王永輝，張曉園，李艷彥，周 然

(1. 山西中醫(yī)學院，山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫(yī)院，太原 030012)

【實驗研究】

基于JAK2/STAT3信號通路探討風濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎的作用機制?

王永輝1，張曉園2，李艷彥1，周 然1

(1. 山西中醫(yī)學院，山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫(yī)院，太原 030012)

目的：探討風濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎模型大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響及作用機制。方法：SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、tofacitinib組(15mg·kg-1)和風濕寧高、中、低劑量組(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)每組各12只；除正常組外，其余各組大鼠均采用人工氣候箱模擬寒濕環(huán)境結合II型膠原誘導的方法制備寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎大鼠模型，造模成功后，各組大鼠灌胃給予相應藥物進行干預，每日1次，連續(xù)28 d；觀察藥物對大鼠關節(jié)腫脹度、關節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3及JAK2/STAT3通路負反饋抑制因子SOCS3的mRNA和蛋白表達情況。結果：風濕寧膠囊可顯著降低寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎模型大鼠的關節(jié)腫脹度，抑制JAK2、STAT3 mRNA及蛋白的過表達，促進SOCS3 mRNA及蛋白表達。結論: 風濕寧膠囊抑制JAK2/STAT3信號通路的過度激活作用是其治療類風濕關節(jié)炎的重要機制之一。

風濕寧膠囊；類風濕關節(jié)炎；寒濕痹阻；JAK2/STAT3信號通路

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以多關節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性、自身免疫性疾病[1]，其病變主要影響外周關節(jié)，也可累及皮膚、心臟、肺、眼睛等其他組織和器官。RA在我國的發(fā)病率為0.32%～0.38%，疾病早期主要表現(xiàn)為關節(jié)腫脹、疼痛及進行性關節(jié)軟骨和骨的破壞，若不及時治療最終會導致關節(jié)畸形、功能喪失，有很高的致殘率，給患者及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[2]。

雖然遺傳、環(huán)境及免疫系統(tǒng)紊亂等多種因素均可誘發(fā)RA，但其發(fā)病原因及機制至今尚不明確。因此，針對RA發(fā)病機理的研究和尋找新的治療靶點是風濕病學界的一項重要課題。近年來RA的發(fā)生被證明，與體內多種炎性因子、趨化因子和基質降解分子密切相關，正是這些因子引發(fā)了對關節(jié)腔的持續(xù)侵襲，最終造成關節(jié)損傷。JAK2/STAT3信號通路因廣泛參與RA患者關節(jié)滑膜細胞的增殖、凋亡、炎癥反應、血管翳形成和機體免疫調節(jié)等過程，已成為國內外學者研究的熱點[3]。本研究建立了寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎大鼠模型，觀察了風濕寧膠囊對其關節(jié)腫脹度及滑膜組織中JAK2/STAT3通路相關蛋白的影響，從JAK2/STAT3信號通路角度探討了風濕寧膠囊治療類風濕關節(jié)炎的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

風濕寧膠囊，山西仁源堂藥業(yè)有限公司(20150314)；完全弗氏佐劑，美國Sigma公司(F5881)；II型膠原，美國Chondrex公司(100028)；tofacitinib，美國Selleck公司中國分公司(S5001)；Anti- JAK2 antibody，美國abcam公司(ab32101)；Anti- STAT3 antibody，美國abcam公司(ab119352)；Anti- SOCS3 antibody，美國abcam公司(ab16030)。

1.2 儀器

PCR擴增儀，BIO公司；StepOne熒光定量PCR儀，ABI公司；LRH- 800- GSI人工氣候箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；IX51光學顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海復日科技有限公司；TU- 1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；LXJ- II離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠；DHP- 9612恒溫培育箱，上海一恒科技有限公司；AC8洗板機，芬蘭Thermo Labsystems公司；PPTHK- 21B攤片機，徠克公司；CM1850冷凍切片機，徠克公司； HC- 2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳儀器有限公司；DYY- 6C電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠72只，8周齡，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司(合格證號SCXK- (京)2012- 0001)。

2 方法

2.1 分組、模型制備及給藥

適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、tofacitinib組(15 mg·kg-1)和風濕寧高、中、低劑量組(1.32，0.66，0.33 g·kg-1)6組。造模當日，除正常組外將其余各組大鼠置氣候箱中模擬寒濕環(huán)境[RH=(90±4)%，T=(6±2)℃]持續(xù)刺激8 h，每日1次，連續(xù)14 d；造模第7天，除正常組外其余各組大鼠均于右后肢足爪、尾根、背部各注射Ⅱ型膠原乳液(1 mg·mL-1)0.1 mL，正常組大鼠于相同部位皮下注射等量生理鹽水；造模第14天同法免疫加強1次，以制備寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎大鼠動物模型。次日開始給藥干預(記為1 d)，各組大鼠分別灌胃相應藥物，正常組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)28 d。

