趙旭，張寧，劉國(guó)良，周艷麗，代麗娟

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥諏?duì)TNBS誘導(dǎo)的IBS大鼠VIP表達(dá)的作用

趙旭，張寧，劉國(guó)良，周艷麗，代麗娟*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討血管活性腸肽在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的腸易激綜合征大鼠中的表達(dá)量及中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥盏母深A(yù)作用。方法：TNBS誘導(dǎo)大鼠腸易激綜合征模型，第 2、7、14和28天對(duì)大鼠體質(zhì)量、髓過(guò)氧化物酶活力、疼痛閾值、VIP含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：TNBS誘導(dǎo)的腸易激綜合征大鼠體質(zhì)量降低，髓過(guò)氧化物酶活力增加，疼痛閾值降低，模型大鼠中性粒細(xì)胞內(nèi)炎癥標(biāo)記物過(guò)氧化物酶的表達(dá)比正常大鼠明顯升高，證實(shí)TNBS處理后誘導(dǎo)了大鼠的炎癥，TNBS處理大鼠后血漿VIP濃度比對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥仗幚砗箫@著下調(diào)。結(jié)論：VIP表達(dá)的改變?cè)谀c易激綜合癥中可能起著重要作用，穿山龍?zhí)崛∥镏兴幨硎氃碥諏?duì)TNBS誘導(dǎo)的IBS大鼠具有治療作用。

穿山龍；腸易激綜合征；血管活性腸肽；三硝基苯磺酸；薯蕷皂苷

腸易激綜合征(IBS)是一種病因不明的慢性胃腸道紊亂性疾病，其特點(diǎn)是腹痛和排便改變[1]。在中國(guó)其患病率為成年人中10%～20%，盡管這種疾病的發(fā)病率相對(duì)較高[2]，但其確切的病理仍然未知，闡明其發(fā)病機(jī)制是現(xiàn)在面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，腸易激綜合征是多因素疾病[3-4]。細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)感染導(dǎo)致的炎癥可能改變胃腸蠕動(dòng)和內(nèi)臟敏感性而在IBS發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[5-7]。感染腸易激綜合征患者中的36%癥狀將持續(xù)8～10年，這些患有腸易激綜合征患者表現(xiàn)出各種癥狀；排便被視為一個(gè)主要的胃腸道癥狀，但最痛苦的相關(guān)癥狀是腹痛[8]。當(dāng)腸易激綜合征發(fā)生時(shí)，腹脹、腹瀉、腹痛等癥狀通常在首次發(fā)病后數(shù)周內(nèi)消失，但炎癥消失后內(nèi)臟高敏感性仍可持續(xù)存在[9]。此外，與普通胃腸病相比，IBS患者除了胃腸道癥狀外還有消化系統(tǒng)癥狀，IBS患者內(nèi)臟過(guò)敏增加，皮膚對(duì)熱刺激敏感[10]，很明顯，患有腸易激綜合征的患者有著更為復(fù)雜的癥狀。

穿山龍(RhizomaDioscoreaeNipponicae)為薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的干燥根莖，是黑龍江省道地的中藥材，其味甘、苦，性溫，歸肝、腎、肺經(jīng)[11]。其功效為舒筋通絡(luò)、祛風(fēng)除濕、活血止痛；臨床主要用于風(fēng)濕痹病、關(guān)節(jié)腫脹、疼痛麻木、咳嗽氣喘等[12]。我們前期研究結(jié)果表明其具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，對(duì)腸易激綜合征具有良好的治療作用[13-14]，但其起作用有效成分研究尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)之上，應(yīng)用穿山龍主要成分薯蕷皂苷作用于腹瀉型腸易激綜合征大鼠探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠(300～350 g)60只，隨機(jī)分為3組，每組20只，保持在12 h光/暗周期,標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和水。所有試劑都是購(gòu)自Sigma公司。

1.2 造模

三硝基苯磺酸誘導(dǎo)腹瀉型腸易激綜合征模型，3%異氟烷氧氣麻醉大鼠，50%乙醇溶解TNBS，取1 mL(15 mg/mL)，使用無(wú)菌聚乙烯管肛門(mén)插入直腸7 cm處灌腸給藥。在TNBS處理2、7、14、21天進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 造模前后體質(zhì)量變化

大鼠開(kāi)始造模后2、7、14、21天稱(chēng)體質(zhì)量，計(jì)算每組體質(zhì)量變化。

1.4 疼痛閾值檢測(cè)

第7、14、21 、28天3%異氟烷麻醉大鼠后進(jìn)行直腸擴(kuò)張，檢測(cè)疼痛閾值。

1.5 髓過(guò)氧化物酶活力檢測(cè)

