陽華，葉元，肖勝軍，雷小妹，羅小紅

（1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦科，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦科，廣西 桂林 541001；3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 病理科，廣西 桂林 541199；4.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 統(tǒng)計(jì)室，廣西 桂林 541001）

基礎(chǔ)研究·論著

LRIG1在卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞對依托泊苷敏感性中的作用研究*

陽華1，葉元2，肖勝軍3，雷小妹1，羅小紅4

（1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 婦科，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦科，廣西 桂林 541001；3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 病理科，廣西 桂林 541199；4.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 統(tǒng)計(jì)室，廣西 桂林 541001）

目的 探討亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域基因-1（LRIG1）在卵巢漿液性囊腺癌（SKOV3）細(xì)胞株中對依托泊苷敏感性的可能機(jī)制。方法 噻唑藍(lán)比色法（MMT）檢測不同濃度VP16干預(yù)下48 h的SKOV3細(xì)胞組、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞組、SKOV3/VP16細(xì)胞組和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞組的增殖。平板克隆檢測細(xì)胞增殖，流式檢測細(xì)胞凋亡情況，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測LRIG1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 半抑制濃度（IC50）分別為62.90、115.49、156.50和195.42μg/L，siRNALRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16的耐藥指數(shù)分別為1.8、2.5和3.1。SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞組的克隆率（F=39.338，P=0.000），細(xì)胞的LRIG1 mRNA（F=63.095，P=0.000）和凋亡細(xì)胞（F=230.046，P=0.000）明顯不同，與 SKOV3 比較，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增加（t=0.026、0.0710和0.125，P=0.042、0.000和 0.000），細(xì)胞的 LRIG1 mRNA 降低（t=0.130、0.525和 0.825，均 P=0.000），凋亡細(xì)胞減少（t=12.350、35.506和 44.412，均 P=0.000），與 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染 SKOV3比較，SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增加（t=0.044和0.099，P=0.001和0.000），LRIG1 mRNA降低（t=0.395和0.695，均 P=0.000），凋亡細(xì)胞減少（t=23.156 和 32063，均 P＜0.05），與 SKOV3/VP16 比較，siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增加（t=0.055，P=0.000），細(xì)胞的 LRIG1 mRNA降低（t=0.300，P=0.000），凋亡細(xì)胞減少（t=8.906，P=0.000）。結(jié)論 LRIG1 mRNA影響SKOV3細(xì)胞對藥物的敏感性，沉默LRIG1的耐藥細(xì)胞可抑制SKOV3細(xì)胞凋亡。

卵巢癌；耐藥；亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域基因-1

當(dāng)今，卵巢癌的發(fā)生率已經(jīng)呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，成為危害女性的重要?dú)⑹?，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，卵巢腫瘤中的卵巢上皮癌的死亡為女性各種腫瘤死亡之首，可見卵巢腫瘤已嚴(yán)重危害女性生命健康。隨著化療藥物使用的增加，卵巢癌細(xì)胞的耐藥性也逐漸受到了人們的關(guān)注。富含亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域基因 -1（leucine-rich repeats and immunoglobulinlike domains-1，LRIG-1）及其家族分子LRIG-2和LRIG-3是一類新興的腫瘤抑制分子，在多種惡性腫瘤如乳腺癌[1-2]、子宮頸癌[3-5]、頭部和頸部癌[6-8]、膠質(zhì)瘤[9-10]、前列腺癌[11]與皮膚鱗狀細(xì)胞癌等[12]均有異常表達(dá)，與腫瘤的形成及多藥耐藥密切相關(guān)。近年來，RNAi技術(shù)的出現(xiàn)，給人類治療癌癥帶來巨大福音，可用來研究與癌癥相關(guān)基因的變化機(jī)制，成為可代替臨床治療，改變多藥耐藥機(jī)制的一種新方法。雙鏈核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）經(jīng)酶切后會形成很多小片段，稱為小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）。siRNA 與信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）中的同源序列發(fā)生互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA失去功能，不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，使基因“沉默”。本研究中LRIG-1是治療卵巢腫瘤的新靶點(diǎn)，在多種癌癥中的siRNA沉默LRIG-1將為一種新的高選擇性LRIGs開發(fā)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討LRIG-1分子在卵巢癌及其耐藥細(xì)胞株中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

