孫志鵬，呂偉華，匡友誼，曹頂臣，佟廣香，孫效文，鄭先虎

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

鯉脂肪酸合成酶基因的克隆與表達(dá)分析

孫志鵬，呂偉華，匡友誼，曹頂臣，佟廣香，孫效文，鄭先虎

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

脂肪酸合成酶（FASN）是動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和RACE技術(shù)獲得鯉Cyprinus carpio FASN全長(zhǎng)cDNA序列為8 927bp，開放閱讀框7 533bp，編碼2 511個(gè)氨基酸。FASN蛋白質(zhì)相對(duì)分子量274 145.67D，理論等電點(diǎn)（PI）為6.10。氨基酸同源性分析結(jié)果顯示:鯉FASN基因與其他魚類同源性為75.13%～95.34%，與人同源性為61.81%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：鯉FASN氨基酸序列與金線鲃Sinocyclocheilus grahamia聚為一支，同源性最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)結(jié)果表明：FASN基因鯉腦組織中表達(dá)量最高，肝臟次之，血液中最低。鯉FASN基因的獲得為進(jìn)一步深入研究鯉脂肪酸的合成途徑及脂肪發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

鯉；脂肪酸合成酶；序列分析

脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）可催化乙酰CoA和丙二酸單酰CoA合成軟脂酸[1]。1957年Wakil等[2]在動(dòng)物肝臟勻漿中提純出脂肪酸合成酶系從而提出了這一概念。隨著脂肪沉積的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控逐漸成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[3]，動(dòng)物脂肪酸合成酶的表達(dá)調(diào)控引起了各國(guó)研究者的關(guān)注，逐漸成為研究熱點(diǎn)。

近年來，大量研究初步闡明了脂肪酸合成規(guī)律，在此基礎(chǔ)上從分子生物學(xué)水平探索了脂肪酸合成酶的結(jié)構(gòu)及功能與基因表達(dá)與調(diào)控究[4]。但大多數(shù)研究工作主要集中在哺乳動(dòng)物和家禽中。單體中等[5]發(fā)現(xiàn)，豬從1日齡到28周齡，F(xiàn)ASN基因在腹脂mRNA水平呈逐漸升高的趨勢(shì)且存在顯著差異（P＜0.05）。潘輝等[6]用RT-PCR擴(kuò)增并獲得了卡拉庫爾羊FASN基因的cDNA序列。研究表明，F(xiàn)ASN基因表達(dá)與動(dòng)物體脂水平呈正相關(guān)，可作為脂質(zhì)代謝的候選基因[7，8]。張磊等[9]認(rèn)為，F(xiàn)ASN 基因可以作為鵝肥肝性狀的候選分子標(biāo)記。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的FASN基因研究較少。朱大世等[10]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加魚油和豆油極顯著抑制了草魚Ctenopharyngodon idella FASN基因的表達(dá)（P＜0.01）。牛波等[11]發(fā)現(xiàn)，隨著齊口裂腹魚Schizothorax prenanti Tchang體質(zhì)量的增長(zhǎng)，肝臟及肌肉中的FASN mRNA先增加后降低，肌肉粗脂肪含量與FASNmRNA表達(dá)量呈一定正相關(guān)。施培松等[12]比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN基因mRNA在匙吻鱘Polyodon spathula肝臟中的表達(dá)量最高，腹部脂肪次之，在胃中表達(dá)最低；在鳙Aristichthys noblis咽上器官中表達(dá)最高，腸次之，在鰓中表達(dá)最低。王愛民等[13]克隆了羅非魚Oreochromis niloticusFASN基因部分cDNA序列片段557bp，利用3組不同脂肪含量的等氮飼料喂養(yǎng)羅非魚，飼料脂肪水平對(duì)肝臟中FASN活性無顯著影響（P＞0.05），饑餓再次投喂后6～48h，肝臟中FASN mRNA表達(dá)豐度顯著下降。韓光明等[14]發(fā)現(xiàn)，飼料脂肪水平在1.73%～3.71%范圍內(nèi)，羅非魚肝臟中FASN的活性下降幅度較?。划?dāng)飼料脂肪水平等于或大于9.64%時(shí)，F(xiàn)ASN活性大幅下降，表明飼料中脂肪水平充足時(shí)，F(xiàn)ASN基因的表達(dá)豐度降低，以減少脂肪酸的生物合成。覃川杰等[15]克隆了瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli脂肪酸合成酶部分cDNA序列片段674bp，發(fā)現(xiàn)FASN在肝臟、腸道、腹腔脂肪、心臟組織的表達(dá)水平顯著高于肌肉組織。

