章明洪，儲(chǔ)德韌，劉 剛

(上海化工研究院有限公司，國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心〔上海〕 上海 200062)

尿基肥料中縮二脲含量測(cè)定及國際標(biāo)準(zhǔn)制定研究*

章明洪，儲(chǔ)德韌，劉 剛

(上海化工研究院有限公司，國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心〔上海〕 上海 200062)

研究開發(fā)了利用高效液相色譜法測(cè)定尿基肥料中縮二脲含量的新方法。該方法采用的氨基色譜柱能有效地將縮二脲與其他脲基縮合物及干擾物質(zhì)分離，解決了國家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)混肥料(復(fù)合肥料)中縮二脲含量的測(cè)定》(GB/T 22924—2008)在實(shí)施過程中存在的問題。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和一系列有代表性的肥料樣品的系統(tǒng)性試驗(yàn)分析，驗(yàn)證了該新方法的適用性、準(zhǔn)確度和精密度。通過組織國內(nèi)外13家分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該新方法適用性廣且精密度高，因而被推薦作為新的國際標(biāo)準(zhǔn)。

縮二脲；尿基肥料；國際標(biāo)準(zhǔn)；高效液相色譜法

縮二脲是尿素經(jīng)由高溫(接近或超過尿素的熔點(diǎn)132 ℃)下脫氨產(chǎn)生不穩(wěn)定中間體氰酸，然后進(jìn)一步與尿素反應(yīng)形成的一系列脲基縮合物的一種，此類脲基縮合物通常還包括縮三脲、N,N- 亞甲基二脲等[1- 2]。在尿素熔融法生產(chǎn)復(fù)混肥料工藝中，如果反應(yīng)溫度過高且反應(yīng)時(shí)間過長，常導(dǎo)致最終產(chǎn)品中縮二脲含量較高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>1.5%)[3]。許多研究表明，施于土壤或作物葉面的高濃度縮二脲會(huì)對(duì)作物體內(nèi)氮素的代謝及蛋白質(zhì)的合成造成干擾，從而對(duì)作物生長產(chǎn)生抑制作用[1- 2]，對(duì)作物種子發(fā)芽及幼根生長的危害尤為顯著[4]。近年來，尿素及尿基肥料(包括脲醛緩釋肥料、尿素硝銨溶液、硫包衣尿素、尿基復(fù)合/復(fù)混肥料等)在全球范圍內(nèi)日益成為最主要的氮素肥料，由施用上述尿素及尿基肥料帶來的縮二脲危害作物的問題越來越受到人們的關(guān)注[5]，業(yè)內(nèi)對(duì)肥料中縮二脲含量檢測(cè)技術(shù)的要求也與日俱增[6]。

目前，國際上通用的縮二脲測(cè)定方法主要包括兩大類。一大類是基于縮二脲等物質(zhì)在溶液中與Cu2+形成有色配合物的雙縮脲反應(yīng)，采用分光光度法(直接法)或原子吸收光譜法(間接法)檢測(cè)縮二脲- Cu2+復(fù)合物濃度，再換算成縮二脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)混肥料(復(fù)合肥料)中縮二脲含量的測(cè)定》(GB/T 22924—2008)和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)混肥料中縮二脲含量的測(cè)定 分光光度法》(NY/T 1376—2007)、美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)標(biāo)準(zhǔn)方法960.04和976.01以及歐盟標(biāo)準(zhǔn)EN 15479:2009都采用類似方法作為標(biāo)準(zhǔn)分析方法。此類方法通常需要在試驗(yàn)中配制含有Cu2+的顯色試劑，樣品前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力[2]，且含有酰胺鍵的不少脲基縮合物都有可能與Cu2+形成不同的有色配合物而干擾測(cè)定[7]，有許多國家正在尋求替代方法。另一大類方法是利用液相色譜分離縮二脲后再采用紫外檢測(cè)器直接進(jìn)行測(cè)定，該方法的發(fā)展得益于高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)縮二脲的直接定量[8]。當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)液相色譜法開展的前沿研究較多，但該方法在樣品適用性、雜質(zhì)干擾下的穩(wěn)定性方面存在一些缺陷[7- 8]，目前只有我國的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22924—2008采用此法作為縮二脲測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法。