第2、7、14、28天沿著腸系膜邊境切開(kāi)取大鼠結(jié)腸組織100～200 mg，液氮中冷凍保存，供測(cè)定結(jié)腸組織MPO之用。檢測(cè)時(shí)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 VIP含量測(cè)定

血漿VIP檢測(cè)，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS23.0軟件，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)；當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量相對(duì)增長(zhǎng)率變化

TNBS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型有幾個(gè)指標(biāo)，其中之一是處理后體質(zhì)量變化。與正常組相比，TNBS組第一次灌腸處理大鼠2～7天后體質(zhì)量降低(13.7±3.2)g ，14天后體質(zhì)量增加，21天后正常組和TNBS 組體質(zhì)量無(wú)明顯差異,見(jiàn)表1。

表1 TNBS造模后大鼠體質(zhì)量變化比較(g)

注：與正常組相比，*P<0.05

2.2 疼痛閾值與MPO活力檢測(cè)

與正常組相比，在第7天14天和21天疼痛閾值降低(P<0.05)，28天疼痛閾值無(wú)明顯差異(P>0.05)。MPO是一個(gè)炎癥的標(biāo)志物，是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，與正常組相比，TNBS處理大鼠2、7、14和28 d后MPO的水平活性顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 疼痛閾值(mmHg)與MPO活力(μg)測(cè)定

注：與正常組相比，*P<0.05

2.3 VIP含量測(cè)定

與正常組相比，TNBS處理2 h后VIP含量顯著增加，14天后下降(P<0.05)。與TNBS組相比，薯蕷皂苷組VIP含量顯著下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 VIP含量測(cè)定(ng/mL)

注：與正常組相比，*P<0.05;與TNBS組相比，#P<0.05

3 討論

腸易激綜合征是以持續(xù)或間歇發(fā)作的腹痛、腹瀉、腹脹等消化道癥狀為主的腸功能紊亂性疾病。分為腹瀉型、便秘型、混合型、不確定型4種，我國(guó)腹瀉型腸易激綜合征最常見(jiàn)，約占74.1%[15]，因此建立一個(gè)良好的腹瀉型腸易激綜合征動(dòng)物模型可以促進(jìn)對(duì)該疾病的深入研究，模型的建立是否成功需經(jīng)過(guò)相應(yīng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，目前現(xiàn)有的腸易激綜合征模型評(píng)價(jià)指標(biāo)大體分為內(nèi)臟敏感性、腸道動(dòng)力學(xué)、糞便情況及病理組織學(xué)四類(lèi)。其中，內(nèi)臟敏感性增加和腸道動(dòng)力學(xué)改變是核心的評(píng)價(jià)指標(biāo)，我們的研究發(fā)現(xiàn)三硝基苯磺酸造模后內(nèi)臟敏感性，MPO含量增加證明造模成功。然而TNBS-誘導(dǎo)的IBS模型并非沒(méi)有的局限性，一是大多數(shù)胃腸道標(biāo)志物自發(fā)的缺失。另外，這種模式的再現(xiàn)性高度依賴(lài)TNBS劑量使用[16]。

穿山龍資源豐富，在我國(guó)已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，具有較高的藥用價(jià)值。近幾年，現(xiàn)代藥理學(xué)研究穿山龍的鎮(zhèn)痛、降糖、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[17-18]，其中鎮(zhèn)痛、抗炎藥效作用明顯[19]。我們對(duì)腸易激綜合癥造模成功的大鼠研究發(fā)現(xiàn)VIP表達(dá)上調(diào)，Camilleri M等[20]研究同樣發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，腹瀉型腸易激綜合征活檢VIP mRNA表達(dá)增加，這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明VIP可能在腸易激綜合癥發(fā)病中起重要的作用[21]。穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥仗幚砗骎IP降低，說(shuō)明中藥穿山龍有效成分薯蕷皂苷具有治療腸易激綜合征的療效。

總之，我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示血管活性腸肽含量的改化可能在慢性胃腸道功能紊亂中發(fā)揮著重要作用。這些數(shù)據(jù)為更好的理解VIP表達(dá)、生理和藥理性質(zhì)，為有選擇地調(diào)節(jié)胃腸功能提供了一個(gè)出發(fā)點(diǎn)。通過(guò)本研究能夠初步確定薯蕷皂苷對(duì)TNBS誘導(dǎo)的IBS大鼠的治療作用，但未能從更多層次和角度進(jìn)行深入研究，今后仍需進(jìn)行深入探究。

[1] 李鐵男,王兵,劉影,等.菝葜提取物對(duì)腸易激綜合征大鼠血漿SP、CGRP含量的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2011,39(4):26-28.

[2] 朱慧淵.疏肝健脾法對(duì)腸易激綜合征模型大鼠細(xì)胞能量代謝的作用機(jī)制[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2014,42(2):36-38.

