劉晶華，鄒玉，吳鈞，常巍

（1.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650031；3.昆明醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計(jì)教研室，云南 昆明 650000）

臨床研究·論著

沉默中期因子對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

劉晶華1，鄒玉3，吳鈞2，常巍1

（1.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650031；3.昆明醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計(jì)教研室，云南 昆明 650000）

目的 探討中期因子（MDK）在肝細(xì)胞肝癌（HCC）中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。方法 選取2015年1月-2016年10月該院收治的50例肝癌患者組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)染色分析組織中MDK的表達(dá)。利用沉默核糖核酸（siRNA）沉默人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞內(nèi)MDK表達(dá)，分別采用CCK-8、流式細(xì)胞儀及插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿、穿透小室（Transwell）檢測(cè)沉默MDK后HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力變化。結(jié)果 肝癌組織中MDK蛋白的表達(dá)水平較癌旁組織提高（χ2=19.643，P=0.000）；在HepG2細(xì)胞中，沉默MDK的表達(dá)可抑制HepG2細(xì)胞增殖（F=22.204，P=0.037）和侵襲（t=5.611，P=0.008）能力，并提高HepG2細(xì)胞的凋亡比例（t=5.702，P=0.006）。結(jié)論 MDK在肝癌中表達(dá)升高，沉默肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)MDK表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。

中期因子；肝細(xì)胞癌；增殖；凋亡；侵襲

原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞性肝癌和混合性肝癌等多種病理類型[1]。目前，我國(guó)原發(fā)性肝癌的病理類型以肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主[2]。以外科手術(shù)為主，配合介入化療及生物靶向治療的綜合治療方案對(duì)各臨床分期的肝細(xì)胞癌患者均有一定的療效。但總體來(lái)看，患者治療后復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致患者的5年生存率仍然很低[3]。在傳統(tǒng)治療方法漸入瓶頸之時(shí)，尋找新的基因治療靶點(diǎn)有可能為肝細(xì)胞癌的治療打開(kāi)一個(gè)新的思路。

中期因子（midkine，MDK）是一種分泌型肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子。MDK由11號(hào)染色體p11.2位點(diǎn)上的基因編碼，成熟的MDK分子量較小僅為14 kD[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MDK作為腫瘤微環(huán)境中的重要效應(yīng)因子之一，在胃癌[5]及乳腺癌[6]中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲行為均有一定的促進(jìn)作用。然而，MDK在肝細(xì)胞癌中的臨床意義及生物學(xué)功能尚不完全明確。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、CCK-8（cell counting kit-8）、流式細(xì)胞儀及插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿、穿透小室（Transwell）侵襲小室模型，檢測(cè)MDK在HCC組織中的表達(dá)及其對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響，以期為研究MDK在肝癌診治中的價(jià)值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

選取2015年1月-2016年10月本院普通外科收集50例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距切緣＞2 cm）保存。其中，男性37例，女性13例；年齡36～67歲，中位年齡51歲。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所細(xì)胞保種庫(kù)），DMEM（dulbecco's modified eagle medium）（貨號(hào)：11965-084）和胎牛血清（貨號(hào)：16000044）（均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E606335）和Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC/PI雙染法，貨號(hào)：E606336）（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司），Trizol試劑（貨號(hào)：15596026）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)：L3000015）、MDK特異性沉默核糖核酸（silencing ribonucleic acid，siRNA）（貨號(hào)：AM16708）、陰性對(duì)照 siRNA（貨號(hào)：4404021）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（Super Script One-StepRT-PCR System withPlatinum Taq DNA Polymerase，貨號(hào)：10928042）及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 試劑盒 （DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，貨號(hào)：F415L）（購(gòu)自美國(guó)英偉杰公司），MDK抗體（貨號(hào)：ab52637）及β-actin抗體（貨號(hào)：ab8226）（購(gòu)自美國(guó)Abcam公司），電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）試劑盒（貨號(hào)：WBK LS0050）（購(gòu)自美國(guó)密理博公司），8.0μm孔徑Transwell小室（貨號(hào)：#3458）（購(gòu)自美國(guó)康寧公司），基質(zhì)膠（貨號(hào)：354230）（購(gòu)自美國(guó)BD公司），MDK及βactin qRT-PCR引物序列（見(jiàn)附表）。

