shí)大豆發(fā)狀根受大豆疫霉菌侵染過(guò)程中的過(guò)表達(dá)干擾了正常的抗性反應(yīng)過(guò)程。

4 結(jié)論

利用同源克隆方法克隆得到了，該基因的CDS全長(zhǎng)2 511 bp，編碼836個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。GmCTR1具有CTR1蛋白的典型結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵位點(diǎn)。在大豆與大豆疫霉菌互作過(guò)程中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控功能。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

Cloning and Functional Analysis of the

ZHANG NanNan, XUE Dong, CUI XiaoXia, ZHAO JinMing, GUO Na, WANG HaiTang, XING Han

(College of Agriculture, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/Key Laboratory for Biology and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture/National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095)

【Objective】The plant hormone ethylene involved in plant growth, development, biotic and abiotic stress processes. Thegene acts as a key negative regulator of ethylene receptors and participates in ethylene signal transduction pathway by combining ethylene receptor. In order to conduct a preliminary study on the function of,was cloned and its expression was analyzed, and then transformed into soybean hairy roots for analyzing resistance to Phytophthora root rot of soybean.【Method】Based on the sequence of(),which with the highest homology was selected by BLAST, and it was named. The coding sequence ofwas isolated from Williams82. Sequence alignment, phylogenetic analysis were performed. The expression level ofuponinfection ofwasanalyzed by qRT-PCRThe plant overexpression vector pBinGFP2:was constructed. Then the biological function ofagainstwas explored through transforming soybean hairy roots in agrobacterium-mediated method. The transgenic overexpressing hairy roots and empty-vector hairy roots were obtained by GFP fluorescence screening. Then the lesion length, accumulation ofandthe relative expression level of resistance related genes were measured.【Result】Based on the sequence of(), the genewhich with the highest homology was selected by BLAST, and it was named. The coding sequence ofwas isolated from Williams82. The CDS ofis 2 511 bp in length. GmCTR1 is a serine/threonine protein kinase encoding 836 amino acids. The molecular weight is 92.35 kD, and the isoelectric point is 6.51. Multiple sequence alignment of GmCTR1 and other CTR1s showed that GmCTR1 contains the typical domain of CTR1 protein. Phylogenetic analysis indicated that the CTR1s from,were highly similar to GmCTR1 which located in the same branch. qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwas up-regulated upon infection by. There was the highest expression level at 48 h post infection, and then the expression level decreased slightly. The CDS ofwas constructed into the overexpression vector pBinGFP2. The recombinant plasmid was confirmed by bacteria PCR and enzyme digested. After inoculation of, the resistance was significantly decreased in overexpressed hairy roots. Compared with the empty-vector hairy roots, there are longer lesion length at 36 hpi. Expression analysis showed that there are more accumulation ofinoverexpressing hairy roots. Besides, the expression level of resistance related genes is significantly reduced in overexpressing hairy roots.【Conclusion】may act as a negative regulator in the interactions between soybean and the.

;; expression and analysis; Phytophthora root rot resistance; soybean hairy root

2017-02-21；接受日期：2017-05-20

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303018）、轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2011ZX08004）、長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（PCSIRT13073）、大豆現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-004-PS10）、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心

張楠楠，E-mail：2014101135@njau.edu.cn。通信作者邢邯，E-mail：hanx@njau.edu.cn