曹利華，劉蕊莉，苗明三

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000)

【實驗研究】

毛冬青總皂苷對小鼠腦缺血再灌注模型的影響?

曹利華，劉蕊莉，苗明三△

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000)

目的：探討毛冬青總皂苷對小鼠腦缺血再灌注模型的作用機(jī)制及特點。方法：將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、金納多組、毛冬青總皂苷大、中、小劑量組7組。采用阻斷小鼠雙側(cè)頸總動脈缺血10 min、恢復(fù)灌流10 min、再缺血10 min、恢復(fù)供血、再灌注24 h，研究毛冬青總皂苷對腦缺血再灌注小鼠的NO水平和NOS活力，Na+- K+- ATP酶、Mg2+- ATP酶、Ca2+- ATP酶的含量以及腦組織神經(jīng)細(xì)胞的影響。結(jié)果：小鼠腦缺血再灌注模型復(fù)制成功，毛冬青總皂苷可顯著降低腦勻漿中NO水平、NOS活力、升高腦勻漿中ATP酶活力，并顯著減輕腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，均以大劑量、中劑量為優(yōu)。結(jié)論：毛冬青總皂苷可顯著改善小鼠腦缺血再灌注模型的腦缺血狀況，具有抗腦缺血損傷的作用。

毛冬青總皂苷；腦缺血再灌注；神經(jīng)細(xì)胞

毛冬青為冬青科冬青屬植物IlexpubescensHook.et Arn.的干燥根，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效，生于山坡灌木叢中，是我國南方常用中藥。臨床上廣泛用于治療冠心病、缺血性腦中風(fēng)、心絞痛、脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎、扁桃體炎、咽喉炎、小兒肺炎等，具有較好的療效[1]。本實驗通過復(fù)制小鼠腦缺血再灌注模型，觀察毛冬青總皂苷對小鼠腦缺血再灌注后炎癥介質(zhì)及炎癥因子、腦組織能量代謝、腦部組織形態(tài)學(xué)的影響，探討其腦保護(hù)作用的特點及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑

毛冬青(總皂苷含量為51%，批號20100312；河南中醫(yī)學(xué)院分析化學(xué)實驗室提供)、銀杏葉提取物片(金納多，德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，批號0601209)、尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號0808170)。 考馬斯亮蘭檢測試劑盒(批號20100626)、ATP(Adenosine- triphosphate)檢測試劑盒(批號20100613)、NO(Nitric oxide)檢測試劑盒(批號20100626)、NOS(Nitric oxide synthetase)檢測試劑盒(批號20100626)均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 儀器

UV- 2000紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司生產(chǎn))，TGL- 16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))，JA1 103 N電子分析天平(奧豪斯(上海)公司生產(chǎn))，DZKW- 4型電子恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn))，DY89- 1型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn))，可調(diào)式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司生產(chǎn))，2200H型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司生產(chǎn))。

1.3 動物

昆明種雄性小鼠119只，體質(zhì)量(28～32) g，河北省實驗動物中心提供(合格證號1006019，實驗室合格證號SYXK(豫)2010- 001)。

1.4 造模與給藥

119只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、金納多組、毛冬青總皂苷大、中、小劑量組7組，每組17只。除假手術(shù)組外，其余6組造小鼠短暫腦缺血再灌注模型。大、中、小劑量毛冬青總皂苷(300 mg/kg、150 mg/kg、75 mg/kg，用0.1%羧甲基纖維素鈉(CMC)，分別配成濃度30 mg/ml、15 mg/ml、7.5 mg/ml的混懸液，體積0.1 ml/10 g)、金納多組(陽性對照藥，給藥劑量為40 mg/kg，用0.1%CMC配成4 mg/ml的混懸液，體積0.1 ml/10 g)、尼莫地平組(陽性對照藥，給藥劑量為40 mg/kg，用0.1%CMC配成4 mg/ml的混懸液，體積0.1 ml/10 g)、模型組(灌服同體積0.1%CMC)，每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。于第10天(禁食12 h)給藥后1 h，10%水合氯醛0.03 ml/10 g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)、備皮，酒精消毒頸部，手術(shù)刀作頸部正中切口，逐漸分離周圍肌肉至雙側(cè)頸總動脈(CCA)，再用彎頭小鑷子剝離周圍神經(jīng)分離CCA，每個動脈用直徑約為0.3 mm的針灸針鉤起，使其約90°，缺血10 min，恢復(fù)灌流10 min，再缺血10 min，恢復(fù)供血并縫合小鼠。假手術(shù)組除不阻斷CCA外，其他操作同造模各組。