附表 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋的標(biāo)本組織切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟及水化預(yù)處理：用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人MDK多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒(méi)組織標(biāo)本；4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，二氨基聯(lián)苯胺法顯示陽(yáng)性蛋白。400×視野下每張組織切片下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行閱片。若有＞10%的癌細(xì)胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽(yáng)性，否則判定為陰性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 HEPG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2、3代。按過(guò)夜增殖至愈合度達(dá)70%之密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液充分洗滌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：si-MDK組每孔加入100 pmol的MDK siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對(duì)照組每孔加入100 pmol的陰性對(duì)照siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。添加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液至終體積2 ml每孔并培養(yǎng)6 h。移除原有培養(yǎng)基更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR 細(xì)胞總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）經(jīng)由Trizol試劑提取。按逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)。采用2-△△Ct法計(jì)算MDK信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)染72 h后的HEPG2細(xì)胞總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的MDK及肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體，4℃下孵育過(guò)夜。用5%脫脂奶粉溶液按1∶5 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗，室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，ECL法觀察蛋白表達(dá)。

1.2.5 CCK-8檢測(cè) 分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48及72 h后的HepG2細(xì)胞，采用完全培養(yǎng)基重懸后在96孔板內(nèi)以每孔5000個(gè)/100μl均勻接種。過(guò)夜培養(yǎng)后每孔加入10 μl CCK-8溶液避光培養(yǎng)2 h，吸凈上清液，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處每樣本的光密度（optical density，OD）值。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 結(jié)合緩沖液（binding buffer）（1×）重懸轉(zhuǎn)染72 h后的HEPG2細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，取195 μl細(xì)胞懸液加入流式上樣管中，同時(shí)加入5 μl Annexin V-FITC避光反應(yīng)15 min，再次原管重懸細(xì)胞后加入10 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光孵育 15 min，＜1 h 于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染72 h后的HepG2細(xì)胞，采用無(wú)血清DMEM重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為2×105個(gè)/ml，備用。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋基質(zhì)膠，取適量基質(zhì)膠充分包被小室膜上室面。包被好的小室在37℃風(fēng)干1 h后，上室內(nèi)加入100μl細(xì)胞懸液。24孔板內(nèi)每孔加入750μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室妥善放于24孔板中。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后洗凈小室內(nèi)培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定小室膜上細(xì)胞，結(jié)晶紫染色小室膜10 min，PBS沖洗多余染液。棉簽仔細(xì)擦除上室面細(xì)胞，正置顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間非連續(xù)變量資料的比較用χ2檢驗(yàn)，肝癌與癌旁組織的對(duì)比則用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)；組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDK在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

對(duì)50例肝癌及癌旁組織中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，MDK主要于細(xì)胞漿中（見(jiàn)圖1）。有78.00%（39/50）的肝癌組織中MDK蛋白為陽(yáng)性，而僅有34.00%（17/50）的癌旁組織中MDK蛋白陽(yáng)性表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.643，P=0.000）。

2.2 沉默MDK表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響

通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染特異性調(diào)低MDK mRNA（t=11.302，P=0.000）（見(jiàn)圖 2A）及蛋白（t=3.271，P=0.034）（見(jiàn)圖2B）的表達(dá)水平。通過(guò)CCK-8增殖分析檢測(cè)證明，沉默MDK能抑制HepG2細(xì)胞增殖（F=22.204，P=0.037）（見(jiàn)圖2C）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，下調(diào)MDK表達(dá)后，HepG2發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例大幅升高[（23.614±4.331）vs（12.035±1.204），t=5.702，P=0.006]（見(jiàn)圖2D）。采用Transwell檢測(cè)沉默MDK表達(dá)后HepG2細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)MDK的HepG2細(xì)胞侵襲過(guò)基質(zhì)膠的數(shù)目降低，說(shuō)明沉默MDK抑制HepG2的侵襲[（22.547±4.361）vs（11.135±3.204），t=5.611，P=0.008]（見(jiàn)圖2E）。

圖1 MDK蛋白在肝癌組織中的表達(dá) （100 μm）

圖2 沉默MDK表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響

3 討論

MDK高表達(dá)主要出現(xiàn)在胚胎發(fā)育過(guò)程中，而出生后組織內(nèi)的表達(dá)水平十分低[7]。目前在成年機(jī)體內(nèi)，僅腎臟和小腸上皮組織表達(dá)MDK分子[8]。然而，在包括組織缺血[9]、炎癥[10]及腫瘤等[11]許多病理過(guò)程中，MDK常出現(xiàn)表達(dá)增加的情況，且高表達(dá)的MDK分子常與疾病進(jìn)展相關(guān)。由于生理上，MDK具有促進(jìn)生長(zhǎng)及分化調(diào)節(jié)因子，因此在人類胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MDK對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移具有明顯的促進(jìn)作用[12]，而且臨床研究結(jié)果表明MDK是PDAC患者預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

