周曉紅，彭麗娜，楊雪，連蕾

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

熊果酸對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究

周曉紅，彭麗娜，楊雪，連蕾

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的：研究熊果酸(Ursolic Acid, UA)對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖和凋亡的影響及其機制。方法：體外培養(yǎng)并取對數生長期的人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞分為空白對照組、UA(12.5、25、50 μmol/L)組和順鉑(6 μmol/L)組，每組設10個復孔。藥物干預24h后，采用MTT比色法測定增值抑制率，通過流式細胞術檢測細胞周期、觀察細胞凋亡狀況并計算凋亡率，逆轉錄-PCR(RT-PCR)法檢測bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達并計算Bax/bcl-2表達比值，Western blotting法檢測caspase-3蛋白表達。結果：UA(25、50 μg/mL)組和順鉑組Hep-2細胞增殖抑制率較空白對照組顯著升高，G0/G1期顯著增長、G2/M期顯著縮短，細胞凋亡率顯著升高，細胞中bcl-2 mRNA表達顯著下調且Bax mRNA顯著上調、Bax/bcl-2表達比值顯著升高，caspase-3蛋白表達顯著上調，上述差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結論：UA具有抑制人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖并促進其凋亡的作用，其機制可能與UA能夠改變細胞周期以及調節(jié)凋亡相關基因和蛋白表達有關。

熊果酸；人喉鱗狀細胞癌；Hep-2細胞；增殖；凋亡

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)男性病人比例約為4.5/10萬、女性約為0.6/10萬，其中95%以上的患者為鱗狀細胞癌。隨著環(huán)境污染的日益嚴重，喉癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。目前，臨床上對于喉癌的治療主要采取手術結合放化療的治療方案，能取得一定的療效，但仍有部分患者因局部復發(fā)或轉移而難以救治。近年來中藥抗癌引起了廣泛關注[2]，熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一種具有多種生物學活性的五環(huán)三萜類化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，UA對肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等均可能具有一定的治療作用[3-6]，但UA是否對人喉鱗狀細胞癌具有一定的療效尚未見文獻報道。本實驗通過體外培養(yǎng)人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞并給予UA進行干預，以順鉑為陽性對照藥物，研究UA對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所惠贈；熊果酸購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司(批號：141007，純度≥98%)；注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司； Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自德國Bendermed公司；MTT、DMSO購自美國Sigma公司；bcl-2、Bax上下游引物購自上海博亞生物公司；caspase-3單克隆抗體購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(江蘇蘇凈集團)；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(美國forma scientific公司)；iMark型酶標儀、PCR儀(美國 Bio-Rad公司)； DYY-11 型多用電泳儀、DYCZ-40B 轉印泳槽(北京六一儀器廠)；流式細胞儀(美國BD公司)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；VCX750型超聲波細胞破碎儀(美國SONICS公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組

將人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞株復蘇后植入RPMI1640培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)，取對數生長期細胞，經0.25%胰酶消化后調整細胞濃度至5×104/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后隨機分為空白對照組、UA(12.5、25、50 μmol/L)組和順鉑(6 μmol/L)組，每組設10個復孔；經藥物干預24 h后進行各指標檢測。

1.3.2 細胞增值抑制率的測定

藥物干預24 h后調整細胞濃度至5×104/mL，接種于96孔板(n=10)，每孔滴加MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清，每孔加入DMSO 200 μL并振蕩10 min，然后通過酶標儀測定波長570 nm處吸光度(OD)值，細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.3.3 細胞周期及細胞凋亡狀況的檢測

經藥物干預24 h后離心(10 000 rpm，5 min)取細胞，經PBS溶液洗滌后加5 mL 70%乙醇，低溫(4℃)放置48 h，離心(10 000 rpm，5 min)取細胞，經PBS溶液洗滌后采用1 mL PBS溶液打散細胞團后加5 μL水解酶Rnase(10 mg/mL)，37℃放置1 h后加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min后通過流式細胞儀進行檢測，采用CELL Quest軟件分析各組細胞的細胞周期時相及凋亡狀況。

