莫海亮　姜佳美　劉暢

[摘要] 目的 探討S1P/S1P1信號通路在糖尿病心肌病大鼠心肌損傷中的作用與機制。 方法 40只SD大鼠分為正常對照組和2型糖尿病心肌病，每組各20只，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導老鼠建立2型DCM模型，STZ處理8周后，給予老鼠S1P1受體激動劑、S1P1受體拮抗劑干預，觀察S1P1受體激動劑、S1P1受體拮抗劑對DCM心肌損傷的影響；HE染色檢測心肌組織病理改變，免疫印跡法檢測心肌組織Sphk1和S1P1的表達，ELISA法檢測組織勻漿液S1P的表達，組織SphK1激酶活性定量檢測試劑盒測定SphK1酶活性。 結果 與正常對照組比較，DCM組大鼠心臟凋亡增多、心肌肥大，同時SphK1及其產物S1P表達增加，S1P1受體下調，S1P1受體拮抗劑干預加重DCM心肌損傷，而S1P1受體激動劑能減輕心肌凋亡、心肌肥大、膠原沉積等。 結論 S1P/S1P1信號通路被抑制可能是DCM心肌損傷的機制之一，調控該通路可能是DCM心肌損傷的防治靶點。

[關鍵詞] 鞘氨醇激酶-1；1-磷酸鞘氨醇；1-磷酸鞘氨醇受體1；糖尿病心肌??；凋亡

[中圖分類號] R587.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-09-04

[Abstract] Objective To investigate the role and mechanism of S1P/S1P1 signaling pathway in cardiac injuries of diabetic cardiomyopathy （DCM） rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into normal control group and diabetic cardiomyopathy （DCM） group with 20 cases in each.They were treated with normal saline and streptozotocin （STZ） respectively.After injection STZ for 8 weeks，diabetic rats were administrated with S1P1 receptor agonists or S1P1 receptor antagonists，and then these effects on cardiac injuries of DCM rats were explored.The pathological changes of myocardial tissue were detected by HE staining.Expressions of sphk1 and S1P1 in heart tissues were tested using Western blotting assay.S1P level in rat hearts tissue homogenate was tested using ELISA kit.SphK1 enzymic activity was measured by tissue SphK1 activity quantity kit. Results Compared with control group，cardiomyocyte apoptosis，left ventricular hypertrophy in diabetic rats were markedly elevated.Meanwhile，sphk1 expression and activity，and S1P1 expression in hearts tissue were upregulated，while S1P1 receptor was dramatically downregulated.However，S1P1 receptor antagonists could exacerbate cardiac injuries，and S1P1 receptor agonists could improve cardiac injuries. Conclusion S1P/S1P1 signaling pathway may contribute to the cardiac injuries of DCM rats，which will be regarded as therapeutic target.

[Key words] Sphingosine kinase；Sphingosine-1-phosphate；Sphingosine-1-phosphate receptor 1；Diabetic cardiomyopathy；Apoptosis

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）

作為糖尿病獨立的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高、危險性大，是嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，尚無有效的治療措施[1-2]。因此，深入闡明DCM的發(fā)病機制并尋找防治DCM的新靶標，從而在尋找及制定更有效的防治方案，已成為當前糖尿病學界和心血管病學界非常迫切的研究課題，且具有十分重要的理論意義與臨床實用價值。近年來，越來越多證據(jù)表明，由鞘氨醇激酶（sphingosine kinase 1，SphK1）催化生成磷酸鞘氨醇（phingosine-1-phosphate，S1P），與S1P受體結合發(fā)揮功能在心血管疾病中的作用非常重要[3-4]。為此本研究首先觀察STZ誘導的DCM大鼠心肌損傷及S1P/S1P1信號通路的變化，繼而采用藥物抑制劑干預探討S1P/S1P1信號通路在DCM心肌細胞損傷中的作用及機制。本研究有助于深入闡明DCM心肌損傷機制以及為防治DCM心肌損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重為（120±20）g的健康雄性SD大鼠40只（SPF級）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于廣東醫(yī)學院實驗動物中心（溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%，空氣潔凈度10000級，落菌數(shù)≤3個/皿），換氣頻率為10～15次/h，所有動物均喂以標準飼料，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物環(huán)境設施要求。