在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22924—2008的具體實(shí)踐過程中，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)中采用的液相色譜法盡管能夠有效地測(cè)定絕大多數(shù)肥料中的縮二脲含量，但也存在如下問題：①該方法中采用的十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(C18)色譜柱是反相色譜中最常用的通用型色譜柱，適用于分離非極性或弱極性的有機(jī)化合物，由于其并非是為分離含有酰胺鍵的化合物而專門設(shè)計(jì)的，因此在實(shí)際使用中對(duì)分離縮二脲、縮三脲、N,N- 亞甲基二脲等含有酰胺鍵的脲基縮合物效果不佳，直接影響了肥料中縮二脲含量測(cè)定的準(zhǔn)確程度；②按照標(biāo)準(zhǔn)采用C18色譜柱在波長200 nm下檢測(cè)含有硝酸根的肥料樣品時(shí)，由于硝酸根在該波段有強(qiáng)烈的紫外吸收[9]，導(dǎo)致硝酸根與縮二脲的分離效果不佳，出現(xiàn)硝酸根干擾縮二脲測(cè)定的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在測(cè)定尿素硝銨溶液、含硝態(tài)氮的尿基復(fù)混/復(fù)合肥時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)，極大地限制了該標(biāo)準(zhǔn)方法的適用性。

針對(duì)上述存在的問題，利用專門為分離極性化合物(特別是含有酰胺鍵的化合物及糖類)設(shè)計(jì)的氨基色譜柱，研究開發(fā)了縮二脲液相色譜測(cè)定新方法，并以此為基礎(chǔ)向國際標(biāo)準(zhǔn)化組織——肥料和土壤調(diào)理劑標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出了建立縮二脲測(cè)定國際標(biāo)準(zhǔn)的工作提案，項(xiàng)目申請(qǐng)獲得了投票批準(zhǔn)。新的測(cè)定方法可有效地將縮二脲與其他脲基縮合物及干擾物質(zhì)分離，并通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和一系列有代表性的肥料樣品的系統(tǒng)性試驗(yàn)分析，證實(shí)了該方法具有較寬的線性范圍、較高的準(zhǔn)確度和精密度。經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織——肥料和土壤調(diào)理劑標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)的推薦，由上?；ぱ芯吭河邢薰緺款^組織了國內(nèi)外13家分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該方法的適用性廣且精密度高，被推薦作為新的國際標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 方法提要

利用液相色譜法測(cè)定各種固體和液體尿基肥料中的縮二脲含量，肥料中的縮二脲由乙腈-水溶液(流動(dòng)相)提取，采用氨基(氨丙基)色譜柱的反相液相色譜進(jìn)行分離、紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算縮二脲含量。

1.2 主要試劑與溶液

乙腈，HPLC級(jí)，德國Merck公司；超純水，三級(jí)，Millipore制備；縮二脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，美國Sigma-Aldrich公司；參考物質(zhì)分析純縮二脲，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>97%，美國Alfa Aesar公司。

流動(dòng)相：850 mL乙腈+150 mL超純水，使用前用0.22 μm濾膜過濾并超聲脫氣。

縮二脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 mg/mL)：稱取0.500 0 g縮二脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并溶解于流動(dòng)相中，然后移入1 000 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，靜置。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀(含紫外檢測(cè)器)，Waters 1525- 2489- 2707，美國Waters公司；針狀過濾器(包括0.22 μm有機(jī)相濾膜)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器，SK2510HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；試驗(yàn)篩，篩孔直徑0.5 mm，湖南省常德粒度分析儀器廠。液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：液相色譜，Shimadzu 20AD XR+UV，日本島津公司；質(zhì)譜，AB SCIEX Triple TOF?4600，美國AB SCIEX公司。

1.4 試驗(yàn)樣品

方法開發(fā)與研制階段使用的樣品種類做到了盡可能覆蓋各種固體和液體尿基肥料，包括3種不同來源的尿素、5種不同生產(chǎn)工藝及組分的復(fù)混肥料、1種氮磷鉀(NPK)復(fù)合肥料、1種脲醛復(fù)合肥料、1種尿素硝銨溶液(UAN)、1種脲醛緩釋液體肥料(Trisert?)、1種樹脂-硫復(fù)合包衣尿素(PSCU)，具體的肥料試驗(yàn)樣品信息見表1。