1.5 取材與指標(biāo)檢測

所有小鼠再灌注24 h后眼眶取血測血液流變學(xué)，然后脫頸椎處死迅速取腦，矢狀切取4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)固定，用于HE染色。另一半在濾紙上吸凈血跡準(zhǔn)確稱重，根據(jù)稱重結(jié)果計算加入的冰生理鹽水量，以腦組織(g)：生理鹽水(ml)=1∶9比例制成10%的腦勻漿，4 ℃3000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃以下低溫保存。按照試劑盒說明書分別測定NO、NOS酶、Na+- K+- ATP酶、Mg2+- ATP酶及Ca2+- ATP酶含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦勻漿NO、NOS、ATP酶含量比較

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織NO含量、tNOS、iNOS活力顯著升高(P<0.01)，Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶、Mg2+- ATP酶的活力顯著降低(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，尼莫地平組、金納多組、大、中劑量毛冬青總皂苷均能顯著降低NO含量和tNOS、iNOS活力，顯著升高Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶及Mg2+- ATP酶活力(P<0.01)，毛冬青總皂苷小劑量組iNOS活力明顯降低(P<0.05)，Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶活力明顯升高(P<0.05)，表明毛冬青總皂苷對小鼠腦缺血再灌注損傷腦組織中NO以及NOS活力變化均有明顯改善作用。并可通過提高實驗小鼠腦組織的ATP酶活力，改善腦部能量代謝，對腦缺血再灌注損傷有較好的改善作用。從各組小鼠死亡情況可以看出，模型組死亡率高于用藥各組，且大劑量組毛冬青總皂苷的死亡率最低，說明用藥各組對缺血再灌注小鼠有一定的保護(hù)作用。

表1 各組小鼠腦勻漿中NO、NOS、ATP酶含量比較

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 各組小鼠腦海馬區(qū)與皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化比較

圖1顯示，假手術(shù)組小鼠海馬區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞未見異常病理改變，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)蓬松，核仁清晰；模型組小鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫和溶解現(xiàn)象，細(xì)胞核模糊；尼莫地平組、金納多組、高劑量、中劑量毛冬青總皂苷組小鼠腦海馬區(qū)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)輕度萎縮，部分神經(jīng)細(xì)胞漿與核模糊不清，個別神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞萎縮而淡染；小劑量毛冬青總皂苷組小鼠腦海馬區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞輕度萎縮及輕度水腫，胞漿與胞核模糊不清。

圖1 各組小鼠腦組織海馬區(qū)HE染色(HE×40)

圖2顯示，假手術(shù)組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞未見異常病理改變，神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均正常；模型組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯水腫、萎縮或消失；尼莫地平組、金納多組、大劑量、中劑量毛冬青總皂苷組大腦皮層的少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞核較清晰，膠質(zhì)細(xì)胞基本正常。小劑量毛冬青總皂苷組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞胞漿與胞核模糊不清，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞淡染、萎縮及固縮。

圖2 各組小鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)HE染色(HE×40)

表2顯示，經(jīng)Ridit檢驗與假手術(shù)組比較，模型組小鼠大腦海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)顯著病理變化(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，大、中劑量毛冬青總皂苷組、金納多組和尼莫地平組均可明顯減輕小鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)的病理變化(P<0.05)，小劑量毛冬青總皂苷組對小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的改善作用(P<0.05)，而對小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)的病理變化僅有減輕趨勢。