中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類鯉Cyprinus carpio L.的FASN基因的核酸序列和作用機(jī)制尚不清楚，相關(guān)的報(bào)道較少。Buchtová等[16]研究證明，不同遺傳群體鯉間的脂肪酸組成不同。劉艷等[17]證明津新鯉Cyprinus carpio var.Jian饑餓后再投喂后，肝胰臟中FASNmRNA表達(dá)豐度先下降后上升，6h最低，隨后開始上升，趨于穩(wěn)定，達(dá)到禁食水平。奧斯卡等[18]發(fā)現(xiàn)，日糧對(duì)鯉FASN基因mRNA表達(dá)沒有顯著影響（P＞0.05）。本研究通過克隆鯉FASN基因全長(zhǎng)cDNA序列，分析其在不同組織的表達(dá)，為進(jìn)一步研究鯉脂肪酸發(fā)生及對(duì)脂肪沉積作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)基地選取5尾體質(zhì)量80～118g的1齡鯉。實(shí)驗(yàn)器材（手術(shù)刀，手術(shù)剪，鑷子）用75%乙醇消毒，取麻醉魚血液、腦、背部肌肉、腸、肝胰臟、腎、心、脾、腹部肌肉和腹部脂肪，做好標(biāo)記后迅速投入液氮冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

使用R Neasy Min Elute Clean up Kit（QIAGEN）試劑盒提取總RNA。取肝臟組織約30μg，加入500μL Buffer RLT，勻漿后，13 000r/min 離心 3min。上清轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入1倍體積70%乙醇，用移液器吹打混勻，轉(zhuǎn)至離心柱中，8 500r/min離心15s，棄收集管液體。加 500μL Buffer RPE，8 500 r/min離心15s，棄收集管液體。加500μL Buffer RPE，8 500r/min離心2min，棄收集管及液體，將離心柱轉(zhuǎn)至新的收集管內(nèi)，8 500r/min離心1min。將離心柱移至1.5mL離心管中，加入30～50μLRNase-Free water，室溫放置 3min，8500r/min 離心 1min。

1.2.2 基因克隆

使用Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)NCBI的斑馬魚等硬骨魚類FASN基因的cDNA序列，選擇保守區(qū)域在鯉轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行序列比對(duì)，獲得鯉FASN基因的部分cDNA序列。設(shè)計(jì)同源簡(jiǎn)并引物（FAS1F1/R1表1），以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,擴(kuò)增目的基因核心片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（康為世紀(jì)）純化，連接到 PMD18-T（TaKaRa）載體，轉(zhuǎn)入 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得FASN基因核心片段序列。根據(jù)核心片段設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物（表 1），GSP1與 NGSP1為 3'端 RACE第一次PCR和巢式 PCR引物；GSP2與 NGSP2為 5'端RACE第一次PCR和巢式PCR引物。利用SMARTerRRACE 5'/3'Kit試劑盒進(jìn)行RACE反應(yīng)。RACE產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化，連接到載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得FASN基因3'端及5'端片段序列。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)、DNAMAN分析和 Staden（1.7）拼接，最終獲得FASN基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

表1 鯉FASN基因克隆及組織表達(dá)引物Tab.1 Primers for cDNA cloning of FASN determining the mRNA level in tissues of common carp Cyprinus carpio

查找并下載GenBank中魚類、人與小鼠（外源）FASN氨基酸序列，用Clusta W軟件比對(duì)多種魚類FASN氨基酸序列，由Modeltes選擇最適模型，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootsrap值1 000次。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)測(cè)序獲得的FASN基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物FASN-F/R。以β-actin和18S為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用One Step SYBRRPrime ScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa）試劑盒，ABI 7500 Real-time PCR定量?jī)x，測(cè)定不同組織FASN基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)?；虮磉_(dá)量用相對(duì)定量方法（2-△△Ct）計(jì)算。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用SPSS17.0中單因素方差分析（one-wayANOVA），差異顯著進(jìn)行Duncan’s多重比較，差異顯著水平為0.05，差異極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因片段cDNA的序列分析