表1 肥料試驗(yàn)樣品信息

注：1)聲明養(yǎng)分級(jí)別按N- P2O5- K2O標(biāo)注； 2)樣品編號(hào)以IRT開頭的是作為國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的樣品

1.5 分析步驟

1.5.1 試樣制備

對(duì)于尿素，取縮分后的500 g樣品作為試樣；對(duì)于復(fù)混肥料，取縮分后的100 g樣品研磨至粒徑小于0.50 mm，混勻，置于潔凈、干燥的瓶中；液體肥料直接取分裝后的500 mL樣品作為試樣。

1.5.2 試樣溶液的制備

稱取試樣0.1～0.5 g(精確至0.000 1 g，以含縮二脲1～2 mg為宜)置于25 mL的燒杯中，加入10 mL流動(dòng)相，超聲輔助溶解10 min，待冷卻后移入25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，靜置；用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，得試樣溶液。

1.5.3 縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

在5個(gè)25 mL容量瓶中分別移取0.50，1.00，3.00，5.00和10.00 mL縮二脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，靜置，然后用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，得到縮二脲質(zhì)量濃度分別為10.0,20.0,60.0,100.0和200.0 mg/L的系列縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.5.4 液相色譜及液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析條件

方法開發(fā)及驗(yàn)證中采用的典型液相色譜分析條件見表2，液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析條件見表3。

表2 液相色譜分析條件

注：1)如ThermoFisher公司的APS- 2 Hypersil柱(Part # 30705- 254630)或Phenomenex公司的Spherex NH2柱(Part # 00G- 00051- E0)；在國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)中，能夠達(dá)到相同分析效果的氨基色譜柱都可使用

1.5.5 測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照1.5.4中的儀器操作條件，將液相色譜儀調(diào)節(jié)至最佳測(cè)定狀態(tài)；分別將縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 μL，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次，以測(cè)得的峰面積均值分別對(duì)應(yīng)縮二脲質(zhì)量或濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。

表3 液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析條件

試樣溶液的測(cè)定：用測(cè)定工作標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的操作條件對(duì)試樣溶液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)得的峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算得到試樣溶液中縮二脲的質(zhì)量。

1.6 結(jié)果計(jì)算

縮二脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m1——與試樣溶液峰面積相對(duì)應(yīng)的由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由線性回歸方程計(jì)算出的縮二脲質(zhì)量，mg；

m——試樣質(zhì)量，g。

取平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇試驗(yàn)

圖1 C18色譜柱測(cè)定縮二脲參考物質(zhì)的液相色譜圖

圖2 C18色譜柱測(cè)定含有硝酸根肥料樣品的液相色譜圖

圖3 氨基色譜柱測(cè)定含有硝酸根肥料樣品的液相色譜圖

在國家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)混肥料(復(fù)合肥料)中縮二脲含量的測(cè)定》(GB/T 22924—2008)實(shí)施過程中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中采用C18色譜柱在200 nm波長下檢測(cè)含有硝酸根的肥料樣品時(shí)，由于硝酸根在該波段有強(qiáng)烈的紫外吸收，導(dǎo)致硝酸根與縮二脲的分離效果不佳，出現(xiàn)硝酸根干擾縮二脲測(cè)定的現(xiàn)象，致使標(biāo)準(zhǔn)的適用性受到限制。如圖1和圖2所示，縮二脲的出峰時(shí)間在1.81 min左右，硝酸根在1.50～2.00 min有強(qiáng)吸收造成大的出峰包，縮二脲的出峰被包在其中，導(dǎo)致無法進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)選擇了氨基色譜柱，其分離效果見圖3，縮二脲的出峰時(shí)間在4.00 min左右，而硝酸根的出峰時(shí)間在8.00 min左右，縮二脲與硝酸根的出峰能有效分離，從而消除了硝酸根對(duì)縮二脲測(cè)定的干擾。同時(shí)與國外實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了不同色譜柱測(cè)定肥料中縮二脲含量比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 國際實(shí)驗(yàn)室間不同色譜柱縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定比對(duì)試驗(yàn) %