卵巢漿液性囊腺癌（SKOV3）細(xì)胞株（北京大學(xué)人民醫(yī)院），依托泊苷（VP16）（江蘇省連云港市恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），SKOV3/VP16（選取SKOV3以濃度為300μg/ml的VP16反復(fù)大劑量沖擊用藥，培養(yǎng)8個(gè)月建立VP16耐藥細(xì)胞株，反復(fù)傳代＞3個(gè)月），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國 Thermo Fisher Scientific公司，No：10099-141），高糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（美國Hyclone公司，No：SH30022.01B），青鏈霉素、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）及CCK-8試劑盒 （cell counting Kit-8）（日本 Dojindo，No：CK04），LipofectamineTM2000（美國 Thermo Fisher Scientific 公司，No：52887），Annexin V/PI apoptosis kit（浙江省杭州市聯(lián)科生物公司，AP101），結(jié)晶紫染色液（自配），Trizol（日本TaKaRa株式會社），焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（美國 Sigma公司），聚合酶鏈反應(yīng)儀（丹麥DBI公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI公司），RNasin（美國 Promega公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)（日本Shimodzu公司），SCR20B型冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司），低溫高速離心機(jī)（德國Hermle公司），凝膠掃描系統(tǒng)（德國UVP公司），Stratagene Mx 3000P Quantitative RealTime PCR設(shè)備（美國Agilent公司），ABI9700PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司），超凈工作臺（江蘇省蘇州凈化設(shè)備公司），Anke/飛鴿TDL-80-2B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），倒置顯微鏡（德國Motic公司），INC108型二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Memmert公司），流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BD，F(xiàn)ACS Calibur Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 SKOV3和SKOV3/VP16細(xì)胞培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

將SKOV3和SKOV3/VP16細(xì)胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%的FBS及青霉素、鏈霉素的MEM（minimum essential medium）培養(yǎng)基中，在 37℃、5%CO2、恒溫、飽和濕度條件下培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，取出40 μl單細(xì)胞懸液，40 μl臺盼藍(lán)試劑吹打均勻，放置5 min，取20 μl計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板一共16個(gè)小格，合成4個(gè)大格，活細(xì)胞清晰可現(xiàn)，其中SKOV3呈梭型，SKOV3/VP16呈不規(guī)則多邊形，算出4大格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)。

1.4 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3和SKOV3/VP16細(xì)胞

①轉(zhuǎn)染前1天，分別將100μl含有1×104個(gè)的SKOV3和SKOV3/VP16細(xì)胞加入培養(yǎng)基6孔內(nèi)，令轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞密度達(dá)到至少50%；②在25 μl的DMEM無血清無抗生素培養(yǎng)基中加入siRNA LRIG1/sh LRIG1，混勻；③在 25 μl的 DMEM 無血清無抗生素培養(yǎng)基中加入LipofectamineTM2000，混勻，室溫放置5 min；④將稀釋好的siRNA LRIG1/sh LRIG1和LipofectamineTM2000試劑混合，室溫放置20 min，將50μl混合液放入內(nèi)含50μl培養(yǎng)基和細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)，搖晃培養(yǎng)板；⑤把細(xì)胞培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4 h，除去復(fù)合物，更換培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中；⑥轉(zhuǎn)染0、24、48和72 h后，吸去培養(yǎng)液，按每1ml完全培養(yǎng)基加入100μl CCK-8混合，每孔加入100μl CCK-8混合液，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。

1.5 噻唑藍(lán)比色法測定SKOV3細(xì)胞存活率

用96孔板接種細(xì)胞，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后再等待 6 h，加入 VP16，噻唑藍(lán)比色法[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]法檢測 SKOV3細(xì)胞、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞、SKOV3/VP16細(xì)胞和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞在VP16濃度梯度下的存活率，檢測各細(xì)胞在490 nm處的吸光值并計(jì)算其各自的半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）。