以鯉RNA為模板擴(kuò)增獲得的cDNA全長(zhǎng)8 927bp（KY378913），其中開放閱讀框 7 533bp編碼2 511 個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)（5’-UTR）為 202bp，3’-UTR為 1 192bp，加尾信號(hào)（ATTAA）以及 Poly-A尾（圖1）。通過Expasy的Protparam工具分析，F(xiàn)ASN蛋白質(zhì)相對(duì)分子量274 145.67，理論P(yáng)I值為6.10，亮氨酸Leu（L）的含量最高，為11.2%，不含氨基酸Pyl（O）和Sec（U）。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為270個(gè)，而正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為236個(gè)；理論分子式為C12114H19227N3397O3649S103，總原子數(shù)為38 490個(gè)。其不穩(wěn)定系數(shù)為41.14，說明該蛋白不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為91.91，親水性平均系數(shù)為-0.129（圖 2）。

圖1 FASN基因cDNA全序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and predicted amino acid sequence of FASN in common carp Cyprinus carpio

2.2 氨基酸同源性分析

用Clusta W軟件對(duì)多種魚類FASN氨基酸序列的比對(duì)表明，序列差異主要集中在C-端的多肽序列上，中部區(qū)域同源性較高。由表2可知，鯉FASN與金線鲃FASN的同源性最高為95.34%，與鳙、團(tuán)頭魴、羅非魚的同源性分別為93.39%、93.15%和75.13%。

圖2 鯉FASN的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The secondary structure of FASN protein in common carp Cyprinus carpio

表2 魚類和人、小鼠FASN氨基酸序列比對(duì)表Tab.2 Alignment matrix showing the results of pair-wise comparison on the identities and divergence of the amino acids sequences of FASN in fish,mouse and human

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

基于13種魚類包括金線鲃、鳙、團(tuán)頭魴、羅非魚、虹鱒 Oncorhynchus mykiss、斑馬魚 Danio rerio、斑點(diǎn)叉尾鮰Ctalurus punctatus、鱸Lates calcarifer、雀鱔 Lepisosteus oculatus、青鳉 Oryzias latipes、大西洋鮭Salmo salar、綠河豚Tetraodon nigroviridis和人及大鼠（外群）FASN的氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。圖3可知，鯉與金線鲃脂肪酸合成酶的進(jìn)化關(guān)系最近，這與其氨基酸同源性的分析結(jié)果相符合。

圖3 FASN氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on FASN amino acid sequences

2.4 FASN基因在鯉各組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示（圖4），鯉FASN基因在所有檢測(cè)組織中均有表達(dá)，在腦中表達(dá)量最高，其次是心、脾、腎、肝、脂肪組織（脂肪）、背部肌肉（背?。?、腸、腹部肌肉（腹?。?、血液。腦中的表達(dá)量極顯著高于其他9種組織（P＜0.01），血液中表達(dá)最低。背肌和腹肌中表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 FASN基因在鯉不同組織中的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative expression of FASN gene in different tissues of common carp Cyprinus carpio

3 討論

本研究中，鯉FASN基因cDNA全長(zhǎng)8 927bp，編碼2 511個(gè)氨基酸與鳙（編碼2 514個(gè)氨基酸）、金線鲃（編碼2 514個(gè)氨基酸）、羅非魚（編碼2 510個(gè)氨基酸）基本一致，可判斷其cDNA的完整性。經(jīng)預(yù)測(cè)，F(xiàn)ASN蛋白屬于親水性蛋白,相對(duì)分子量274 145.67D，理論P(yáng)I值為6.10，與陳斯鈺等[19]研究的赤點(diǎn)石斑魚Epinephelus akaara FASN蛋白分子量為274.03KD、理論P(yáng)I值為5.8的結(jié)論相一致。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鯉與鳙、金線鲃等魚類同源性很高，表明FASN基因相對(duì)保守，可用于生物進(jìn)化研究。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，雜食性淡水魚與草食性魚類進(jìn)化關(guān)系較近，海水魚與肉食性魚類進(jìn)化關(guān)系較近，與吳景等[20]分析脂肪酸延長(zhǎng)酶進(jìn)化所得到的結(jié)果一致。由此可見，脂肪酸合成酶的系統(tǒng)進(jìn)化與魚類的生活環(huán)境和食性密切相關(guān)。