經(jīng)綜合比較，C18色譜柱無法檢測(cè)含硝酸根肥料中的縮二脲含量，而氨基色譜柱可消除硝酸根對(duì)縮二脲測(cè)定的干擾，其中中國實(shí)驗(yàn)室選擇的APS- 2 Hypersil色譜柱試驗(yàn)效果最理想。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用樣品組分分析

為確認(rèn)液相色譜對(duì)縮二脲、尿素及其他脲基縮合物的分離效果，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析參考物質(zhì)分析純縮二脲及部分樣品，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，其中：a為參考物質(zhì)分析純縮二脲；b為SLV- 054尿素樣品；c為SLV- 114復(fù)混肥料樣品；d顯示了根據(jù)各譜峰的一級(jí)質(zhì)譜(MS)和二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)在正離子模式下擬合的化合物組成及其可能的裂分形式。

由圖4中的譜圖結(jié)果可知：保留時(shí)間(R.T.)為3.03～3.04 min的化合物在一級(jí)質(zhì)譜中顯示了母離子m/z=147，其二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了子離子m/z分別為130，104，87和61，對(duì)應(yīng)化合物為縮三脲；保留時(shí)間(R.T.)為3.16～3.18 min的化合物在一級(jí)質(zhì)譜中顯示了母離子m/z=104，其二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了子離子m/z分別為87和61，對(duì)應(yīng)化合物為縮二脲；保留時(shí)間(R.T.)為3.64～3.65 min的化合物在一級(jí)質(zhì)譜中顯示了母離子m/z=61，其二級(jí)質(zhì)譜中未顯示明顯的子離子，根據(jù)已知結(jié)果推論對(duì)應(yīng)化合物為尿素；保留時(shí)間(R.T.)為4.62～4.63 min的化合物在一級(jí)質(zhì)譜中顯示了母離子m/z=133，其二級(jí)質(zhì)譜中出現(xiàn)了子離子m/z分別為73和61，對(duì)應(yīng)化合物為N,N- 亞甲基二脲。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用氨基柱可有效地分離尿素、縮二脲、縮三脲、N,N- 亞甲基二脲等組分，從而為采用該方法定量檢測(cè)縮二脲，甚至在未來一次同時(shí)定量檢測(cè)多種脲基縮合物提供了理論基礎(chǔ)。

圖4 參考物質(zhì)分析純縮二脲及部分試驗(yàn)樣品的液相色譜圖及質(zhì)譜分析

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

由縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣所得的色譜圖(圖5內(nèi)插圖)可見,整個(gè)譜圖僅見縮二脲的色譜峰，沒有其他可見雜峰。由工作標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)可知,縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液在縮二脲質(zhì)量濃度為0～200 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R>0.999。

圖5 縮二脲工作標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖及其標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法準(zhǔn)確度及適用性分析

為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確度，選用1種尿素和2種復(fù)混肥料分別進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗(yàn)：將質(zhì)量濃度分別為60，80和100 mg/L的縮二脲溶液加入3種試驗(yàn)樣品中，檢測(cè)加標(biāo)樣品中縮二脲的最終含量并計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

從表5可以看出：樣品中不同濃度梯度的加標(biāo)回收率在98.14%～107.24%范圍內(nèi)，符合美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)制定的關(guān)于方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證的相關(guān)要求，即測(cè)定樣品的質(zhì)量濃度在100 mg/L數(shù)量級(jí)時(shí)，回收率要求在85%～110%[10]，表明該液相色譜方法的準(zhǔn)確度較好。

為了驗(yàn)證硝酸根離子可以被有效分離，從而對(duì)該液相色譜法在195 nm波長下測(cè)定無干擾，在SLV- 114樣品的加標(biāo)回收率試驗(yàn)中額外加入了0.1 g硝酸銨，添加硝酸銨前后的SLV- 114樣品的液相色譜圖見圖6。

表5 試驗(yàn)樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

注：1)額外加入了0.1 g硝酸銨

圖6 添加硝酸銨前后的SLV- 114樣品的液相色譜圖

由圖6可見，保留時(shí)間(R.T.)為4.10 min左右的化合物為縮二脲，添加的硝酸根在195 nm的紫外強(qiáng)吸收造成大的鼓包[9]，但是硝酸根在7.80 min之后才出峰，完全不會(huì)影響縮二脲的定量測(cè)定。另外，圖5所示在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上所得到的縮二脲保留時(shí)間與圖6所示在液相色譜上有所不同，其原因是采用了不同的氨基柱和不同液相色譜儀死體積帶來的，并不會(huì)影響定量分離和分析結(jié)論。

