張云盛，王清，滕天明，張文娟

尼可地爾對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

張云盛，王清，滕天明，張文娟

目的：探討鉀通道開放劑尼可地爾對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的影響。

方法：建立Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，44只大鼠隨機分為4 組：正常組、缺血再灌注組（I-R 組）、腺苷（100 μmol/L）缺血再灌注組（A/I-R組）、尼可地爾（200μmol/L）缺血再灌注組（N/I-R組），每組11只。分別記錄并分析各組左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內壓力最大上升/下降速率（±dp/dtmax）、再灌注心律失常（RA）、心肌梗死面積以及左心室心肌組織的乙醛脫氫酶2（ALDH2）、抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）以及促凋亡基因B淋巴細胞瘤-2相關x蛋白（Bax）的表達水平。

結果：（1）N/I-R組再灌注30 min與再灌注45 min 的LVDP均高于I-R組與A/I-R組（P均＜0.05）。（2）I-R組再灌注30 min及45 min 的±dp/dtmax均低于N/I-R組和A/I-R組（P均＜0.05）。N/I-R組再灌注30 min及45 min的±dp/dtmax均高于A/I-R組（P均＜0.05）。（3）與I-R 組比較，N/I-R組和A/I-R組的 RA 評分均降低（P均＜0.01）。N/I-R組與A/I-R組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.771）。（4）N/I-R組和A/I-R組心肌梗死面積均低于I-R組（P均＜0.01），N/I-R組心肌梗死面積最?。≒＜0.05）。（5）與正常組比較， I-R組線粒體ALDH2表達明顯減少，Bcl-2、Bax的表達增加；N/I-R組線粒體ALDH2表達增加，A/I-R組表達減少，N/I-R組和A/I-R組的Bcl-2、Bax的表達均增加。與I-R組比較，N/I-R組以及A/I-R組Bcl-2/Bax的比值均增大（P均＜0.05）；在抗凋亡方面N/I-R組與 A/I-R組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

結論：尼可地爾可以減少MIRI，對心肌起到保護作用，其總體作用效果優(yōu)于腺苷。尼可地爾可上調線粒體ALDH2、Bcl-2表達以及下調Bax的基因蛋白的表達。

心肌再灌注損傷；尼可地爾；線粒體,心臟

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:797.)

尼可地爾是一種硝酸酯樣作用的鉀通道開放劑，既可以開放鉀離子通道，也可以發(fā)揮類硝酸酯樣擴張冠狀動脈的作用，有可能通過線粒體的缺血預處理對心肌起到一定保護作用[1]。乙醛脫氫酶2（ALDH2）是一種位于12號染色體的編碼基因，呈基因多態(tài)性的四聯體線粒體蛋白。目前，尼可地爾是否通過調節(jié)線粒體ALDH2表達發(fā)揮心肌保護作用鮮少研究。本研究旨在探討尼可地爾對離體大鼠缺血再灌注損傷（MIRI）的作用，為其在心肌MIRI線粒體機制方面提供新的思路。

1 材料與方法

實驗動物：健康雄性Wistar大鼠44只，體重260～280 g，由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心提供。隨機分為4 組：正常組、缺血再灌注組（I-R 組）、腺苷（100 μmol/L）[2]缺血再灌注組（A/I-R組）、尼可地爾（200 μmol/L）[3]缺血再灌注組（N/I-R組），每組11只。

儀器：Langendorff離體心臟灌流實驗系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟生物技術有限公司）。試劑：1%伊文氏藍（Evans-blue，北京Solarbio公司）；1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC，北京Solarbio公司）；Krebs-Henseleit（ K-H ）液（國產分析純試劑配制）；尼可地爾（上海梯希愛公司）；腺苷（美國Sigma公司）。ALDH2多克隆抗體（美國ImmunoWay公司）；GAPDH、Bcl-2、Bax抗體（萬類生物公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo scientific公司）；Opti-Protein Marker（加拿大abm技術公司）；TRIzol RNA提取試劑盒 （100 ml/瓶，美國Thermo scientific 公司）；逆轉錄cDNA合成試劑盒（美國Thermo scientific 公司）；SG Excel Fast SYBR Mixture（Plus）（上海生工生物工程股份有限公司）；引物均由北京奧科鼎盛生物技術有限公司合成（表1）。

