劉佩沂，賴岳曉，田素英

(1. 中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429； 2. ．廣東藥科大學(xué)，廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣州 510006)

【實(shí)驗(yàn)研究】

金番止瀉膠囊對(duì)脾虛小鼠腸道菌群的影響及體外抗菌作用?

劉佩沂1，賴岳曉1，田素英2,3△

(1. 中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429； 2. ．廣東藥科大學(xué)，廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣州 510006)

目的: 探討金番止瀉膠囊對(duì)脾虛小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及體外抗菌作用。方法: 利用番瀉葉灌胃加饑飽失常復(fù)制小鼠脾虛模型，經(jīng)金番止瀉膠囊治療后，以菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)其盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及腸桿菌的數(shù)量；采用紙片擴(kuò)散法、試管2倍稀釋法考察金番止瀉膠囊對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌的抑菌作用。結(jié)果： 與正常組比較，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及腸桿菌數(shù)量均升高，金番止瀉膠囊高(1.2 g·kg-1)、低劑量組(0.6 g·kg-1)指標(biāo)均有一定的恢復(fù)并接近正常水平。對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌的MIC(mg·mL-1)分別為12.8、8.51、6.4、7.6、8.27。結(jié)論: 金番止瀉膠囊對(duì)脾虛小鼠腸道菌群有調(diào)節(jié)作用，在體外有抑菌作用。

金番止瀉膠囊；脾虛；腸道菌群；體外抗菌

金番止瀉膠囊選用我國(guó)資源豐富的番石榴葉、金櫻根等為原料，金櫻根[1-2]、番石榴葉[3]有很好的抗菌調(diào)節(jié)菌群的作用。金番止瀉膠囊是分別用水、乙醇提取各藥有效部位，按前期實(shí)驗(yàn)的最佳比例制成。方中藥味數(shù)較少，制備工藝簡(jiǎn)單，原料成本較低，藥效顯著。

1 材料

KM小鼠由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (粵) 2012- 0125)，飼養(yǎng)于溫度(20±2)℃、濕度(60%±10%)的環(huán)境下。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、腸球菌培養(yǎng)基(EC)、雙歧桿菌培養(yǎng)基(改良MRS)、乳酸桿菌培養(yǎng)基(MC) 由實(shí)驗(yàn)室自制。自制金番止瀉膠囊，番瀉葉(購(gòu)于廣東康圣藥業(yè)，批號(hào)20150710)按常規(guī)方法煎成生藥濃度為1 g·mL-1的水煎液。麗珠腸樂(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，0.5億活菌/20粒，批號(hào) 20150715)、黃連小檗堿片(青島黃海制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021111)。

2 方法

2.1 對(duì)脾虛小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

表1顯示， 健康小鼠60只雌雄各半。除正常組外，其余50只小鼠ig番瀉葉水煎液(15 mg·g-1)，并隔天禁食。連續(xù)造模8 d后，小鼠出現(xiàn)成群蜷縮、拱背，攝食減少，糞便松軟膨大、不成形甚至便溏，部分出現(xiàn)脫肛、毛色晦暗、體質(zhì)量下降等脾虛癥狀，提示造模成功。挑選造模成功的小鼠將其分為模型組、金番止瀉膠囊低劑量組(0.6 g·kg-1)、高劑量組(1.2 g·kg-1)、麗珠腸樂陽(yáng)性組(0.3 g·kg-1)，正常組及模型組給予等量蒸餾水，連續(xù)10 d，觀察并記錄小鼠狀況。無菌狀態(tài)下取盲腸內(nèi)容物0.1 g置于EP管中，加入0.9 mL無菌生理鹽水，經(jīng)震蕩器均質(zhì)所得標(biāo)本液按稀釋度為10-1，依此操作稀釋標(biāo)本至10-6，采用涂布法定量接種0.1 mL細(xì)菌混懸液，腸桿菌、腸球菌需氧培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌厭氧培養(yǎng)48 h。根據(jù)各菌落在培養(yǎng)基上的菌落特征及革蘭染色進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果以菌落形成單位/g(CFU·g-1) 的對(duì)數(shù)表示。

表1 小鼠糞便中腸道菌群檢測(cè)結(jié)果

注：與模型組比較:*P<0.05;與正常對(duì)照組比較:#P<0.05。

3 結(jié)果

3.1 金番止瀉膠囊對(duì)脾虛小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

表1顯示，給予脾虛模型小鼠金番止瀉膠囊后實(shí)驗(yàn)所選4種主要腸道菌群基本恢復(fù)到正常水平。與正常組比較，各腸道菌群數(shù)量增加差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組組比較，各腸道菌群的數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明金番止瀉膠囊具有扶植正常菌群生長(zhǎng)和調(diào)整菌群失調(diào)的作用；且金番止瀉膠囊高劑量組與陽(yáng)性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而低劑量組腸道菌群的恢復(fù)效果低于陽(yáng)性組。

3.2 體外抗菌作用

表2顯示，取滅菌后番金止瀉膠囊10 g用無菌生理鹽水溶化備用(含藥量為6.7 g.100 mL-1)。將菌種接種到100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，搖床37 ℃擴(kuò)菌24 h。吸取菌懸液0.5 mL于無菌試管中，加4.5 mL無菌生理鹽水定容10倍稀釋。精密移取滅菌過的15 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂于試管中，用1 mL無菌滴管分別移取0.2 mL 10-5～10-9各濃度的菌懸液于試管中，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無菌紙片含各藥物500 μg。測(cè)量抑菌圈的直徑大小。

