王昊澤+王秀利

摘 要：DNA甲基化是真核生物基因表達調控的重要的一種表觀遺傳機制。近年來，隨著對水產養(yǎng)殖動物各領域研究的不斷深入，DNA甲基化在水產養(yǎng)種動物遺傳育種的領域引起了廣泛的關注，取得了一些進展。本文簡要介紹了DNA甲基化和其檢測技術，并從魚類、貝類、棘皮動物三個方面分別介紹了該技術在這三類動物上的研究進展，為今后水產養(yǎng)殖動物的表觀遺傳學研究提供參考。

關鍵詞：DNA甲基化；水產動物；研究進展

DNA甲基化（DNA methylation）又稱DNA的共價修飾，是重要的表觀遺傳（epigenetics inheritance）現(xiàn)象之一。表觀遺傳是指在不改變DNA序列的前提下，產生可遺傳的核酸序列修飾，并得到不同的表現(xiàn)型。其中DNA甲基化對基因的表達有重要的調控作用，例如：DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去DNA甲基化則誘導了基因的重新活化和表達；DNA甲基化還能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達[1]。

有研究證實，在發(fā)生人癌變的細胞內腫瘤細胞中癌基因DNA甲基化水平降低；抑癌基因的甲基化水平高；加之錯配修復基因表達缺陷的原因不僅有基因突變，其基因啟動區(qū)也呈高甲基化水平[2]。在動植物研究方面越來越多的實驗表明，DNA甲基化在動物、植物的生長發(fā)育中起著舉足輕重的作用。通過對植物和哺乳動物DNA甲基化的比較分析，有助于我們了解RNA引導的DNA甲基化機制。在哺乳動物中，全基因組DNA甲基化和去甲基化發(fā)生在配子形成和早期胚胎發(fā)育[3]。這些過程可能涉及多個DNA甲基化或去甲基化機制。

1 DNA甲基化與檢測技術

表觀遺傳學中研究最清楚、最重要的修飾形式就是DNA甲基化。它在細胞發(fā)育和運行正常功能過程中起著很多關鍵作用，包括基因表達調控、胚胎發(fā)育、基因組印記和染色體穩(wěn)定性等[4] （圖1）。

DNA甲基化的含義即在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，常見于基因的5'-CG-3'序列。大多數(shù)脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非編碼區(qū)，并成簇存在。

DNA甲基化具有自我永續(xù)結構（圖2），其特點為甲基化等位基因復制產生的半甲基化子鏈，它通過組成活性甲基化酶恢復其甲基化活性狀態(tài)。

DNA甲基化的檢測技術大致可以分為兩類：特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析，后者也稱為甲基化圖譜分析（methylation profiling）。特異位點的甲基化檢測有以下幾種重要方法：（1）甲基化特異性PCR（MS-PCR）；（2）亞硫酸氫鹽處理+測序；（3）聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法（COBRA）；（4）熒光定量法（Methylight）；（5）甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析；（6）焦磷酸測序?；谛酒募谆瘓D譜分析一般使用的芯片有安捷倫的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip Human Tiling 2.0R Array Set。[5]還有利用將傳統(tǒng)的甲基化工具（如DNA的亞硫酸氫鹽轉化）與目標基因組捕獲技術和高通量測序相結合，繪制出甲基化圖譜的研究方法[6]。此外MassARRAY EpiTYPERTMDNA 甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和 MALDI-TOF 檢測原理，可實現(xiàn)多重CpG的分析檢測，這種方法被稱為飛行質譜[7]。

2 甲基化在養(yǎng)殖魚類上的應用

種群的性別決定機制決定其性別比例，是其穩(wěn)定性的一個重要的種群參數(shù)[8]。魚是變溫（冷血）動物，其胚胎發(fā)育受物理環(huán)境的影響較大。對于某些魚類物種，有越來越多的證據(jù)表明，溫度影響性別決定[9]。有13科60多種不同的魚類屬于溫度依賴型性別決定（Temperature-dependent sex determination，TSD）[10-11]。TSD是在基因型性別決定（Genotypic sex determination，GSD）的基礎上，通過溫度效應（Temperature effects，TE）實現(xiàn)的[12]。溫度對魚類性別具體的影響機制大體可分為這幾個方面：主要調控性別的基因[13]、睪丸決定基因[14]、卵巢決定基因[15]、皮質醇介導調控途徑[16]和表觀遺傳調控途徑[17]。