表1 目的基因引物序列

模型復制：全部大鼠均給予肝素5000 U/kg、水合氯醛40 mg/kg腹腔注射，麻醉完全后開胸迅速取出心臟置于4℃ K-H液中，快速擠出心腔內殘留血液，然后將其迅速套扎于Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，保持灌注壓力為90 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），37℃ K-H液持續(xù)灌流。連接BL-420S系統(tǒng)，待心臟穩(wěn)定片刻后將壓力球囊從左心耳插入左心室內，向球囊內注入80～100 μl水調節(jié)壓力前負荷為5～10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。記錄心電圖、左心室壓力各項參數等指標。正常組穿線但不進行結扎，其他3組結扎前降支。正常組持續(xù)灌流 K-H液150 min；I-R組K-H液穩(wěn)定灌流30 min后，結扎前降支30 min，繼以K-H液再灌注90 min；N/I-R組與A/I-R組分別給予尼可地爾（200 μmol/L）與腺苷（100 μmol/L）再灌注15 min，繼以K-H液再灌流75 min。待灌流結束后，部分心臟行1% Evans-blue和1% TTC雙染色，進行心肌梗死面積測定。

血流動力學參數：根據左心室壓力曲線，分析記錄穩(wěn)定灌流 30 min 時（結扎前基礎狀態(tài)值）、缺血15 min、缺血30 min以及再灌注后 30 min、45 min左心室發(fā)展壓（LVDP）、左心室內壓上升/下降最大速率（±dp/dtmax）。LVDP=左心室壓力曲線最高值－左心室壓力曲線最低值。取十個連續(xù)心動周期的平均值為基準。

再灌注心律失常：觀察各組離體大鼠心臟再灌注期間室性心律失常（VA）出現的時間和持續(xù)時間，統(tǒng)計室性早搏的個數，室性心動過速（VT）、心室顫動（VF）發(fā)生率和時程。以在VT或VF后出現 3個及以上的正常竇性心律作為VT或VF終止的指標。心律失常的評分（RA評分）依據 CURTIS 評分方案[4]：0分：＜50個室性早搏；1分：50～499個室性早搏；2分：＞499個室性早搏或1陣可恢復性VT或VF；3分：大于1陣可自行恢復性VT和（或）VF，兩者時間相加小于60 s；4分：可自行恢復性VT和（或）VF，兩者時間相加 60～119 s；5分：可自行恢復性VT和（或）VF，兩者時間相加大于119 s；6分：不可自行恢復性VF。

心肌1% Evans-blue和1%TTC雙染色：灌流結束后進行再灌注組大鼠的前降支重新結扎，1% Evans -blue、1%TTC分別進行染色，區(qū)分正常區(qū)（深藍色）、缺血未梗死區(qū)（紅色）及梗死區(qū)域（灰白色）。用高清數碼相機抓取圖像后利用 Image Pro plus 7.0圖像分析軟件計算心肌梗死區(qū)及缺血區(qū)域，以心肌梗死區(qū)/缺血區(qū)域（%）表示心肌梗死百分比。

實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRTPCR）方法檢測線粒體ALDH2 、抗凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Bax 信使核糖核酸（mRNA）的表達：液氮中取出標本，每100 mg心肌組織加入1 ml Trizol試劑，在冰浴上充分勻漿。高速離心10 min后取上清液，每1 ml Trizol加入200 μl氯仿，劇烈震蕩15～20 s后高速離心15 min，取無色水相每1 ml Trizol加入0.5 ml異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置20～30 min。高速離心后用乙醇沖洗烘干后溶解沉淀，濃度測定后進行反轉錄。應用SYBR GreenⅠ法，qRT-PCR擴增程序設置為95℃ 30 min， 95℃ 30 s，退火溫度為62℃，72℃ 15 s，72℃ 2 min。讀取擴增曲線上各組的CT值（每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數）。最終結果采用2-△CT表示相對表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）內參基因進行標準對照。