試管2倍稀釋法：各取2 mLMH肉湯分別加入10支無菌試管中。1號(hào)管加入藥液2 mL混合均勻后吸移取2 mL加入2號(hào)管,依法稀釋至8號(hào)管，吸取2 mL棄去，10號(hào)管為肉湯無菌生長(zhǎng)對(duì)照管，9號(hào)管為細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照管。除10號(hào)管，用無菌加樣器在其余各管中加入菌液100 μL，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16 h。凡澄清透明的管定為無菌生長(zhǎng)，以無菌生長(zhǎng)的最高藥物稀釋度為該藥液對(duì)細(xì)菌的MIC。

表2 金番止瀉膠囊體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 金番止瀉膠囊的體外抗菌作用

表2顯示，番金止瀉膠囊痢疾桿菌、金葡球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有抑菌活性作用。

試管2倍稀釋法結(jié)果顯示，番金止瀉膠囊對(duì)痢疾桿菌、金葡球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌的MIC(mg·mL-1)依次為8.27、6.40、7.60、8.51、12.80。

4 討論

小鼠脾虛模型的制備方法較多，如過度抗生素法[5]番瀉葉瀉下致脾虛模型是大家公認(rèn)的方法[6]但考慮飲食失節(jié)疲倦過度也可致脾虛，故本實(shí)驗(yàn)采用番瀉葉瀉下加隔天禁食法制備小鼠脾虛模型。本實(shí)驗(yàn)中，脾虛小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌數(shù)量有所減少，可能是因?yàn)楦篂a嚴(yán)重導(dǎo)致腸道內(nèi)常駐菌大量排出，以致腸道內(nèi)微生態(tài)失調(diào)，經(jīng)金番止瀉膠囊治療后，菌落數(shù)趨于恢復(fù)正常，且高劑量(1.2 g·kg-1) 作用更好，有量效關(guān)系。

金番止瀉膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌等所選細(xì)菌在體外均有明顯的抑菌作用，抑菌圈邊緣清晰，與黃連小檗堿進(jìn)行對(duì)照，但效果不及黃連小檗堿。

[1] 譚年秀，郭巧玲，田素英．金櫻根的藥用歷史及現(xiàn)代研究概況[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010,6(12)：167- 169．

[2] 賴岳曉,嚴(yán)寒靜,田素英,等.金櫻根提取物體外抑菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].今日藥學(xué)，2012,22(9):531- 433．

[3] 王芳,王力,董樂,等．番石榴葉提取物的鑒定及其抗菌作用[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，3(5):365- 367．

[4] 高云芳,姚洋.不同劑量四君子湯對(duì)脾虛證小鼠消化和免疫功能的影響[J].中草藥,2007,38(4):558- 562．

[5] 王艷,張立,田素英,等.金櫻根、金櫻莖多糖對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠調(diào)整作用的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(20):270- 272.

[6] 陳學(xué)習(xí).脾虛證動(dòng)物模型復(fù)制方法研究概況評(píng)價(jià)與思考[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(33):5- 6.

Effect of Jinfan Zhixie Capsule on Gut Flora in Spleen- deficiency Mice and in Vitro Bacteriostasis

LIU Pei- yi1, LAI Yue- xiao1, TIAN Su- ying2,3△

(1. Zhongshan Huangpu People's Hospital,Zhongshan Guangdong 5284292,China; 2. Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong 510006,China; 3. Guangdong Cosmetics Engineering & Technology Research Center,Guangzhou 510006,China)

Objective: To observe the effects of gut flora in spleen- deficiency mice and in vitro bacteriostasis of Jinfan Zhixie Capsule(JZC).Methods: Establishing the spleen- deficiency mice model with senna extract and fully and poorly feeding food in turn,and then detect the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus and Escherichia coli in mice cecum contents by colo- ny counting after treated with JZC.By filtering paper method and tube double dilution method to inspec the bacteriostasis effect for Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi on JZC. Results: Compared with the normal control group，the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,and Escherichia coli in mice cecum contents increased in model group.After treated with the 1.2 g·kg-1and 0.6 g·kg-1of JZC，all the indexes have certain recovery and close to the normal level. The MIC values(mg·mL-1)againsts Bacillus subtilis,Escherichiacoli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi respectively were 12.8、8.51、6.4、7.6、8.27.Conclusion JZC has dependent manner recovered the gut flora in spleen- deficiency mice,and in vitro bacteriostasis.

Jinfan Zhixie capsule; Spleen deficiency; Gut flora; in vitro bacteriostasis

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省課題項(xiàng)目 (20151126); 2014 年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014036);廣東藥科大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”醫(yī)藥化工省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心資助項(xiàng)目

劉佩沂(1976-)，女，主任藥師，從事中藥學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者：田素英，從事中藥應(yīng)用教學(xué)與研究，Tel：15362965291,E-mail:zsxqtsy@126.com。

R285.5

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1006- 3250(2017)07- 0937- 02

2017-03-16