3 討論

腦缺血- 再灌注損傷是一定條件下，缺血腦組織恢復(fù)血液供應(yīng)后出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，常見于休克、腦血管栓塞再通、心肺腦復(fù)蘇等。缺血性腦血管病的發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率、死亡率都很高，隨著我國人口老齡化進(jìn)程加快，預(yù)計腦血管病的發(fā)病率在今后將繼續(xù)升高，其危害也會越來越嚴(yán)重[2]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腦缺血的治療主要采用溶栓藥或降纖酶類藥物[3]，以恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，但同時也帶來了再灌注損傷，故抑制再灌注損傷已成為治療缺血性腦血管疾病的重要環(huán)節(jié)。近年來，中醫(yī)藥防治腦缺血- 再灌注損傷的研究發(fā)展迅速，中醫(yī)認(rèn)為應(yīng)將其歸為缺血中風(fēng)范疇，主要與風(fēng)、火、瘀、痰、虛等因素有關(guān)。缺血性中風(fēng)發(fā)生后，往往由于“瘀阻腦絡(luò)”而與瘀關(guān)系最為密切，因此大多數(shù)學(xué)者主張使用以“活血化瘀”改善微循環(huán)為主的治則來治療本病[4- 6]。有學(xué)者[7-8]提出“毒邪”和“絡(luò)病”可作為深入研究的切入點，無疑是對中風(fēng)發(fā)病理論的新思考?；凇凹韧奔嬗凇艾F(xiàn)代”提出用清熱解毒合并活血化瘀法治療腦缺血，解毒以祛除損害因素，通絡(luò)以暢通氣血滲灌，從而恢復(fù)腦神經(jīng)的正常功能。毛冬青具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效，研究表明毛冬青對腦血管具有一定的擴(kuò)張作用，這對促進(jìn)腦循環(huán)、調(diào)整腦血流量、防治腦血管疾病具有一定幫助[9]。冬青總黃酮、總皂苷都是從冬青屬植物毛冬青的干燥根中提取出來的有效成分之一，前期研究已對毛冬青總皂苷摸索出比較成熟的提取工藝[10]。

表2 各組小鼠腦海馬區(qū)與皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化結(jié)果

注：“-”：神經(jīng)細(xì)胞基本正常；“+”：少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)輕度萎縮；“++”：部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)中度萎縮伴少數(shù)細(xì)胞輕度水腫；“+++”：全部神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)重度萎縮或伴部分細(xì)胞中度水腫

腦缺血時，細(xì)胞膜去極化引起Ca2+內(nèi)流，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+超載又會激活磷脂酶A2，使膜磷脂降解，膜磷脂降解可引起ATP酶活性降低。缺血所誘導(dǎo)的iNOS蛋白及mRAN上調(diào)，導(dǎo)致iNOS活力增強(qiáng)及NO生成增多。在腦缺血的晚期，NO對血管不再具有保護(hù)效應(yīng)，相反iNOS所生成的絕大多數(shù)NO在這個時期被認(rèn)為具有神經(jīng)毒性[11]。用藥物阻斷iNOS能減少30%的梗死體積；iNOS基因敲除大鼠同野生大鼠比較，其梗死體積較少，神經(jīng)功能預(yù)后較好。

本實驗結(jié)果表明，小鼠腦缺血再灌注模型復(fù)制成功，毛冬青總皂苷可顯著降低腦勻漿中的NO水平和NOS活力，升高腦勻漿中ATP酶活力，并顯著減輕腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，均以大劑量、中劑量為優(yōu)。提示毛冬青總皂苷可通過抑制缺血后炎癥反應(yīng)，改善炎癥引起的一系列級聯(lián)反應(yīng)介質(zhì)和細(xì)胞因子，減少腦缺血再灌注損傷后因氧供需失衡和糖代謝紊亂引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腦缺血損傷的作用。

[1] 呂一燕.毛冬青的臨床應(yīng)用研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2015(7):148- 149.