本文中實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)得出FASN基因在腦組織中表達(dá)量最高，肝胰臟和背部肌肉中表達(dá)量無顯著性差異。而韓光明等[14]發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚各組織中FASNmRNA在肝臟中表達(dá)量最高，覃川杰等[15]發(fā)現(xiàn)瓦氏黃顙各組織中FASNmRNA在腸中表達(dá)量最高，肝臟中表達(dá)量明顯高于肌肉（P＜0.05）。這可能是因?yàn)轷幣c吉富羅非魚和黃顙魚脂肪蓄積模式不同，也可能與食性有關(guān)。奧斯卡等[18]在研究日糧對(duì)鯉脂肪酸合成酶的影響，得出FASNmRNA在不同組織中表達(dá)量高低依次為肝組織、腦組織、肌肉。劉艷等[17]發(fā)現(xiàn)，津新鯉FASN mRNA在肝胰臟及腎臟表達(dá)豐度明顯高于腦中，與本研究結(jié)果有差異，這可能是實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法間存在一定的誤差造成。本研究主要集中在FASN基因的克隆和表達(dá)模式，對(duì)其功能研究還不夠深入，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。

大多數(shù)魚類在饑餓狀態(tài)下優(yōu)先動(dòng)用脂肪作為能量來源[21,22]。魚類對(duì)脂肪的利用過程主要包括：脂肪的合成、分解與轉(zhuǎn)運(yùn)。脂肪酸合成酶的作用是合成脂肪酸以儲(chǔ)存能量，是脂肪合成的關(guān)鍵酶。FASN基因的表達(dá)直接影響脂肪酸合成酶的多寡，F(xiàn)ASN酶活力高時(shí)，丙二醛CoA源源不斷地被催化成脂肪酸，魚體內(nèi)多余的脂肪酸能夠通過酯化作用形成脂肪[23]。這與Semenkovich[24]發(fā)現(xiàn)機(jī)體組織中FASN表達(dá)水平的升高會(huì)顯著增加甘油三酯在體內(nèi)的沉積的結(jié)果相一致。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是脂肪分解與轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶。它通常以同源二聚體的形式發(fā)揮甘油三酯水解酶和在受體介導(dǎo)的脂蛋白攝入時(shí)作為配體或橋接因子的雙重功能[25]。夏曉杰等[26]發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚FASN mRNA與LPL mRNA表達(dá)水平呈一定正相關(guān)，初步推斷脂肪酸合成酶和脂蛋白酯酶基因表達(dá)共同影響肌間脂肪的沉積。然而脂肪性狀是一個(gè)由多個(gè)基因控制的形狀，單純孤立研究某一個(gè)或兩個(gè)基因是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，要研究魚類的脂肪性狀，需要更多地發(fā)掘魚類的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的差異，要從整體上把握這些基因在控制魚類脂肪性狀上的相關(guān)性，清楚地了解魚類脂肪性狀的控制機(jī)制。研究這些脂肪性狀相關(guān)基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)迫在眉睫。

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Cloning and Expression of Fatty Acid Synthase Gene in Common Carp Cyprinus carpio

SUN Zhi-peng,LV Wei-hua,KUANG You-yi,CAO Ding-chen,TONG Guang-xiang,SUN Xiao-wen,ZHENG Xian-hu
（National Local Joint Engineering Laboratory for Freshwater Fish Breeding,Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Fatty acid synthase（FASN）as an important enzyme catalyzes the synthesis of fatty acids and the content and activity of FASN have impact on synthesis of fatty acids,fat deposition,and muscle quality.The full-length cDNA of FASN gene was sequenced from common carp Cyprinus carpio by RT-PCR and RACE methods.Full length of the FASN cDNA was found to be 8 927 bp,and open reading frame（ORF）of 7 533 bp encoding 247 amino acids,and the FASN protein had relative molecular weight of 274 145.67 D,and theoretical PI value of 6.10,with fat coefficient of 91.91.The protein shares 75.13%～95.34%sequence identity with other fish,and 61.81%identity with human Homo sapiens.The phylogenetic tree revealed that it clustered closely with herbivorous and omnivorous freshwater fish,most similar to fish Sinocyclocheilus grahamia.The real-time quantitative PCR revealed that FASN gene was expressed maximally in brain,followed by liver and the minimal in blood.These findings will assist in further understanding of the biosynthesis of FASN in common carp,and enable the methods to be developed for enhancing its production.

Cyprinus carpio;fatty acid synthase;sequence analysis

S917

A

1005-3832（2017）04-0001-06

2017-02-26

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2015C04XK01）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31302174）.

孫志鵬（1991-）男，研習(xí)員，從事魚類遺傳育種與繁殖研究.E-mail:jiayousunzhipeng@126.com

鄭先虎（1982-），副研究員.E-mail:zhengxianhu@hrfri.ac.cn