2.2 指標檢測

表1顯示，從第1天開始，每7 d采用容積法檢測各組大鼠右后肢容積，按下列計算關節(jié)腫脹度：腫脹度=(造模前容積-造模后容積)/造模前容積×100%。于末次給藥24 h后處死大鼠，取右踝關節(jié)滑膜組織，分別采用免疫熒光和Western blot法檢測滑膜中JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表達水平，采用Real time- PCR法對滑膜組織中JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表達水平進行檢測，結果分析采用2- △△CT法。

表1 JAK2、STAT3及SOCS3基因PCR 引物序列和反應條件

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 風濕寧對大鼠關節(jié)腫脹度的影響

表1顯示，在整個給藥周期中，模型組大鼠關節(jié)腫脹度較正常組顯著升高(P<0.05)；自給藥第14天起，風濕寧高、中劑量組大鼠關節(jié)腫脹度較模型組顯著降低(P<0.05)，至第28天，風濕寧各劑量組大鼠關節(jié)腫脹度均較模型組顯著降低(P<0.05)，其中高、中劑量組抗關節(jié)腫脹作用明顯優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，但高、中劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 風濕寧對大鼠關節(jié)腫脹度的影響

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與風濕寧低劑量組比較：△P<0.05

3.2 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2、STAT3及SOCS3 mRNA表達的影響

表2顯示，與正常組比較，模型組和風濕寧各劑量組大鼠滑膜組織中JAK2、STAT3和SOCS3 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)；tofacitinib組JAK2、SOCS3 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，但STAT3 mRNA的表達未見明顯改變(P>0.05)；與模型組比較，tofacitinib組、風濕寧高、中劑量組JAK2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)；風濕寧高劑量組STAT3 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，風濕寧各劑量組SOCS3 mRNA表達顯著升高(P<0.05)，tofacitinib組中SOCS3 mRNA的表達顯著降低(P<0.05)。

3.3 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2、STAT3及SOCS3蛋白表達的影響

表2圖1顯示，與正常組比較，模型組和風濕寧各劑量組大鼠滑膜組織JAK2、STAT3和SOCS3蛋白的表達顯著升高(P<0.05)；tofacitinib組JAK2、SOCS3蛋白的表達顯著下降(P<0.05)，而STAT3蛋白的表達未見明顯改變(P>0.05)。與模型組比較，tofacitinib組、風濕寧高、中劑量組JAK2蛋白的含量顯著降低(P<0.05)；tofacitinib組、風濕寧高劑量組STAT3蛋白的表達顯著降低(P<0.05)，風濕寧各劑量組SOCS3蛋白含量均有不同程度的升高(P<0.05)，但各劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，tofacitinib組中SOCS3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

表2 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2、STAT3、SOCS3 mRNA及蛋白表達的影響

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05；與風濕寧低劑量組比較:△P<0.05

圖1 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2、STAT3、SOCS3蛋白表達的影響注：從左至右依次為正常組、模型組、tofacitinib組、風濕寧高、中、低劑量組

3.4 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2、STAT3蛋白免疫熒光表達的影響

圖2、3顯示，與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中JAK2和STAT3蛋白表達顯著增多，tofacitinib組中JAK2和STAT3表達明顯降低，風濕寧高、中劑量組JAK2和STAT3蛋白表達有不同程度的降低。

圖2 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜JAK2免疫熒光表達的影響(100×)

圖3 風濕寧對大鼠關節(jié)滑膜STAT3免疫熒光表達的影響(100×)

