劉熙熙+沈曉東++汪卉

【摘要】：建立了測(cè)定水樣中四環(huán)素類抗生素的高效液相色譜分析方法，采取多種前處理方法進(jìn)行優(yōu)化與對(duì)比，以蘇州市陽(yáng)澄湖周圍水體作為研究對(duì)象，調(diào)查總結(jié)其中三類四環(huán)素類抗生素的含量。在色譜條件中采用乙腈、草酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL/min，波長(zhǎng)為300nm，分析時(shí)間10分鐘，線性關(guān)系良好。

【關(guān)鍵詞】：四環(huán)素類抗生素；高效液相色譜；萃取

【引言】：抗生素（antibiotics）是一種天然或者半人工合成的，能在低微濃度下有選擇性地抑制或影響生物。自從1928年發(fā)現(xiàn)青霉素以來，人類開始廣泛使用抗生素，并且在家禽飼養(yǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品加工等方面廣泛運(yùn)用。隨之而來的是在環(huán)境中殘留的抗生素污染越來越嚴(yán)重。

抗生素污染已成為目前國(guó)際研究熱點(diǎn)之一。水環(huán)境下抗生素的研究集中在北美等發(fā)達(dá)國(guó)家，國(guó)內(nèi)也已陸續(xù)展開了相關(guān)工作。已有的研究很少涉及能夠真正反映養(yǎng)殖場(chǎng)藥物使用情況的排水口水體和下游水體中抗生素的變化。通過深入關(guān)注和了解有關(guān)抗生素方面的一些新聞報(bào)道和研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)附近的水體中殘留抗生素較多，其中含量最多，最普遍的便是四環(huán)素類抗生素。 為了促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾病爆發(fā)，普遍都在家畜、家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中添加抗生素，一部分將在生物體內(nèi)吸收或轉(zhuǎn)化，并以代謝物的形式排出體外。

為了研究四環(huán)素類抗生素對(duì)養(yǎng)殖水體的污染情況，將以過去的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過高效液相色譜檢測(cè)方法，多種前處理方式，對(duì)蘇州魚塘周圍水體進(jìn)行采樣分析，調(diào)查總結(jié)蘇州特定水環(huán)境中四環(huán)素類抗生素的來源及含量，以期為達(dá)到控制和去除四環(huán)素類抗生素提供方向和依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100分析型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）；氮吹儀TTL-DCI；快速混勻器SK-1；離心機(jī)TGL-16G；恒溫水浴鍋；超聲波清洗器KQ-100E；C18 6mL（500mg）小柱。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、丙酮（色譜純）；超純水；四環(huán)素、土霉素、金霉素固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；草酸（分析純）。

1.3 高效液相色譜分析條件

選用色譜柱（Eclipse Plus C18（150*2.1mm，3.5μm）），柱溫：30℃，波長(zhǎng)：300nm，流速：1mL/min，流動(dòng)相：乙腈/0.01mol/L草酸，進(jìn)樣量：20μL，流動(dòng)相中草酸PH：2.4，采用梯度洗脫程序（表1），其中A相為乙腈，B相為0.01mol/L草酸。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

稱取三種四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制單標(biāo)儲(chǔ)備液及混標(biāo)儲(chǔ)備液，置于棕色瓶?jī)?nèi)放冰箱避光保存。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將混標(biāo)儲(chǔ)備液與超純水混合，形成濃度為1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ppm的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按色譜條件進(jìn)樣，以濃度（ppm）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3水樣前處理

水樣在前處理之前均采用0.22μm尼龍濾膜進(jìn)行過濾。

1） 離子液體輔助分散液液微萃取

保持混合有機(jī)物：40μL（乙腈：1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽 = 1：1）和水樣體積不變，同時(shí)改變酸化的溶液（乙酸和草酸）時(shí)，觀察離子液體（1-己基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽）的萃取效率。最后用離子液體用無菌注射器抽出，200μL的流動(dòng)相復(fù)溶。