在這里我們著重介紹在溫度調控下的DNA甲基化對魚類性別的影響。

溫度的變化對歐洲海鱸魚性別比例有較大影響。歐洲海鱸魚為雌雄異體，一種典型的溫度依賴型性別決定（TSD）和基因型性別決定（GSD）結合決定的[8]。雖然明確了歐洲海鱸魚的性別決定機制為TSD和GSD結合型，但性別比例和溫度的相互關系及其機制仍然令人費解。科學家Laia Navarro-Martín等（2011）[18]利用歐洲海鱸魚為實驗樣本，驗證他們提出的假設：“存在一個表觀遺傳機制激活溫度，可能導致性腺發(fā)育的啟動子的DNA甲基化水平不同，反過來又會影響基因的表達–雌激素的合成，因此性別比例受到影響。實驗結果表明：（1）歐洲鱸魚性腺發(fā)育基因（CYP19A）啟動子的甲基化水平受性別和在生命早期經歷的溫度的影響；（2）歐洲海鱸魚在早期生活中經歷的高溫能夠使群體雄性增多，其原因是高溫降低了CYP19A mRNA在雌性生殖腺的表達水平；（3）外源性雌激素的攝入并沒有改變海鱸魚的CYP19A啟動子甲基化水平；（4）在海鱸CYP19A啟動子特異性CpG序列的甲基化水平由性別和溫度決定。對歐洲海鱸魚的研究還發(fā)現(xiàn)溫度與多個性別決定基因的遺傳貢獻是相同的[19-20]。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國渤、黃海的地方性名貴魚種，由于過度捕撈和生境變化，資源量嚴重衰竭，加之獨特的生殖習性（雌雄型體差異懸殊和性比變化幅度較大），其種質資源現(xiàn)狀及其可持續(xù)利用令人堪憂[21]。因為半滑舌鰨雌雄個體生長差異懸殊，由于性逆轉而造成的其群體中雌性比例過低大大制約了養(yǎng)殖效率[22]。在養(yǎng)殖技術研究過程中，Chen等（2012）[23]發(fā)現(xiàn)，利用人工雌核發(fā)育創(chuàng)制的超雌個體可能只能存活到肌節(jié)期和出膜前期。 研究人員Shad CW等（2014）[24]通過大量家系性別比例檢測以及 DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)偽雄魚的染色體的DNA甲基化修飾模式與其后代一致。說明DNA甲基化模式被烙印在基因組中，在新世代的發(fā)展過程中沒有被清除和重置，所以它們出現(xiàn)在后代中。李啟業(yè)等人（2013）[25]通過對半滑舌鰨的性腺進行全基因組甲基化比較分析，發(fā)現(xiàn)基因型雌魚逆轉為偽雄魚的過程中，性別決定通路中很多基因發(fā)生了甲基化重塑，說明用于GSD過程的遺傳因子通過表觀調控同樣可以用于實現(xiàn)ESD過程。此外，形成偽雄魚中發(fā)生的DNA甲基化改變在它們的雌性后代中維持了下來，而這些后代雌魚在沒有高溫誘導的條件下也能自然轉變?yōu)閭涡埕~。還通過對比較不同性腺的轉錄組，發(fā)現(xiàn)Z染色體上有一個甲基化位點特別富集的區(qū)域在偽雄魚的精巢中發(fā)生基因表達的上調，使表達水平跟正常雄魚的精巢持平，說明這個區(qū)域攜帶了一些對精巢來說功能重要且劑量敏感的基因。相反，W染色體上的雌性特異基因通過甲基化調節(jié)在偽雄魚中被抑制。

孫瑞健等（2012）[26]發(fā)現(xiàn)，大黃魚的肝臟和肌肉脂肪含量、肝臟指數(shù)（HSI）以及內臟指數(shù)（VSI）受到了飼料脂肪水平的顯著影響（P<0.05），在2次/天投喂時，肝臟和肌肉脂肪含量、HSI以及VSI隨飼料脂肪水平的提高而顯著增加（P<0.05）；Liao K等（2015）[27]發(fā)現(xiàn)，膳食脂肪源通過對大黃魚肝部線粒體DNA甲基化的影響，從而轉變大黃魚的線粒體功能，影響其生長發(fā)育。