4 討論

類風濕關節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L、寒、濕三氣雜至，合而為痹也?！痹凇叭龤庵卤詫W說”中，寒、濕二邪尤為重要，寒性收引凝滯，客于經(jīng)脈，氣血為其所痹阻，表現(xiàn)為關節(jié)冷痛；濕性重濁黏滯，阻礙氣血運行，表現(xiàn)為肢體疼痛重著，寒濕相雜，病情多纏綿難愈?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，JAK/STAT信號通路是介導與 RA 發(fā)病有關細胞因子傳導的重要途徑，由其所介導并引發(fā)的炎癥級聯(lián)放大效應是RA致病的關鍵[4]。JAK有4個家族成員，其中JAK3僅在骨髓、淋巴系統(tǒng)中表達，JAK1、JAK2和TYK2則廣泛分布于機體的細胞和組織中[5]。STAT位于JAK下游，是信號傳導及轉錄激活因子，JAK使其磷酸化后形成二聚體而激活，活化的STAT二聚體轉移到細胞核內與相應的靶基因啟動子結合后，進而激活基因轉錄和表達[6]。SOCS是JAK/STAT信號通路的自身負反饋調節(jié)因子[7]，由其介導的負反饋調節(jié)可抑制因JAK/STAT信號通路持續(xù)開放而造成的細胞代謝失調和功能紊亂。RA患者滑膜組織中JAK2、STAT3呈高表達狀態(tài)[8]，其中，STAT3的激活僅存在于RA患者的滑膜組織中，而在一般關節(jié)炎患者的滑膜組織中表達極低[9]。在RA的發(fā)生發(fā)展過程中，滑膜細胞中STAT3的持續(xù)表達是引發(fā)滑膜炎癥的主要因素之一。IL- 6、IL- 10和IFNs都可使STAT3激活，從而抑制成纖維滑膜細胞的凋亡，并增加T淋巴細胞的活性，進一步加重類風濕的臨床癥狀[10-11]。基因靶向研究已表明，SOCS3具有對抗IL- 6/STAT3 的作用[12]。

風濕寧膠囊具有祛風散寒、除濕通絡、活血止痛之功，主治風寒濕兼瘀血阻絡型痹癥。自20世紀80年代起，風濕寧膠囊以醫(yī)院制劑的形式來治療類風濕性疾病，經(jīng)過多年的臨床應用證明，其對類風濕關節(jié)炎的有效率可達90.8%，可明顯改善患者的臨床癥狀，延緩或阻止病情的繼續(xù)發(fā)展[13]。JAK/STAT信號通路是一條由多種細胞因子受體刺激的信號傳導通路，IL- 6、IL- 17、IL- 21和IFNα/β等多種因子可通過不同途徑激活 JAK/STAT 信號通路[14]。前期研究表明，風濕寧膠囊具有改善機體免疫失衡、調節(jié)炎性與抗炎細胞因子比例等作用，能夠顯著降低外周血Th17 細胞比率，減少IL- 1β、IL- 4、IL- 6、IL- 10、IL- 17A、TNF- α、IFN- γ等炎性因子的分泌[15-16]。本研究進一步觀察了風濕寧膠囊對寒濕痹阻型類風濕關節(jié)炎模型大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響。實驗發(fā)現(xiàn), 與正常組比較，模型組大鼠關節(jié)滑膜中JAK2、STAT3的mRNA和蛋白表達均顯著增加。風濕寧膠囊可促進大鼠滑膜組織中JAK2/STAT3信號通路負反饋調節(jié)因子SOCS3 mRNA和蛋白的表達，抑制JAK2、STAT3 mRNA和蛋白的過表達，表現(xiàn)出對JAK2/STAT3通路過度激活狀態(tài)的抑制效應。綜上所述，風濕寧膠囊抑制JAK2/STAT3信號通路的過度激活作用是其治療類風濕關節(jié)炎的重要機制之一。

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Functional Mechanism of Fengshining Capsule on the Cold Dampness Blockage Type of Rheumatoid Arthritis Based on the Jak2/Stat3 Signaling Pathway

WANG Yong- hui1, ZHANG Xiao- yuan2, LI Yan- yan1, ZHOU Ran1

(1. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi Jinzhong 030619,China; 2. Shanxi Provincial Hospital of traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030012,China)

Objective: Investigating the effects and mechanism of Fengshining capsules (FSN) on CIA (Type of Cold dampness Blocked in Joints, CDM) rats model via JAK2 / STAT3 signal pathway. Method: SD rats were randomly divided into 6 groups, each group of 12, using artificial climate chamber simulated cold- dampness environment and type II collagen induced CWM rats model，and treated by FSN (1.32,0.66,0.33 g · kg-1),1times daily, for 28 consecutive days. Observed rats ankle swelling, mRNA and protein expression of JAK2, STAT3 and SOCS3 in synovial tissue. Results：FSN can effectively reduce the CWM rats ankle swelling degree, reduced mRNA and protein expression of JAK2 and STAT3, promoted the mRNA and protein expression of SOCS3. Conclusion: FSN has obvious therapeutic effect on CWM rats model, the mechanism was related to inhibitory action on the excessive activation of JAK2/STAT3 signal pathway.

Fengshining Capsules; CIA rats; Type of Cold dampness Blocked in Joints; JAK2/STAT3 signal pathway

國家自然科學基金面上項目(81473589)-基于JAK- STAT信號轉導通路利用蛋白組學技術從方病證相關角度研究風濕寧膠囊治療類風濕關節(jié)炎的作用機制

王永輝(1974- )，男，山西忻州人，副教授，醫(yī)學博士，從事方藥功用物質基礎與藥理作用研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0949- 04

2017- 02- 14