1.3.4 細胞中bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達的檢測及Bax/bcl-2比值的計算

通過基因文庫查詢并設計合成大鼠bcl-2、bax、β-actin基因上、下游引物，并計算擴增片段長度，見表1；經藥物干預24 h后，經0.25%胰酶消化并離心(10 000 rpm，5 min)收集各組細胞，加入TRizol提取總RNA并測定總RNA濃度，反轉錄為cDNA后進行PCR反應，擴增完畢后提取PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，最后通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內參，半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達，計算Bax/bcl-2表達比值。

表1 bcl-2、bax、β-actin基因上、下游引物及擴增片段長度

1.3.5 細胞中caspase-3蛋白表達的檢測

參照1.3.4方法離心取細胞并用PBS溶液洗滌，超聲碎裂細胞后低溫(4℃)離心(12 000 rpm，20 min)取沉淀，采用BCA法蛋白定量后行蛋白變性，上樣、電泳(待溴酚藍接近膠底部時停止)、轉膜、麗春紅溶液染色、室溫下經5%脫脂奶粉封閉2 h、一抗(caspase-3，β-actin)4℃孵育過夜、洗膜、二抗室溫搖床上孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

1.3.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖抑制率

通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，UA各組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖抑制率較空白對照組均顯著升高(P<0.01)，其中UA 50 μmol/L組細胞增殖抑制率較順鉑組顯著升高(P<0.05)，結果見表2。

表2 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖抑制率±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

2.2 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞周期的變化

UA(25、50 μmol/L)組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞G0/G1期較空白對照組顯著延長、G2/M期顯著縮短(P<0.05，P<0.01)；而UA(25、50 μmol/L)組G0/G1期、G2/M期與順鉑組比較均無顯著性差異(P>0.05)；說明UA能夠將人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制Hep-2細胞增殖，結果見表3。

表3 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞周期的變化±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.3 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡狀況

通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，UA各組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡數量較空白對照組呈不同程度增多，見圖1；計算細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，UA各組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡率較空白對照組均顯著升高(P<0.01)，其中UA 50 μmol/L組Hep-2細胞凋亡率較順鉑組顯著升高(P<0.05)，結果見表4。

圖1 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡狀況A-空白對照組；B-UA 12.5 μmol/L組；C-UA 25μmol/L組；D-UA 50 μmol/L組；E-順鉑 6 μmol/L組

組別孔數(n)凋亡率(%)空白對照組102.6±1.1UA12.5μmol/L組1014.8±3.6**UA25μmol/L組1030.7±5.2**UA50μmol/L組1051.5±7.3**△順鉑6μmol/L組1026.9±4.2**

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

2.4 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達及Bax/bcl-2比值

UA(25、50 μmol/L)組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞bcl-2 mRNA表達較空白對照組顯著下調(P<0.01)，Bax mRNA表達顯著上調(P<0.05，P<0.01)、Bax/bcl-2比值顯著升高(P<0.01)；UA 50 μmol/L組Hep-2細胞bcl-2 mRNA表達較順鉑組顯著下調且Bax/bcl-2比值顯著升高(P<0.05)，結果見表5。

表5 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達及Bax/bcl-2表達比值

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

2.5 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞caspase-3蛋白表達

UA各組和順鉑組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞caspase-3蛋白表達較空白對照組顯著上調(P<0.01)；UA 50 μmol/L組Hep-2細胞caspase-3蛋白表達量較順鉑組顯著升高(P<0.05)，結果見圖2和表6。

圖2 各組人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞caspase-3蛋白表達A-空白對照組；B-UA 12.5 μmol/L組；C-UA 25 μmol/L組；D-UA 50 μmol/L組；E-順鉑 6 μmol/L組

組別孔數(n)Caspase-3/β-actin空白對照組100.09±0.04UA12.5μmol/L組100.23±0.10**UA25μmol/L組100.34±0.12**UA50μmol/L組100.47±0.15**△順鉑6μmol/L組100.18±0.05