2.5 方法精密度分析

為驗(yàn)證該液相色譜法的精密度，選取了2種尿素和4種復(fù)混肥料樣品，對(duì)每個(gè)肥料樣品進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)并計(jì)算平行試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

從表6可看出：6個(gè)樣品5次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.69%～1.85%，符合美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)制定的關(guān)于方法精密度驗(yàn)證的相關(guān)要求，即單個(gè)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證中，對(duì)于1%濃度數(shù)量級(jí)的樣品測(cè)定，要求方法精密度指標(biāo)——相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于2%[10]，表明該液相色譜法的精密度較好。

表6 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)研究

通過上述系統(tǒng)性的驗(yàn)證研究結(jié)果可以確認(rèn)：新研究開發(fā)的液相色譜法采用氨基柱可有效地將縮二脲與其他脲基縮合物及干擾物質(zhì)分離，并具有較寬的線性范圍、較高的準(zhǔn)確度和精密度。經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織——肥料和土壤調(diào)理劑標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)推薦，由上?；ぱ芯吭河邢薰緺款^組織了國內(nèi)外13個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)活動(dòng)，考察新方法的普適性和精密度(重復(fù)性與再現(xiàn)性)，進(jìn)而確認(rèn)方法的有效性。試驗(yàn)樣品包括NPK復(fù)混肥料(IRT- 001)、脲醛復(fù)合肥料(IRT- 002)、尿素(IRT- 003)、NPK復(fù)合肥料(IRT- 004)、尿素硝銨溶液(IRT- 005)、樹脂-硫復(fù)合包衣尿素(IRT- 006)和脲醛緩釋液體肥料(IRT- 007)共7個(gè)樣品。

國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)研究按國際標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目制定程序進(jìn)行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析依據(jù)ISO 5725- 2:1994《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》(以下簡稱ISO 5725- 2:1994第2部分)進(jìn)行。13個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的7種肥料樣品中的縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)原始數(shù)據(jù)見表7。

表7 13個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的7種肥料樣品中的縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)原始數(shù)據(jù)

2.6.1 數(shù)據(jù)一致性和離群性檢驗(yàn)

根據(jù)ISO 5725- 2:1994第2部分，在對(duì)采用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)所得到的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和精密度參數(shù)計(jì)算前，必須對(duì)數(shù)據(jù)的有效性(一致性)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，剔除對(duì)結(jié)果可能造成干擾的離群值。

(1)Mandel檢驗(yàn)

本研究首先采用Mandel的實(shí)驗(yàn)室間一致性統(tǒng)計(jì)量h和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一致性統(tǒng)計(jì)量k來檢驗(yàn)上述原始數(shù)據(jù)的一致性，即對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室i的每個(gè)水平j(luò)計(jì)算實(shí)驗(yàn)室間的一致性統(tǒng)計(jì)量h和每個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的一致性統(tǒng)計(jì)量k，以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的不同水平為一組(組內(nèi)數(shù)據(jù)按縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平次序排列)進(jìn)行描點(diǎn)作圖，結(jié)果如圖7和圖8所示，圖中水平虛線分別表示顯著性水平為1%及5%時(shí)的Mandel統(tǒng)計(jì)量h與k的臨界值。

圖7 按13個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分組的Mandel實(shí)驗(yàn)室間一致性統(tǒng)計(jì)量h

圖8 按13個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分組的Mandel實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一致性統(tǒng)計(jì)量k

從圖7可以看出，實(shí)驗(yàn)室10在樣品水平IRT- 003和IRT- 005上出現(xiàn)岐離值；實(shí)驗(yàn)室3在樣品水平IRT- 006、實(shí)驗(yàn)室9在樣品水平IRT- 003、實(shí)驗(yàn)室10在樣品水平IRT- 002和IRT- 007上分別出現(xiàn)了離群值。