1.2 材料

鏈脲佐菌素、S1P1受體激動劑、S1P1受體拮抗劑購自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購美國Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco BRL公司；Cell counter kit-8細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自日本Dojindo Lab公司；抗sphk1抗體和抗S1P1抗體購自Cell Signaling technology公司；組織SphK1激酶活性定量檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；組織SIP的ELISA測定試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.3 DCM大鼠模型建立

常規(guī)全價營養(yǎng)飼料（SPF級）適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為正常飲食的對照組（10只）和高糖高脂飲食的高脂組（50只），分別飼養(yǎng)30天后，空腹16～18h，高脂組給予一次性腹腔注射STZ（30mg/kg），正常組給予同等劑量構機酸鋼緩沖液腹腔注射。腹腔注射STZ一天后，大鼠出現(xiàn)多飲、多尿等糖尿病癥狀，再繼續(xù)給予高糖高脂喂養(yǎng)1周后，使用ONE TOUCH測定血糖值，以72h后連續(xù)連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/L者，定義為糖尿病大鼠模型。另外，糖尿病組大鼠再根據(jù)是否給予藥物干預分為模型對照組、S1P1受體激動劑組、S1P1受體拮抗劑組、吡格列酮組5mg/（kg·d），每組10只。藥物干預自糖尿病建模成功后給予，灌胃給藥6天，一直到實驗結束，干預時間總計為8周。實驗結束時禁食12h，禁食期間，大鼠保持正常的飲水，麻醉后，腹主動脈采血后迅速取出心臟，分別留取新鮮冰凍的組織和用固定液固定的組織用于檢測相關指標，其中糖尿病模型組大鼠心肌組織形態(tài)學異常改變確認為DCM建模成功。

1.4 HE染色光鏡檢測心肌組織結構改變

將收集的各組大鼠心臟組織的相同部位于10%中性福爾馬林液浸泡固定、脫水、石蠟包埋并切成4?m厚的切片，做HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組織結構變化和脂質沉積程度，透射電鏡觀察大鼠心肌細胞超微結構，每張切片觀察10個視野。

1.5 Western blot法測定心肌Sphk1和S1P1蛋白的表達

留取部分心肌組織迅速裝入凍存管放入液氮中速凍，后轉移到 -80 ℃保存，供免疫印跡蛋白測定；將H9c2心肌細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至70%～80%時，各組給予不同的處理因素后，預冷的PBS洗滌細胞3次，濾干水分，每孔加入裂解液100?L，冰上裂解30min后，收集液體，12000r/min離心10min，取上清于-20℃保存，BCA檢測總蛋白濃度。各組等質量蛋白經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離后，轉移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫封閉非特異性條帶2h，隨后4℃孵育抗Sphk1抗體（1：1000）和抗S1P1抗體（1：1 000）過夜，然后用TBST洗滌3次，5min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。重復5次。

1.6 統(tǒng)計學處理

使用SPSS19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫和進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（）表示，組間兩兩比較主要采用單因素方差分析（one-way ANOVA，LSD-t法）進行，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DCM大鼠心肌組織S1P/S1P1通路中S1P水平變化

為觀察S1P/S1P1通路在糖尿病大鼠心臟損傷中的變化，采用ELISA試劑盒測定STZ誘導的糖尿病大鼠血漿與心肌組織S1P的水平。與正常對照組比較，DCM大鼠血漿與心肌組織S1P水平均顯著升高（682.78±70.65）vs（973.17±168.90），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；（698.43±42.19）vs（2001.82±234.17），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.2 DCM大鼠心肌組織S1P/S1P1通路中SphK1表達和酶活性以及SIP表達變化

與正常對照組大鼠比較，DCM大鼠心肌組織SphK1酶活性明顯升高（3.21±0.34）vs（8.16±1.78），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖2。進一步采用Western blot assay檢測蛋白表達，結果顯示：與正常對照組大鼠比較，sphk1和SIP在DCM大鼠心肌組織的表達都顯著上調（0.58±0.35）vs （1.19±0.42），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；（0.43±0.31）vs（0.95±0.40），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.3 S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌損傷中的作用