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05

3 討論

喉癌約占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，是頭頸部較為常見的惡性腫瘤，由于早期診斷率低，導致約40%的患者確診時已是Ⅲ期或Ⅳ期[1]。于華等[1]研究發(fā)現(xiàn)，喉癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，其原因可能與環(huán)境污染、飲食不健康、吸煙、飲酒等因素有關。目前臨床上對于喉癌的治療，主要采取手術切除、放療為主并輔以化療的治療方案，其中喉癌化療主要是以順鉑為基礎的聯(lián)合用藥；而對于Ⅲ期或Ⅳ期的晚期喉癌患者主要采取綜合治療，能夠有效抑制喉癌的進展并延長患者生命，但仍有部分患者因局部復發(fā)或轉移而難以救治。

近年來隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥抗癌已經引起廣大醫(yī)藥工作者和癌癥患者的關注。熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一種廣泛存在于熊果、女貞子、夏枯草等植物中五環(huán)三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎、降血脂等多種生物學活性[7-9]，而隨著研究的深入，UA抗癌作用也逐漸得到實驗證實。付倫等[3]通過體外培養(yǎng)人肺癌細胞株A549并給予UA進行干預研究發(fā)現(xiàn)，UA能夠改變A549細胞周期而抑制其增殖；崔兵兵等[4]通過UA干預肝癌細胞株SMMC-7721發(fā)現(xiàn)，UA能夠抑制SMMC-7721細胞增殖并促進其凋亡；此外，實驗研究發(fā)現(xiàn)UA對人卵巢癌SKOV3細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、結腸癌HT-9細胞的增殖均具有抑制作用并對它們的凋亡具有促進作用[5-6,10]。本研究以人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞為受試細胞、以順鉑為陽性對照藥進行研究發(fā)現(xiàn)：經UA干預能夠顯著提高Hep-2細胞增殖抑制率，并且UA 50 μmol/L組Hep-2細胞增殖抑制率顯著高于順鉑6 μmol/L組；流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，經UA干預能夠將人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞周期阻滯于G0/G1期并提高Hep-2細胞凋亡率，且UA 50 μmol/L組Hep-2細胞凋亡率顯著高于順鉑6 μmol/L組，提示UA具有抑制人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖并促進其凋亡的藥理作用。

細胞凋亡是一種繼發(fā)性程序化死亡過程，有多種基因參與調控。Caspase家族的激活在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關鍵作用，其中caspase-3是凋亡過程中的主要效應因子，它的活化能夠能夠裂解DNA修復相關分子和凋亡抑制蛋白、破壞細胞外基質蛋白和骨架蛋白等，因此caspase-3的活化標志著凋亡進入不可逆階段[11]。Bcl-2家族在細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細胞毒性作用，調節(jié)細胞內鈣濃度，從而起到抑制細胞凋亡的作用[12]；Bax屬于Bcl-2基因家族成員，具有誘導線粒體滲透性改變而釋放細胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9，而表現(xiàn)出促細胞凋亡作用[13-14]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進細胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)bcl-2基因家族對細胞凋亡的調控作用[15]。本實驗研究結果顯示：經UA干預能夠顯著上調人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞caspase-3蛋白表達，下調bcl-2基因表達并上調Bax基因表達、提高Bax/bcl-2表達比值，這可能是UA促進人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡的重要分子機制之一。

綜上所述，熊果酸具有抑制人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖并促進其凋亡作用，作用機制可能與熊果酸能夠改變Hep-2細胞周期以及調節(jié)凋亡相關基因和蛋白表達有關。

[1] 于華,辛玉芬,段曉東,等.喉癌的流行病學病因學動態(tài)分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2007,7(3):393-395.

[2] Zhao JL, Rao DS, Boldin MP, et al. NF-kB dysregulation inmicro RNA-146a- deficient mice drives the development of myeloidmalignancies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(22):9184-9189.