Jun Xiao等（2012）[28]對紅鯽異源四倍體鯽鯉雜交種（Carassius auratus red var.） 和鯉魚（Cyprinus carpio）進行了DNA甲基化分析。發(fā)現(xiàn)其甲基化修飾水平增加量基于親魚的甲基化基數(shù)；一些調控基因例如Sox9a、 4nAT等發(fā)生了數(shù)量上的變化。這些結果的間接證據(jù)表明，DNA甲基化可能與異源四倍體鯽鯉的表型變異的基因表達相關。

3 甲基化在養(yǎng)殖貝類中的應用

由中國科學院海洋研究所和深圳華大基因研究院領導的一個國際研究小組完成了對太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的測序、組裝與分析，這是第一個測序的軟體動物基因組，將有助于填補我們對于種類豐富而較少研究的軟體動物家族的了解空白[29]。

Wang等（2014）[30]在太平洋牡蠣基因組測序的基礎上，對模式軟體動物的全基因組進行了DNA甲基化分析。他們分析了牡蠣中DNA甲基化的一般特點，用它與其他無脊椎動物已發(fā)表的甲基化組比較，并從其他物種提供的CpG甲基化演變中尋找新的見解。經比較后的結論認為，牡蠣基因組是一個編碼完整的甲基化的工具；牡蠣基因組甲基化水平遠高于昆蟲，但接近其他無脊椎動物；CpG島甲基化的優(yōu)先目標基因起源于真核生物的“祖先”基因而不是古老的基因等。經推測，在真核生物的“祖先”基因中出現(xiàn)新的基因，一起對這些基因的CpG島甲基化形成更復雜的調控機制，這一點在真核生物的起源和發(fā)展方面是很重要的。

利用牡蠣的表觀遺傳學特征研究了無脊椎動物中相關啟動子DNA的甲基化?？茖W家Rivière等（2014）[31]認為，在無脊椎動物的DNA甲基化與轉錄、選擇性剪切和基因組進化有關，但有關記錄和描述在冠輪動物門中少之又少。他認為目前的全基因組研究帶來了無脊椎動物的甲基化組信息的靜態(tài)圖片；研究應該從高通量技術破譯這種DNA甲基化組的動力學及相關功能的影響機制。作為一種模式生物，其基因組廣泛用于研究貝類生物分子生物學機制。從目前已有的研究結果看，功能相關的特定基因甲基化特征，能更好地了解長牡蠣DNA的甲基化作用，可以大大提高我們對無脊椎動物這種表觀遺傳標記的理解。

Olson等（2013）[32]利用全基因組測序詳細描述了雄配子細胞全基因組DNA甲基化譜。他們選用了一個從Thorndyke灣收集的雄性成年牡蠣，在實驗室模擬自然環(huán)境培養(yǎng)六周，取雄配子體組織，用消毒的海水清洗配子后，離心，并立即放在干冰內，然后放在-80℃直到進一步處理雄性配子。提取DNA，建立DNA文庫。最終生成為了表征的雄配子體組織中甲基化分布。分析結果表明：CpG DNA甲基化在生物中無處不在，在無脊椎動物和脊椎動物中的甲基化水平與方式有很大的不同，大多數(shù)無脊椎動物基因組表現(xiàn)出散布區(qū)域的甲基化和非甲基化DNA；有一個相關性高的甲基化實例發(fā)生在牡蠣基因組中，但沒有明確的證據(jù)表明甲基化和功能之間的聯(lián)系；基于RNA-Seq數(shù)據(jù)有可能是DNA甲基化狀態(tài)與太平洋牡蠣基因表達之間的關聯(lián)；有更高比例的CpG島甲基化的啟動子是與基因的高表達有關的。