總之，筆者通過(guò)對(duì)50例肝癌患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MDK在肝癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織。目前，入組患者正在接受臨床隨訪，隨訪結(jié)束后筆者將進(jìn)一步根據(jù)患者的生存情況，對(duì)MDK表達(dá)及患者的臨床病理特征進(jìn)行多因素回歸分析，以期進(jìn)一步明確上述因素對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響。在人工調(diào)低MDK在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)后，惡性程度較高的肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲均受抑制而細(xì)胞凋亡卻提高。因而，筆者推斷MDK是一種重要的癌蛋白，在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。但是目前許多分子治療靶點(diǎn)都存在特異性不強(qiáng)、副作用大等缺點(diǎn)。在體內(nèi)，如何靶向下調(diào)肝癌細(xì)胞中MDK的表達(dá)將成為MDK研究的熱點(diǎn)和挑戰(zhàn)之一。

[1]CONG WM,BU H,CHEN J,et al.Practice guidelines for the pathological diagnosis of primary liver cancer:2015 update[J].World Journal of Gastroenterology,2016,22(42):9279-9287.

[2]ZHU Z X,HUANG J W,LIAO M H,et al.Treatment strategy forhepatocellularcarcinomain China:radiofrequencyablation versus liver resection[J].Japanese Journal of Clinical Oncology,2016,46(12):1075-1080.

[3]RODRIGUEZ D N,TORRUELLAS C,CRESS R D,et al.Trends in early-stage hepatocellular carcinoma,California 1988-2010[J].Cancer Causes&Control,2016,27(3):325-331.

[4]YOSHIDA Y,SAKAKIMA H,MATSUDA F,et al.Midkine in repair of the injured nervous system[J].Br J Pharmacol,2014,171(4):924-930.

[5]HU X F,YAO J,GAO S G,et al.Midkine and syndecan-1 levels correlate with the progression of malignant gastric cardiac adenocarcinoma[J].Mol Med Rep,2014,10(3):1409-1415.

[6]?ETIN SORKUN H,AKBULUT M,ENLI Y,et al.Quantitative comparison of immunohistochemical and PCR analysis of midkine expression in breast cancer types and serum midkine level[J].Turk J Med Sci,2016,46(1):219-227.

[7]HUGOSSON F,SJ?GREN C,BIRVE A,et al.The drosophila midkine/pleiotrophin homologues miple1 and miple 2 affect adult lifespan but are dispensable for alk signaling during embryonic gut formation[J].PLoS One,2014,9(11):e112250.

[8]MONMA F,HOZUMI Y,IKEMATSU S,et al.Expression of midkine in normal human skin,dermatitis and neoplasms:association with differentiation of keratinocytes[J].J Dermatol,2013,40(12):980-986.

[9]WANG B Y,LIN P Y,WU S C,et al.Comparison of pathologic stage in patients receiving esophagectomy with and without preoperative chemoradiation therapy for esophageal SCC[J].J Natl Compr Canc Netw,2014,12(12):1697-1705.

[10]WECKBACH L T,GOLA A,WINKELMANN M,et al.The cytokine midkine supports neutrophil trafficking during acute inflammation by promoting adhesion via β2 integrins(CD11/CD18)[J].Blood,2014,123(12):1887-1896.

[11]XU Y Y,MAO X Y,SONG Y X,et al.Midkine confers adriamycin resistance in human gastric cancer cells[J].Tumour Biol,2012,33(5):1543-1548.

[12]RAWNAQ T,DIETRICH L,WOLTERS-EISFELD G,et al.The multifunctional growth factor midkine promotes proliferation and migration in pancreatic cancer[J].Mol Cancer Res,2014,12(5):670-680.

Effect of midkine knockdown for malignant biological feature in human hepatocellular carcinoma

Jing-hua Liu1,Yu Zou3,Jun Wu2,Wei Chang1
(1.Department of Gastroenterology,Second People's Hospital of Yunnan Province,Kunming,Yunnan 650001,China;2.Department of Neurosurgery,Kunming First People's Hospital,Kunming,Yunnan 650031,China;3.Department of Statistics,Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650000,China)

ObjectiveTo study the expression and roles of midkine (MDK)in human hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsA total of 50 HCC tissues and tumor adjacent tissues were collected to detect the expression of MDK by immunohistochemical staining.The expression of MDK in HepG2 cells was silenced by siRNA.Cell proliferation,apoptosis and invasion were detected by CCK-8,flow cytometry and Transwell,respectively.ResultsMDK expression was up-regulated in HCC tissues (P＜0.05).Knockdown MDK in HCC cells was significantly down-regulated cell proliferation,invasion and induced apoptosis.ConclusionsMDK is over-expressed in HCC tissues.Knockdown MDK can inhibit growth and invasion on HepG2 cells.

MDK;hepatocellular carcinoma;proliferation;apoptosis;invasion

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.007

1005-8982（2017）11-0036-05

2017-06-17

常魏，E-mail：1397978466@qq.com