[3] 王偉貴，石志敏，張禎，等.子午流注針?lè)ㄅ浜媳孀C取穴治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):80-82.

[4] 陳建林，陳錦鋒，鄧健敏，等.加味痛瀉要方對(duì)肝郁脾虛型腸易激綜合征患者血清腦腸肽水平的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(4):82-83.

[5] Grover M, Camilleri M, Smith K, et al. On the fiftieth anniversary. Postinfectious irritable bowel syndrome: mechanisms related to pathogens[J]. Neurogastroenterology & Motility,2014,26(2):156.

[6] Ahn J Y, Lee K H, Choi C H, et al. Colonic mucosal immune activity in irritable bowel syndrome: comparison with healthy controls and patients with ulcerative colitis[J].Digestive Diseases and Sciences,2014,59(5):1001-1011.

[7] Kanazawa M, Palsson O S, Thiwan S I, et al. Contributions of pain sensitivity and colonic motility to IBS symptom severity and predominant bowel habits[J].The American journal of gastroenterology,2008,103(10):2550-2561.

[8] Spiegel B M R, Bolus R, Harris L A, et al. Characterizing abdominal pain in IBS: guidance for study inclusion criteria, outcome measurement and clinical practice[J]. Aliment Pharmacol Ther,2010,32(9):1192-1202.

[9] Zhou Q, Price D D, Caudle R M, et al. Visceral and somatic hypersensitivity in a subset of rats following TNBS-induced colitis[J].Pain,2008,134(1-2):9-15.

[10] Mayer E A, Gebhart G F. Basic and clinical aspects of visceral hyperalgesia[J].Gastroenterology,1994,107(1):271-293.

[11] 張寧,于棟華,周琦,等.穿山龍藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2015,26(4):547-550.

[12] 姚麗,劉樹(shù)民.中藥穿山龍新的藥理作用及其有效部位的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(9):1979-1981.

[13] 張賽.腸易激綜合征中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制研究概況[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(3):48-51.

[14] 趙旭,周艷麗,代麗娟.薯蕷皂苷對(duì)IBS-D模型大鼠治療作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2017,45(2):22-24.

[15] 金華鋒.試論腸易激綜合征的分期論治[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2000,28(6):8-9.

[16] Motavallian-Naeini A, Andalib S, Rabbani M, et al. Validation and optimization of experimental colitis induction in rats using 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid[J]. Research in Pharmaceutical Sciences,2012,7(3):159-169.

[17] 粘芙蓉,辛?xí)粤?中藥穿山龍鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(8):1644-1645.

[18] 宋藝君，郭濤，王昌利.穿山龍總皂苷大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(1):3-6.

[19] 杜虹韋.穿龍薯蕷與盾葉薯蕷研究開(kāi)發(fā)概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2010,38(3):131-134.

[20] Camilleri M, Carlson P, Acosta A, et al. RNA sequencing shows transcriptomic changes in rectosigmoid mucosa in patients with irritable bowel syndrome-diarrhea: a pilot case-control study[J]. Ajp Gastrointestinal & Liver Physiology,2014,306(12):1089-1098.

[21] Jabari S, Oliveira E C D, Brehmer A, et al. Chagasic megacolon: enteric neurons and related structures[J]. Histochemistry and Cell Biology,2014,142(3):235-244.

The Effect of Dioscin fromRhizomaDioscoreaeNipponicaseon VIP Expression in IBS Rats Induced by TNBS

ZHAO Xu, ZHANG Ning, LIU Guo-liang, ZHOU Yan -Li, DAI Li-Juan

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To investigate the vasoactive intestinal peptides (VIP) expression in irritable bowel syndrome (IBS) rats induced by trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), and the intervention effects of dioscin fromRhizomaDioscoreaeNipponicase. Methods: IBS models were established by TNBS induction. The weight, myeloperoxidase (MPO) activity, pain threshold, and VIP content were detected on the days of 2nd, 7th, 14th, and 28th. Results:TNBS induced IBS in rats was confirmed with weight loss, increased MPO activity, and decreased pain threshold. VIP plasma concentration was significantly increased in rats following TNBS intervention compared to that of the control group(P<0.05), and it was regulated downwards significantly. Conclusion: VIP expression may play a role in IBS. Therefore, dioscin has therapeutic effect on IBS rats induced by TNBS.

RhizomaDioscoreaeNipponicase; Irritable bowel syndrome; Vasoactive intestinal peptide; Trinitrobenzene sulfonic acid; Dioscin

2017-03-12

2017-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274035)；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(ZHY16-034)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金(201516)

趙旭(1980-)，女，碩士，講師，主要從事胃腸病的研究。

*通訊作者：代麗娟(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎病研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0013-03