扇貝（Pectinidae）是我國重要的貝類養(yǎng)殖品種，具有很高的營養(yǎng)價值[33]。Sun等（2014）[34]利用MSAP技術，對扇貝的五個組織（鰓、腎、卵巢、平滑肌和橫紋?。┻M行了基因組范圍的檢測。在同一養(yǎng)殖網(wǎng)箱，選用兩齡的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）個體，共收集6個雌性個體，進行甲基化分析，發(fā)現(xiàn)在不同的組織中檢測到甲基化水平為20.9%～21.7%，并沒有顯著的差異。櫛孔扇貝不同組織中的甲基化變異相對較?。?.74%），而其他生物的變異較大（1.54%～3.81%）（玉米的甲基化水平20.24%～21.78%[35]、雞的甲基化水平為26.1%～29.4%[36]、豬的甲基化水平為50.18%～53.99%[37]），說明在扇貝組織之間甲基化水平可能不發(fā)散。MSAP數(shù)據(jù)結果表明，有64%到71%的未甲基化的epiloci型，53%到57%的hmecgMECG epiloci型和40%到47%的hmeccg epiloci型。DNA甲基化的多樣性是不可能受到環(huán)境影響的，甲基化差異可能與櫛孔扇貝基因組雜合度高有關；甲基化差異可能是由于DNA去甲基化；DNA去甲基化對甲基化模式的塑造起著舉足輕重的作用，其潛在的機制仍不完全清楚。

4 甲基化在棘皮動物（Echinoderm animal）上的應用

國內仿刺參（Apostichopus japonicus）養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大 ，養(yǎng)殖方式多種多樣。然而養(yǎng)殖的過速發(fā)展和不規(guī)范運作也造成了如生態(tài)環(huán)境惡化、病害等諸多問題[38]。仿刺參有夏眠的生活習性。當水溫達20℃時，刺參就會轉移到深海的巖礁縫隙中或潛藏于石底，不吃不動，整個身體收縮變硬如刺球。科學家針對仿刺參夏眠的狀態(tài)，基于熒光標記甲基化敏感擴增多態(tài)性（F-MSAP），對刺參的四種組織進行了甲基化水平分析。Zhao等 （2014）[39]利用刺參夏眠三個不同階段的刺參組織，進行甲基敏感擴增片段多態(tài)性分析（F-MSAP）。使用18對選擇性引物，共擴增出26 963個片段，其中四個仿刺參組織中有9 112個甲基化片段。結果表明，刺參DNA甲基化水平平均33.79%。DNA甲基化的發(fā)生率在非夏眠階段的組織類型不同：小腸（30.16%）、呼吸樹（27.61%）、肌肉（27.94%）和體壁（56.25%）。研究結果表明，DNA甲基化伴隨著刺參深度夏眠，可能在深度夏眠期間是調節(jié)全局轉錄抑制的一個重要的角色。進一步分析表明，DNA修飾位點主要集中在腸和呼吸樹組織，在深度夏眠階段全甲基化比半甲基化水平顯著增加。

海膽（Sea urchin）是一種低等的海洋無脊椎動物，屬于棘皮動物門海膽綱。海膽黃為名貴的海產珍品，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值[40]。James等（1979）[41]在研究海膽精子和胚胎5-甲基胞嘧啶的含量時發(fā)現(xiàn)，通過分析高壓色譜柱分離的aminex-10甲酸水解產物，確定海膽精子和胚胎早期卵裂階段的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的DNA之間的比例。他們發(fā)現(xiàn)在胚胎細胞核不同的發(fā)展階段，在DNA的甲基化水平方面找不到任何可測量的變化。還發(fā)現(xiàn)海膽的精子和胚胎細胞核的5-甲基胞嘧啶的甲基化水平含量之間沒有差異。

5 結語

目前，中國水產業(yè)發(fā)展形勢嚴峻。一方面，大量的環(huán)境變遷與生境改變，致使因環(huán)境惡化導致許多水產生物資源量嚴重下降。另一方面，由于養(yǎng)殖業(yè)不健康的快速發(fā)展，致使病害頻發(fā)，種質資源惡化等。而DNA甲基化作為一種相對穩(wěn)定的表觀遺傳修飾，動態(tài)地調節(jié)著細胞、生物體的生命過程，將為水產養(yǎng)殖動物的表觀遺傳學應用于種質改良帶來廣闊的前景。

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