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測線粒體ALDH2蛋白、抗凋亡Bcl-2以及促凋亡Bax蛋白的表達：-80℃冰箱中取出標本，每100 mg心肌組織加入1 ml RIPA高效裂解液以及蛋白酶抑制劑，在冰浴上充分勻漿，提取并測定蛋白濃度，在垂直電泳儀中進行電泳分離蛋白。電泳結束后取出凝膠，轉膜、封閉及孵育一抗4℃脫色搖床過夜。一抗孵育結束后常溫下孵育二抗2 h，最后加入Chemilum -inescent 辣根過氧化物酶底物（1:1混勻）在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行曝光與攝像。

統(tǒng)計學分析：應用 SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。數據分析繪圖采用GraphPad Prism 5.0與Image J。正態(tài)分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，LVDP、±dp/dtmax采用重復測量方差分析，其余組間比較采用單因素方差分析 LSD法檢驗。非正態(tài)分布計量資料用中位數和四分位數間距表示，組間比較采用Kruskal-Wallis-H秩和檢驗兩兩比較，不校正α水準[5]。計數資料比較采用卡方檢驗或者Fisher確切概率法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌再灌注后LVDP及±dp/dtmax的比較（表2）

對LVDP的影響：隨著時間的推移，正常組的LVDP呈逐步下降趨勢（P=0.000）。其余各組缺血及再灌注后LVDP，均低于同時間段正常組壓力（P均＜0.05）。N/I-R組再灌注30 min與再灌注45 min的LVDP均高于同時間段I-R組與A/I-R組（P均＜0.05）。對±dp/dtmax的影響：I-R組再灌注30 min及45 min 的±dp/dtmax均低于A/I-R組和N/I-R組（P均＜0.05）。N/I-R組再灌注30 min及45 min的±dp/dtmax均高于A/I-R組，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。

2.2 各組大鼠再灌注室性心律失常發(fā)生率、時程及再灌注RA評分的比較（表3）

正常組僅有室性早搏，無VT、VF發(fā)生，N/I-R組和A/I-R組出現室性早搏個數較正常組均增加（P均=0.000），但均少于I-R組（P=0.03，P=0.02）。N/I-R組和A/I-R組與I-R組相比VT、VF 發(fā)生率降低（VT：P=0.013， P=0.005；VF：P=0.009，P=0.034）、時程縮短（VT：P=0.000，P=0.000；VF：P=0.011，P=0.005）。與 I-R 組比較，N/I-R組和A/I-R組的 RA 評分降低（P=0.000，P=0.000）。N/I-R組與A/I-R組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.771）。

表2 各組大鼠心肌再灌注后LVDP及±dp/dtmax的比較（±s）

表3 各組大鼠再灌注室性心律失常發(fā)生率、時程及再灌注RA評分的比較

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較（圖1）

N/I-R組梗死面積（34.95±1.25）%、A/I-R組梗死面積（47.97±1.22）%，均低于I-R組（55.51±1.43）%，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01），N/I-R組梗死面積最?。≒＜0.05）。

2.4 各組心肌組織線粒體ALDH2以及Bcl-2、Bax表達結果（表4、圖2）

與正常組比較， I-R組線粒體ALDH2表達明顯減少，Bcl-2、Bax的表達增加； N/I-R組線粒體ALDH2表達增加，A/I-R組表達減少，N/I-R組和A/I-R組的Bcl-2、Bax的表達均增加。與I-R組比較，N/I-R組以及 A/I-R組Bcl-2/Bax的比值均增大（P均＜0.05）。在抗凋亡方面N/I-R組與 A/I-R組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠心肌1%伊文氏藍和1%三苯基氯化四氮唑雙染色切片