1.6 平板克隆形成

將SKOV3細(xì)胞、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞、SKOV3/VP16細(xì)胞和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞每孔200個(gè)/2 ml接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細(xì)胞2次，每個(gè)孔內(nèi)加入無水甲醇，室溫靜置并固定15 min，棄去固定液，加入1%結(jié)晶紫染液1ml，室溫染色15min，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)面積/接種面積（100%）。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測SKOV3細(xì)胞、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞、SKOV3/VP16細(xì)胞和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的LRIG1 mRNA的表達(dá)

1.7.1 RNA提取 ①收集適量細(xì)胞，加入1ml Trizol，震蕩混勻室溫放置5 min；②加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15s，靜置 3min；③4℃、12000r/min 離心 10min，取上清轉(zhuǎn)移到新EP管；④加入等體積異丙醇，混勻，靜置20min；4℃、12000r/min離心10min，棄去上清液；⑤用1 ml 75%DEPC酒精洗滌；⑥4℃、12 000 r/min離心5 min，棄去液體；⑦室溫晾干后，加入30μl DEPC處理過的雙蒸水（distillation-distillation H2O，ddH2O），溶解RNA，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 逆轉(zhuǎn)錄 以1 μg總RNA視為模板，依照使用說明書內(nèi)容，對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加以配置，體系的總含量為20μl。將其合成為DNA第一鏈，依照下述內(nèi)容，全面配置反應(yīng)液：Primer Mix 1.0，RNA 1.0 μg，DEPC 10.0μl，水 1.0μl，共 11 μl。后將其放置到35℃環(huán)境中共計(jì)300 s，急速冷凍。依照以下體系配置出反應(yīng)液：5 RT Buffer 4.0 μl；RT Enzyme Mix 1.0 μl，DEPC 11.0 μl，水 4.0μl，共 20 μl。分別在98℃預(yù)變性10 min和37℃變性60 min，合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）第一鏈，再經(jīng)Sephacryl s2300離心柱離心2 min除去引物等雜質(zhì)，可獲得純凈cDNA分子。

1.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 qRTPCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 20 s，58℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，40 個(gè)循環(huán)，以 GAPDH為內(nèi)參，通過2-△△CT方法進(jìn)行相對定量分析LRIG1 mRNA的相對表達(dá)。GAPDH，正向引物：5'-TGTTCG TCATGGGTGTGAA-3'，反向引物：5'-ATGGCATGGA CTGTGGTCAT-3'。LRIG1 正向引物：5'-GACCCTTTCTGACCGACAA-3'，反向引物：5'-CGCTTTCCACGGC TCTTT-3'。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV3細(xì)胞、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞、SKOV3/VP16細(xì)胞和 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞凋亡

①轉(zhuǎn)染前1天將容量為2.5×105的細(xì)胞接種在2 ml 6孔培養(yǎng)基，確保密度達(dá)到50%～70%；②在250μl的DMEM無血清無抗生素培養(yǎng)基中加入質(zhì)?；騭iRNA，柔和混勻；③在250μl的DMEM無血清無抗生素培養(yǎng)基中加入LipofectamineTM2000，柔和混勻，室溫放置5 min；④將稀釋好的siRNA和LipofectamineTM2000混合，室溫放置20 min，把siRNA/Lipofectamin混合物放到內(nèi)含有細(xì)胞以及培養(yǎng)基的小孔內(nèi)，混合；⑤把細(xì)胞培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4 h，更換完全培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱；⑥轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測；⑦用ddH2O將5×結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）稀釋為 1×Binding Buffer，每0.5 ml 1×Binding Buffer加入5μl Annexin V和10μl PI，配制Annexin V/PI染色工作液；⑧吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔用2 ml PBS輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，吸去PBS，每孔加0.5 ml 0.25%胰酶，孵育，鏡下觀察，當(dāng)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，吸去胰酶，加入2 ml PBS，制成單細(xì)胞懸液，移至流式管，1000r/min離心5min，棄上清液；⑨加入200μl Annexin V/PI染色工作液，重懸細(xì)胞；⑩避光孵育15 mim，上機(jī)檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度VP16干預(yù)SKOV3細(xì)胞的存活情況