[3] 付倫,朱敏,李招云,等.熊果酸對肺癌細胞株A549及SPCA1細胞周期的抑制作用[J].醫(yī)學研究雜志,2015,44(5):68-73.

[4] 崔兵兵,程麗芳,侯立靜,等.熊果酸抑制人肝癌SMMC-7721細胞生長及凋亡的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(18):181-184.

[5] 張慧鋒,郭淑英,申蕾,等.熊果酸誘導SKOV3細胞凋亡與線粒體凋亡通路[J].中藥藥理與臨床,2015,31(2):140-142.

[6] 馬于平,孫圣榮.熊果酸對乳腺癌細胞凋亡影響及其機制[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014,16(8):59-62.

[7] 盧靜,張博超,姜偉,等.熊果酸抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(4):126-127.

[8] 林科,張?zhí)?張鶴云.山楂中熊果酸的提取及其對小鼠的降血脂作用[J].天然產物研究與開發(fā),2007,19:1052-1054.

[9] Jemal A, Siegel R, Xu J, et al. Cancer Statistics [J]. Ca Cancer Journal for Clinicians,2010,60(5):277-300.

[10] 耿偉,沈志祥,譚潔.熊果酸誘導結腸癌HT-29細胞株凋亡的實驗研究[J].腫瘤,2015,25(6):538-541.

[11] Mazumder S, Plesca D, Almasan A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J].Methods Mol Biol,2008,414:13-21.

[12] 吳勃巖,車艷新,孫陽,等.熟地黃多糖對H22荷瘤小鼠細胞色素C和Caspase-3蛋白的影響[J].中醫(yī)藥學報,2015,43(6):34-36.

[13] Farhadi F, Jahanpour S, Hazem K, et al. Garlic (Allium sativum) fresh juice induces apoptosis in human oral squamous cell carcinoma: the involvement of caspase-3, bax and bcl-2[J]. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects, 2015,9(4):267-273.

[14] 張彥清,劉保江,田首元.丙泊酚對大鼠離體缺血/再灌注心肌細胞凋亡和Bcl-2/Bax蛋白表達的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2011,9(1):55-57.

[15] 秦蕾,馬秀麗,薛曉鷗.苦參堿對SiHa細胞增殖及其凋亡相關蛋白表達的影響[J].中醫(yī)藥學報,2016,44(1):25-27.

Effects and Mechanism of Ursolic Acid on the Proliferation and Apoptosis of Laryngeal Squamous Hep-2 Cells

ZHOU Xiao-hong, PENG Li-na, YANG Xue, LIAN Lei

(HandanCentralHospital,Handan056001,China)

Objective: To investigate the effects and mechanism of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of laryngeal squamous Hep-2 cells. Methods: The laryngeal squamous Hep-2 cells in logarithmic growth phase were divided into five groups: the blank control group, UA groups (12.5, 25, 50 μmol/L), and Cisplatin group (6 μmol/L). Twenty-four hours after the intervention, the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, the expression of Bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR to calculate the ratio of Bax/bcl-2, and the expression of caspase-3 protein was detected by western blotting method. Results: Compared to the blank control group, the cellular growth inhibition rate of UA groups (25, 50 μmol/L) and Cisplatin group (6 μmol/L) were significantly increased, with increased G0/G1 and decreased G2/M, the apoptosis rate was significantly increased; the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased, while the expression of Bax mRNA was significantly increased, and the ratio of Bax/bcl-2 were significantly increased; the expression of caspase-3 protein were significantly elevated; all of the differences above were significant(P<0.05,P<0.01). Conclusion: Ursolic Acid has inhibitive effects on the proliferation and accelerating effects on the apoptosis of laryngeal squamous Hep-2 cells; which is perhaps related to its effects of altering cell cycle, altering the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Ursolic acid; Laryngeal squamous; Hep-2 cell; Proliferation; Apoptosis

2016-07-27

2016-09-05

周曉紅(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事鼻喉疾病研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0025-04