表4 各組大鼠心肌組織線粒體ALDH2以及Bcl-2、Bax表達結果（±s）

圖2 各組大鼠心肌蛋白免疫印跡圖

3 討論

心血管疾病是全球首要致死原因，而急性心肌梗死又是冠心病死亡的重要原因[6,7]，及時的介入手術或溶栓治療能夠挽救部分急性心肌梗死時的缺血心肌，降低心功能損傷程度。但在血運重建血流恢復的同時，伴隨著MIRI的發(fā)生。尼可地爾的代謝產物可以生成一氧化氮（NO），活化鳥苷酸環(huán)化酶，使心肌細胞內第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）生成增加[8]，從而使血管舒張，降低心臟前負荷，降低心肌耗氧量。尼可地爾（200 μmo/L）[2]是細胞膜以及線粒體三磷酸腺苷（ATP）敏感性鉀通道（KATP）開放劑，細胞膜KATP通道開放引起K+外流、加速復極，使動作電位時程（APD）縮短， Ca2+內流減少，從而減少細胞內鈣超載[9]，清除過多的氧自由基，擴張末梢血管降低后負荷，增加微循環(huán)冠狀動脈的灌注從而產生心臟保護作用。線粒體KATP通道開放參與了缺血預適應以及抗心肌細胞凋亡的作用，Sato等[10]發(fā)現低濃度（100 μmo/L）尼可地爾僅能開放線粒體KATP通道的情況下能夠明顯降低心肌細胞的死亡率，減少心肌細胞的凋亡。研究表明[11]，線粒體KATP通道開放劑對缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用。另有研究也證實[12]，線粒體KATP通道的開放參與了缺血再灌注損傷即刻以及早期缺血后處理的心肌保護機制，而晚期缺血后處理依賴不同的機制。

ALDH2在心肌細胞線粒體中活性高于其他類型醛脫氫酶，其主要機制是通過抑制4-羥壬烯（4-HNE）以及活性氧自由基系統(tǒng)減少心肌細胞的損傷[13]。2002年，Chen等[14]首次全面闡述了ALDH2在機體內硝酸甘油生物轉化過程中起著重要的作用。線粒體ALDH2表達的減少也是目前發(fā)現硝酸脂類耐藥的重要原因之一[15]。激活線粒體ALDH2在MIRI方面起到了保護作用，ALDH2的表達增加，心肌再灌注損傷會減少。同時，ALDH2在抗凋亡以及抗炎癥反應方面也具有重要的作用[16]。

本實驗采用后處理的方式，同時與細胞膜KATP通道開放劑腺苷（100 μmo/L）在同一實驗條件下進行比較。N/I-R組再灌注時與I-R組相比LVDP、±dp/dtmax明顯升高（P均＜0.05），心肌梗死面積減少（P均＜0.05），RA評分降低（P均＜0.05）,N/I-R組其總體作用效果優(yōu)于A/I-R組。研究表明，尼可地爾不僅是NO供體和KATP通道開放劑[17]，還是很好的抗氧化劑，它通過增加超氧化物歧化酶2的活性和減少黃嘌呤氧化酶活性參與體內抗氧化過程[18,19]。通過這些多種途徑與機制，激活NO-cGMP途徑，降低氧化應激，保持線粒體功能，減少心肌缺血再灌注的損傷的作用。

在正常心肌與血管內皮組織中，線粒體ALDH2處于高表達狀態(tài)[20,21]，Bcl-2不表達或低表達[22]。在心肌細胞受到缺血再灌注損傷時，Bcl-2表達上調，其基因產物的表達可抑制或逆轉細胞凋亡的發(fā)生。Bax是Bcl-2 的同源基因蛋白，可通過與 Bcl-2 形成異源二聚體，從而抑制 Bcl-2 的作用，促進凋亡。因此，BCL-2 / Bax的表達比值決定細胞的生存與凋亡[23,24]。本實驗結果顯示，N/I-R組線粒體ALDH2表達增加，初步探討了尼可地爾可能通過調節(jié)線粒體ALDH2的表達起到對MIRI的保護作用相關聯。有關機制有待于進一步驗證，線粒體ALDH2有望成為心臟保護新的治療靶點[25]。本實驗室將通過相關抑制劑與激活劑以及KATP通道特異性抑制劑對尼可地爾以及線粒體ALDH2進一步研究與探討。另外，在心肌抗凋亡方面，尼可地爾與腺苷一樣，藥物后處理均可以明顯減少心肌細胞的凋亡，說明尼可地爾可能通過抑制細胞凋亡對缺血再灌注的心肌起到保護作用。有研究表明，線粒體ALDH2可能通過下調腺苷酸活化蛋白激酶增加FOXO3a轉錄因子的磷酸化，減少高糖誘導的心肌細胞的凋亡[26]。另外，線粒體ALDH2可以減輕乙醛的衍生物4-HNE以及丙二醛毒性從而到抗心肌細胞凋亡的作用[27]。