VP16干預(yù) SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的存活率及 IC50，0、5、10、20、40、80、100、120、180和 200μg/L的 VP16處理 SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn) 染 SKOV3、SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞48 h的吸光值逐漸降低，呈劑量依 賴 關(guān) 系 ，IC50 分 別 為 62.90、115.49、156.50 和195.42 μg/L，siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的耐藥指數(shù)分別為1.8、2.5和3.1。見附表。

2.2 SKOV3、siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞增殖情況

SKOV3、siRNALRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)，克隆率分別為（0.03±0.02）%、（0.05±0.01）%、（0.10±0.03）%和（0.15±0.04）%，4 組細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.338，P=0.000），與SKOV3比較，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增高（t=0.026，0.070和 0.125，P=0.042、0.000 和0.000），與 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染 SKOV3 比較，SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增高（t=0.044和 0.099，P=0.001和 0.000），與SKOV3/VP16比較，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的克隆率增加（t=0.055，P=0.000）。見圖1。

附表 VP16干預(yù)SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的吸光值 （n=3）

圖1 4組SKOV3/VP16細(xì)胞增殖情況

2.3 SKOV3、siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞中LRIG1 mRNA的表達(dá)

SKOV3、siRNALRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的LRIG1 mRNA 分別為 1.05±0.15、0.93±0.16、0.53±0.09 和0.23±0.04，4組的LRIG1 mRNA表達(dá)有差異（F=63.095，P=0.000），與 SKOV3 比較，siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16 和 siRNA LRIG1 轉(zhuǎn) 染SKOV3/VP16細(xì)胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.130、0.525 和 0.825，均 P=0.000），與 siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染SKOV3比較，SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.395和 0.695，均 P=0.000），與 SKOV3/VP16 比較，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的LRIG1 mRNA降低（t=0.300，P=0.000）。見圖 2。

2.4 SKOV3、siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞凋亡情況

4組的凋亡細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=230.046，P=0.000），與 siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染 SKOV3 比較，SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16的凋亡細(xì)胞減少（t=12.350、35.506和44.412，均P=0.000），與 SKOV3/VP16 比較，siRNA LRIG1 轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16凋亡細(xì)胞減少（t=23.156和32.063，均P=0.000），與 SKOV3/VP16比較，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16 凋亡細(xì)胞減少（t=8.906，P=0.000）。見圖3。

圖2 SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞LRIG1 mRNA表達(dá)