從圖8可看出：實(shí)驗(yàn)室2和實(shí)驗(yàn)室3在水平IRT- 001上的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果有較大的變異；實(shí)驗(yàn)室2在水平IRT- 003和IRT- 007、實(shí)驗(yàn)室3在水平IRT- 002和IRT- 005、實(shí)驗(yàn)室13在水平IRT- 006上的重復(fù)性測(cè)試結(jié)果有很大的變異。

Mandel統(tǒng)計(jì)圖提示需要采用數(shù)值離群檢驗(yàn)法對(duì)上述數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析。

(2)Cochran檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)數(shù)據(jù)有效性的一項(xiàng)重要假設(shè)是各參與實(shí)驗(yàn)室所提交數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方差沒有顯著差異[11]。按ISO 5725- 2:1994第2部分的要求，首先采用針對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一致性的Cochran檢驗(yàn)法對(duì)各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如果計(jì)算所得Cochran統(tǒng)計(jì)量C大于置信水平5%臨界值但小于等于置信水平1%臨界值，則對(duì)應(yīng)被檢驗(yàn)項(xiàng)目為岐離值；若計(jì)算所得Cochran統(tǒng)計(jì)量C大于置信水平1%臨界值，則對(duì)應(yīng)被檢驗(yàn)項(xiàng)目為離群值。針對(duì)13個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cochran檢驗(yàn)結(jié)果見表8。

從表8可發(fā)現(xiàn)，在水平IRT- 003，IRT- 005和IRT- 007上，Cochran統(tǒng)計(jì)量C的計(jì)算結(jié)果分別為0.812，0.741和0.670，超過了其離群臨界值(0.624)，表明針對(duì)這3個(gè)水平的樣品測(cè)試中，有實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)不能使用，此結(jié)果與從圖8得到的直觀結(jié)果基本符合。經(jīng)進(jìn)一步分析，實(shí)驗(yàn)室2在水平IRT- 003和IRT- 007以及驗(yàn)室3在水平IRT- 005所測(cè)數(shù)據(jù)的絕對(duì)差最大，應(yīng)當(dāng)拒絕這3個(gè)結(jié)果。

表8 針對(duì)13個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cochran檢驗(yàn)結(jié)果

舍棄3個(gè)離群數(shù)據(jù)后，對(duì)其余12個(gè)實(shí)驗(yàn)室在水平IRT- 003，IRT- 005和IRT- 007的測(cè)試值分別再次進(jìn)行Cochran檢驗(yàn)(p=12，n=2)，計(jì)算得到的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量分別為0.547，0.423和0.507，小于顯著水平為1%時(shí)臨界值0.653(p=12，n=2)，故不再存在離群值。

(3)Grubbs檢驗(yàn)

Grubbs檢驗(yàn)是針對(duì)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)一致性進(jìn)行的數(shù)理檢驗(yàn)[12- 13]，此處檢驗(yàn)是針對(duì)通過Cochran檢驗(yàn)后保留的數(shù)據(jù)，故其中在水平IRT- 003，IRT- 005和IRT- 007剩余12個(gè)數(shù)據(jù)。計(jì)算得到的Grubbs檢驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 針對(duì)13個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)Grubbs檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于單側(cè)離群值的Grubbs檢驗(yàn)，如果計(jì)算所得Grubbs統(tǒng)計(jì)量G大于置信水平5%臨界值為岐離值，大于置信水平1%臨界值為離群值。對(duì)于雙側(cè)離群值的Grubbs檢驗(yàn)，如果計(jì)算所得Grubbs統(tǒng)計(jì)量G小于置信水平5%臨界值為岐離值，小于置信水平1%臨界值為離群值。

表9表明，13個(gè)實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)存所有數(shù)據(jù)(經(jīng)Cochran統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)保留的有效數(shù)據(jù))中不存在離群值，均為通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的有效數(shù)據(jù)。

2.6.2 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算分析

通過上述數(shù)據(jù)一致性和離群值的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將13個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用研究開發(fā)的液相色譜法測(cè)定肥料中縮二脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值(m)、重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差(Sr)和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差(SR)進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如表10所示。

表10 13個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算結(jié)果

考察表10中標(biāo)準(zhǔn)差與m的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)差與m沒有明顯的線性或?qū)?shù)線性關(guān)系。根據(jù)ISO 5725- 2:1994第2部分的相關(guān)規(guī)定，可以采用所得各含量水平的Sr和SR的平均值來表征該方法的精密度，即對(duì)于試驗(yàn)縮二脲含量水平，該方法的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=7.71×10-3，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SR=3.66×10-2。