為了探討S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌損傷中的具體作用，采用S1P1受體激動劑、S1P1受體拮抗劑干預，觀察對DCM心肌損傷的影響。與正常對照組大鼠比較，DCM組大鼠心肌組織可見心肌細胞肥大、心肌纖維化、心肌細胞灶性壞死、凋亡。S1P1受體激動劑組可減輕上述心肌組織病理損傷，S1P1受體拮抗劑組干預后可以明顯加重糖尿病大鼠心肌組織損傷。見圖3。

3 討論

新近流行病學調查顯示，預計2035年全球將有近5.92億人患糖尿病，其中我國的糖尿病患病人數(shù)將達到1.43億。糖尿病可引起多種并發(fā)癥，對人體危害極大，而糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死因，其病死率是非糖尿病人群的2～3倍[5]。DCM是一種獨立于高血壓、冠心病、原發(fā)性心肌病，其病因和發(fā)病機制復雜，如內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）、脂毒性（lipotoxicity）、糖毒性（glucotoxicity）、氧化應激、心肌細胞凋亡、炎癥反應和間質纖維化及微血管病變等均在其發(fā)病進程中起到非常重要的作用[6]。然而，DCM的分子機制和防御手段以及治療手段還不是很令人滿意[7]。

研究表明，磷酸鞘氨醇（phingosine-1-phosphate，S1P）是細胞膜鞘磷脂的代謝產物，由鞘氨醇激酶（sphingosine kinase 1，SphK 1）催化生成，具有促進細胞存活和抗凋亡作用[8]；S1P可以通過激活S1P受體發(fā)揮生物學作用，S1P受體包括S1P1、S1P2和S1P3三種，在心臟S1P主要通過S1P1受體激活ERK1/2、Akt等下游信號通路，增強細胞抗凋亡能力和細胞的遷移能力[9]；另方面，外源性 S1P或選擇性S1P1受體激動劑（SEW2871）可以提高缺氧心肌細胞的存活率、對抗心肌細胞缺氧、缺血再灌注損傷[10]，對抗心肌細胞性損傷；在S1P受體基因敲除小鼠，冠狀動脈結扎可以引起更為嚴重的心肌梗死[11]；這些研究證實，S1P/S1P1受體信號通路是促進心肌細胞存活和心臟保護的重要通路。而新近研究報道，糖尿病心臟S1P、S1P1受體表達顯著下調，高糖損傷心肌細胞也可以引起S1P、S1P1受體表達降低，使用S1P1受體激動劑可以緩解糖尿病和高糖引起的心肌損傷[12-15]；這些研究與本研究結果均提示心肌細胞S1P/S1P1受體信號通路被抑制是DCM所致心肌損傷的一個關鍵因素，而通過對該通路的選擇性干預或許能作為延緩DCM的進展，進而為DCM提供新的治療措施。

以往研究證實，神經酰胺和S1P共同控制細胞的存活或凋亡。本研究結果顯示，與正常對照組相比較，DCM大鼠心肌組織與血漿S1P的水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），原因與心肌組織SphK1酶的表達與活性升高密切相關；然而，糖尿病環(huán)境下與高糖刺激下心肌細胞損傷原因何在呢？S1P/S1P1信號通路究竟如何變化及其作用尚不清楚。為了明確S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌損傷中的具體作用，采用S1P1受體的激動劑和拮抗劑干預，觀察對DCM心肌損傷的影響；結果顯示，S1P1受體激動劑可減輕DCM心肌組織病理損傷，S1P1受體拮抗劑干預后卻明顯加重糖尿病大鼠心肌組織損傷。進一步驗證了：S1P1受體表達降低引起S1P/S1P1通路缺陷介導了DCM大鼠心肌損傷，通過調控S1P/S1P1通路能防治了DCM大鼠心肌損傷。

綜上所述，本研究首次驗證了S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌損傷中的作用，并且探討S1P/S1P1通路的調控是否可以作為防治DCM的靶標。因此本研究為進一步闡明DCM心肌損傷的分子機制及防治措施，具有重大的臨床現(xiàn)實意義。

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（收稿日期：2017-03-05）