圖3 SKOV3、siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞凋亡比較

3 討論

LRIG1發(fā)現(xiàn)于10多年前，科學(xué)家們開始假設(shè)其是一個(gè)腫瘤抑制基因[12]。一系列實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)都支持這一最初假設(shè)。此后，越來越多的證據(jù)證明，LRIG1可以抑制細(xì)胞的正常增殖和分化。LRIG1的增殖抑制作用在包括人胚胎腎細(xì)胞[14]、前列腺癌細(xì)胞[14]、小鼠成纖維細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞[15-16]、膀胱癌細(xì)胞[17]、乳腺癌細(xì)胞[1，18-19]、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[20-21]、非洲綠猴腎細(xì)胞[21]、鼻咽癌細(xì)胞[7]與肺癌細(xì)胞[22]在內(nèi)一系列組織細(xì)胞。在分子水平上，LRIG1可以負(fù)性調(diào)節(jié)由致癌受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的生長因子信號：LRIG1可誘導(dǎo)表皮生長因子受體（EGFR）家族成員EGFR、ERBB2、ErbB3 和 ErbB4 的泛素化[14-15]，從而破壞MET受體[18]，作用于RET受體并抑制RET和下游信號的磷酸化[23-24]。另一方面，在ErbB2陽性的腫瘤細(xì)胞系中，過表達(dá)ErbB2可以下調(diào)雌激素受體，從而抑制雌激素誘導(dǎo)的LRIG1轉(zhuǎn)錄[1，19]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，LRIG1 mRNA在SKOV3/VP16耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)低于野生型SKOV3細(xì)胞株，使用siRNA沉默的SKOV3和SKOV3/VP16細(xì)胞中的LRIG1 mRNA進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與之相對的，給予不同濃度的VP16，siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞、SKOV3/VP16和 siRNA LRIG1轉(zhuǎn)染SKOV3/VP16細(xì)胞的IC50依次增高，克隆集落刺激增加和凋亡降低。本結(jié)果表明，LRIG1可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，將其沉默后，細(xì)胞增殖能力減弱而凋亡增加。該結(jié)論與既往研究基本吻合，該結(jié)果提示在卵巢癌的治療中，可以通過增強(qiáng)LRIG1蛋白的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高卵巢癌細(xì)胞放化療的敏感性。如臨床應(yīng)用天然化合物藤黃酸可用于抗癌，機(jī)制在于藤黃酸可以通過AMP激酶的活化而上調(diào)LRIG1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制該細(xì)胞的增殖[25]。

結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為，LRIG1影響SKOV3細(xì)胞對藥物的敏感性，呈劑量相關(guān)特點(diǎn)，沉默細(xì)胞中的LRIG1后，可以抑制SKOV3細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞中LRIG1表達(dá)以提高卵巢癌細(xì)胞放化療敏感性。

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Role and mechanism of LRIG1 in SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16*

Hua Yang1,Yuan Ye2,Sheng-jun Xiao3,Xiao-mei Lei1,Xiao-hong Luo4
(1.Department of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541199,China;2.Department of Gynaecology,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541001,China;3.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541199,China;4.Department of Medical Records,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin,Guangxi 541001,China)

ovarian cancer;drug resistance;leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains-1

Q344.14

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.001

1005-8982（2017）11-0001-07

2016-12-15

桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No：20130120-3）

葉元，Tel：13517738776

Abstract:ObjectiveTo investigate the role and possible mechanism of LRIG1 in SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16.MethodsThe cell proliferation of SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 were detected by MMT at different concentrations of VP16,which had been con-cultured for 48 hours.Cell proliferation was detected by plate cloning.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.LRIG1 gene expression was detected by quantitative real-time PCR.ResultsIC50 of SKOV3,siRNALRIG1 KOV3,KOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP1 were 62.90 μg/L,115.49 μg/L,156.50 μg/L and 195.42 μg/L,respectively,with the drug resistance index of 1.8,2.5 and 3.1 respectively.Compared with SKOV3,the cloning rates had increased (the mean differences were 8.000,37.692 and 72.000,P＜0.05),the LRIG1 mRNA (the mean differences were 2.994,88.366 and 279.004,P＜0.05)and apoptotic cells(the mean difference were 48.942,63.485 83.659,P＜0.05)had decreased significantly in siRNALRIG1 KOV3,SKOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 cells.Compared with siRNALRIG1 KOV3,the cloning rates had increased(the mean differences were 25.000 and 58.824,P＜0.05),the LRIG1 mRNA(the mean differences were 47.478 and 180.147,P＜0.05)and apoptotic cells (the mean differences were 53.678 and 42.687,P＜0.05)had decreased in SKOV3/VP16 and siRNALRIG1 KOV3/VP16 cells (P＜0.05).Compared with SKOV3/VP16,the cloning rates had increased (the mean difference was 10.000,P＜0.05),the LRIG1 mRNA (the mean difference was 92.784,P＜0.05)and apoptotic cells (the mean difference was 37.625,P＜0.05)had decreased in siRNA LRIG1 KOV3/VP16 cells(P＜0.05).Conclusions The LRIG1 gene can affect drug sensitivity of SKOV3 for lower LRIG1 could decrease the apoptosis of cells.