2.6.3 參與比對(duì)實(shí)驗(yàn)室的反饋

通過國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)活動(dòng)，不僅考察了研究開發(fā)的液相色譜法的普適性及精密度，還在試驗(yàn)過程中得到了參與實(shí)驗(yàn)室的反饋意見，對(duì)該方法進(jìn)一步規(guī)范化具有積極意義。

(1)部分參與實(shí)驗(yàn)室，如實(shí)驗(yàn)室12沒有采用表2所推薦的氨基色譜柱，而是采用了GRACE(Alltima)Amino型氨基色譜柱，導(dǎo)致縮二脲等物質(zhì)的保留時(shí)間與圖5所示有差異。隨后進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)表明，該實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)通過了一致性檢驗(yàn)，這進(jìn)一步印證了表2中提及的能夠達(dá)到相同分析效果的氨基色譜柱都可以使用。

(2)實(shí)驗(yàn)室7報(bào)告觀測(cè)到樣品IRT- 007樹脂-硫復(fù)合包衣尿素的實(shí)測(cè)縮二脲含量隨前處理過程中的超聲時(shí)間不同有所差異，其原因可能是超聲時(shí)間會(huì)影響樣品中縮二脲的測(cè)定結(jié)果，這也是在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定統(tǒng)一的超聲時(shí)間為10 min的原因。

2.6.4 國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)論

為確定試驗(yàn)方法的精密度，對(duì)尿基肥料樣品中的縮二脲含量開展國際間實(shí)驗(yàn)室比對(duì)試驗(yàn)，在試驗(yàn)方案實(shí)施過程中共征集到13個(gè)實(shí)驗(yàn)室并提供了試驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的精密度按ISO 5725- 2:1994第2部分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共發(fā)現(xiàn)有3個(gè)離群值，沒有離群實(shí)驗(yàn)室，所產(chǎn)生的離群值是由隨機(jī)誤差引起的。精密度結(jié)果表明研究開發(fā)的高效液相色譜法測(cè)定肥料中縮二脲含量是可行的，各實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)定值有較好的一致性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到的精密度結(jié)果能用來確定試驗(yàn)方法的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)語

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和一系列有代表性的肥料樣品的系統(tǒng)性試驗(yàn)分析，驗(yàn)證了高效液相色譜法采用氨基色譜柱能有效地將縮二脲與其他脲基縮合物及干擾物質(zhì)分離，具有較寬的線性范圍、較高的準(zhǔn)確度和精密度，從而建立了測(cè)定尿基肥料中縮二脲含量的新方法——高效液相色譜法。通過組織國內(nèi)外13個(gè)分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行國際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該新方法適用性廣且精密度高，因而被推薦作為新的國際標(biāo)準(zhǔn)。

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DeterminationofBiuretContentinUrea-BasedFertilizersandtheDevelopmentofRelatedInternationalStandard

ZHANG Minghong, CHU Deren, LIU Gang

(Shanghai Research Institute of Chemical Industry Co., Ltd., National Center for Quality Supervision and Testing of Chemical Fertilizers 〔Shanghai〕, Shanghai 200062, China)

A new analytical method has been developed of determining the biuret content in urea- based fertilizers with high performance liquid chromatography. The new HPLC method utilizing amino column can effectively separate biuret from other urea- condensates and interfering substances, and thus can solve some practical problems encountered during the application of the national standard “GB/T 22924—2008 Determination of biuret content for compound fertilizers (complex fertilizers)”. Systematic experiments on both reference materials and a series of fertilizer samples have verified that the newly- developed method has good applicability, accuracy and precision. An international ring comparison test with 13 participating labs around the world has been conducted. Statistical analysis has revealed that the new method is both universal and precise, thus it is recommended as the next-generation international standard.

biuret; urea- based fertilizer; international standard; high performance liquid chro-matography

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(15DZ0504700) 作者簡介：章明洪(1968—)，男，高級(jí)工程師，從事肥料質(zhì)量監(jiān)測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)化工作；zmh@ghs.cn

O657.7+2

A

：1006- 7779(2017)03- 0001- 10

2017- 02- 15)