2） 丙酮-無水硫酸銨雙水相萃取

配制一定量的水樣和硫酸銨鹽溶液，置于一定溫度水浴中使鹽溶解；移取6 mL儲(chǔ)備液至10 mL 離心管中，加入0.8mL丙酮；渦旋3min后離心5min至分相；用1 mL注射器從上相取樣。

3） 無水乙醇+ 丙酮-硫酸銨體系萃取

同丙酮-無水硫酸銨體系實(shí)驗(yàn)方案類似，關(guān)鍵在于丙酮與乙醇的比例關(guān)系。確定無水乙醇和丙酮以1∶2 組合溶于水相中效果最佳。

4） 固相萃取

樣品凈化： C18柱在使用前先用甲醇水溶液（2：1）進(jìn)行活化后加入水樣，適當(dāng)控制流速，待樣品液全部流出后用95%甲醇水溶液洗滌柱子，棄去流出液，再加入5mL甲醇洗脫，收集洗脫液。

樣品濃縮： 將洗脫液于氮吹儀吹干后，加入1mL流動(dòng)相定容。

1.4.4樣品測(cè)定

定容后經(jīng)0.22μm的尼龍濾頭過濾，吸取20μL進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，記錄三種抗生素保留時(shí)間及峰面積。

2 、結(jié)果與討論

2.1色譜條件優(yōu)化

選取乙腈、甲醇和0.01mol/l草酸溶液作為流動(dòng)相，流速：0.8ml/min，波長(zhǎng)：267nm，對(duì)三種物質(zhì)分離，結(jié)果顯示OTC和TC沒有完全分離，且峰

值有拖尾現(xiàn)象；隨后，改用乙腈和0.01mol/l草酸溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速：1mL/min，波長(zhǎng)：300nm三者分離度都有所提高，OTC和TC相比OTC出峰效果明顯，兩者出峰時(shí)間較接近，通過優(yōu)化梯度洗脫中流動(dòng)相比例以及比例變換時(shí)間，將檢測(cè)時(shí)間縮短到10分鐘之內(nèi)，使分析時(shí)間大大縮短。

1.土霉素；2.四環(huán)素；3.金霉素

圖1.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離色譜圖

2.2萃取方法選擇

雙水相萃取和分散液液微萃取技術(shù)相比固相萃取成本低，操作簡(jiǎn)單，變通性強(qiáng)，為提高萃取效果，對(duì)萃取劑進(jìn)行多次篩選，最終確定以無水乙醇+ 丙酮-硫酸銨體系萃取，按適當(dāng)比例進(jìn)行萃取進(jìn)樣，結(jié)果表明無水乙醇和丙酮以1∶2 組合溶于水相中效果最佳。

固相萃取不用大量互不相溶的溶劑，富集倍數(shù)、回收率高，選取萃取柱C18，甲醇為洗脫溶劑萃取，控制適當(dāng)流速，效果顯著。

兩種萃取技術(shù)最終結(jié)果顯示固相萃取技術(shù)萃取效率較高。

2.3工作曲線與檢出限

抗生素 回歸方程 相關(guān)系數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)偏差 方法檢出限

OTC y = 18.49x - 0.357 0.997 2.08% 0.15

TC y = 17.20x - 0.737 0.999 1.40% 0.14

CTC y = 9.794x - 2.488 0.997 1.88% 0.08

表2.三種抗生素的線性關(guān)系分析和方法檢出限

按照不同濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表2可以看出三種四環(huán)素類抗生素的工作曲線線性關(guān)系良好，并計(jì)算得出方法檢出限MDL。

結(jié) 論

本研究采用固相萃取和雙水相萃取多種前處理方法對(duì)水樣進(jìn)行富集，結(jié)果表明固相萃取效果較好，但并不表示雙水相萃取技術(shù)不可行，該技術(shù)成本低，耗時(shí)也比固相萃取少，是一個(gè)有研究?jī)r(jià)值的技術(shù)，還需從各個(gè)條件下進(jìn)行優(yōu)化，固相萃取技術(shù)已成熟，經(jīng)C18柱富集后，以乙腈-草酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL/min，波長(zhǎng)為300nm，結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

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