關于尼可地爾抗凋亡我們認為有以下兩種可能機制：（1）尼可地爾可能通過激活NO-cGMP途徑、激活KATP通道等途徑減少心肌細胞的凋亡。（2）尼可地爾可能通過上調線粒體ALDH2共同參與抑制心肌細胞抗凋亡途徑，其相互之間聯系密切。

總之，尼可地爾可減少缺血再灌注時心律失常的發(fā)生、改善心臟泵功能、減少心肌梗死的面積，最終有效減少MIRI。而關于尼可地爾發(fā)揮再灌注保護作用的信號通路、調節(jié)機制等一系列問題有待進一步研究。

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Effect of Nicorandil on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Isolated Rat’s Heart

ZHANG Yun-sheng, WANG Qing, TENG Tian-ming, ZHANG Wen-juan.
Department of Cardiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin (300052), China

ZHANG Wen-juan, Email:zwjzyy2013@163.com

Objective: To investigate the effect of potassium channel opener nicorandil on myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) in isolated rat’s heart.

Methods: Langendorff system was established for isolated heart reperfusion. A total of 44 rats were randomly divided into 4 groups: Normal control group, Ischemia-reperfusion (I-R) group, Adenosine/I-R (A/I-R) group, the I-R heart was treated by adenosine 100 μmo/L and Nicorandil/I-R (N/I-R) group, the I-R heart was treated by nicorandil 200 μmo/L. n=11 in each group. Left ventricular developed pressure (LVDP), the maximal rise/fall rate of left ventricular pressure (±dp/dtmax), reperfusion arrhythmia (RA) and myocardial infarction (MI) size were recorded; the expressions of left ventricular tissue acetaldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2), Bcl-2 and Bax were examined and compared among different groups.

Results:①Compared with I-R and A/I-R groups, N/I-R group had increased LVDP at 30 min and 45 min reperfusion, all P＜0.05.②Compared with N/I-R and A/I-R groups, I-R group showed reduced ±dp/dtmax at 30 min and 45 min reperfusion, all P＜0.05; while ±dp/dtmax in N/I-R group was higher than A/I-R group at 30 min and 45 min reperfusion, all P＜0.05.③Compared with I-R group, both N/I-R and A/I-R groups presented reduced RA score, all P＜0.01, RA score wassimilar between N/I-R group and A/I-R group, P=0.771. ④compared with I-R group, both N/I-R and A/I-R groups had the smaller MI size, P＜0.01 and N/I-R group showed the smaller MI size, P＜0.05. ⑤Compared with Normal control group, I-R group had decreased mitochondrial ALDH2 expression and increased Bcl-2, Bax expression; ALDH2 level was elevated in N/ I-R group had reduced in A/I-R group; Bcl-2 and Bax levels were increased in both N/I-R and A/I-R groups. Compared with I-R group, both N/I-R and A/I-R groups had increased ratio of Bcl-2/Bax, P＜0.05; the anti-apoptosis effect was similar between N/I-R group and A/I-R group, P＞0.05.

Conclusion: Nicorandil may reduce MIRI and protect myocardium in isolated rat’s heart, the overall effect is better than adenosine. Nicorandil can up-regulate the expressions of mitochondrial ALDH2, Bcl-2 and down-regulate the expression of Bax.

Myocardial Reperfusion Injury; Nicorandil; Mitochondria, Heart

book=797,ebook=73

2016-11-25）

（編輯: 王寶茹）

天津市高等科技發(fā)展基金計劃項目（20110151）；天津市科技計劃項目（15YFYZSY00020）

300052 天津市，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 心血管內科

張云盛 碩士研究生 主要從事心血管疾病臨床和科研工作 Email: zys3722976@163.com 通訊作者：張文娟 Email:zwjzyy2013@163.com

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A

1000-3614（2017）08-0797-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.016