[2] FEIGIN VL, FOROUZANFAR MH, KRISHNAMURTHI R, MENSAH GA,et al.Global and regional burden of stroke during 1990- 2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J].Lancet， 2014,383(9913):245- 254.

[3] 樓敏.缺血性卒中患者的溶栓治療:問題和對策[J].浙江大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2014,43(1):1- 6.

[4] 劉釗,鐘菊迎,高爾寧,等.中醫(yī)藥治療腦缺血再灌注損傷方劑用藥規(guī)律分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(20):226- 229.

[5] 胡國恒,祝美珍.活血化瘀法防治腦缺血損傷的理論探討[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學(xué)報)，2008,23 (6):513- 515.

[6] 唐旭洪,蘇春壽,祝美珍.滋陰活血法防治缺血性中風(fēng)芻議[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志 ,2012,18(9):1003- 1004.

[7] 李澎濤,王永炎,黃啟福,等.“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說的形成及其理論與實踐意義[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2001,24 (1):1- 6.16.

[8] 韓經(jīng)丹,王玨,富蘇,等.“毒損腦絡(luò)”與腦缺血- 再灌注損傷病機(jī)關(guān)系探討[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2012,18(8):823,829.

[9] 熊友香,李昶,羅憲堂,等.毛冬青的化學(xué)成分、藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材,2002,25(5):371- 374.

[10] 徐艷華,苗明三,高聰聰,等.毛冬青有效部位中總皂苷的含量測定[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2011,9(6):144- 145.

[11] BONNIN P, LEGER PL, VILLAPOL S,et al. Dual action of NO synthases on blood flow and infarct volume consecutive to neonatal focal cerebral ischemia[J].Exp Neurol, 2012,236(1):50- 57.

Effect of Total Saponins of Mao Dong Qing On Cerebral Ischemia Reperfusion Model in Mice

CAO Li- hua， LIU Rui- li, MIAO Ming- San△

(Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China)

Objective:To explore the action characters of total Saponin from Radix Ilex Pubescens on Cerebral Ischemia- reperfusion injury and its mechanism. Methods: The mice were randomly divided into 7 groups, The sham operation group, Model group, Nimodipine group, Ginaton group, Large, medium and small dose of total Saponin from Radix Ilex Pubescens. Firstly by using the method of blocking the bilateral common carotid artery(CCA)10 minutes,restore perfusion 10 minutes,and then Bilateral carotid artery occlusion 10 minutes.After the last administration and then reperfusion 24 hours.To discuss the protection of saponin from Radix Ilex Pubescens for Cerebral Ischemia- reperfusion injury. The activity of nitricoxide synthase(NOS)and the level of nitrogen monoxidum (NO),the content of SOD and MDA. The morphological changes of brain tissue were observed. Results:The models with cerebral ischemia- reperfusion injury in mice were copied successfully, The activity of NOS and the content of NO were increased significantly and the ATP were lowerd significantly of the animals brain in surgical model, Reduce nerve cell injury histopathology.The better group is high dose and medium dose. Conclusion:The Saponin of Radix Ilex Pubescentis show protective effect on improving cerebral ischemic conditions of Cerebral Ischemia- reperfusion mice.

Saponin of Radix Ilex Pubescentis; Cerebral Ischemia reperfusion; nerve cell

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX09103- 324)；河南省優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(TCJ2014- 391)；鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(131PCXTD612)

曹利華(1989-)，女，河南商丘人，醫(yī)學(xué)博士，從事分子藥理學(xué)研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0928- 03

2017- 01- 23

△通訊作者：苗明三，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥藥理教學(xué)與研究，E- mail:miaomingsan@163.com。