杜巖張林祺李金生張濤

納米載銀抗菌凝膠對常見牙周致病菌的體外抑菌作用*

杜巖張林祺李金生張濤

目的：觀察新型納米載銀抗菌凝膠對常見牙周致病菌的體外抑菌作用。方法：采用瓊脂擴散法觀察新型納米納米載銀抗菌凝膠(實驗組)對牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌、具核梭桿菌、放線伴放線桿菌等的體外抑菌作用，同時分別以鹽酸米諾環(huán)素軟膏和空白載體作為陽性和陰性對照。結果：納米載銀抗菌凝膠對牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌、具核梭桿菌、放線伴放線桿菌的抑菌環(huán)直徑均值分別為：14.4±1.14mm，15.2±0.84mm，14.2±1.10mm，14.8±0.84mm，與鹽酸米諾環(huán)素軟膏相比沒有明顯統(tǒng)計學差異。結論：新型納米載銀抗菌凝膠對常見牙周致病菌在體外有抑菌作用，抑菌效果與鹽酸米諾環(huán)素軟膏類似。

納米載銀抗菌劑；鹽酸米諾環(huán)素；抑菌作用；牙周致病菌

牙周疾病是最常見的口腔疾病[1]。牙周致病菌在一定條件下誘發(fā)牙周疾病。常見的牙周致病菌包括：牙齦卟啉單胞菌(Porphyromanus gingivalis, P.g.)、中間普氏菌(Prevotella intermedia，P.i.)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn).n.)、放線伴放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.a.)等[2]。牙周疾病的治療離不開抗菌制劑，但目前的抗菌制劑多是抗生素，不當使用容易產(chǎn)生耐藥性，本試驗觀察了一種無機抗菌劑(以新型納米載銀抗菌劑制備的凝膠制劑，下稱納米載銀抗菌凝膠[3])對常見牙周致病菌的體外抑菌作用，并與鹽酸米諾環(huán)素軟膏相對比。

1.材料與方法

1.1 納米載銀抗菌凝膠的制備[3]取卡波姆940(南京威爾化工有限公司，批號20160105)1.0 g置適量純化水中充分溶脹，攪勻備用，得溶液A，另取納米載銀抗菌劑(西安康旺抗菌公司，主要成分為載銀磷酸鋯，批號20100103)2g加于純化水，同時滴加乳酸(湖北西銀和生物科技有限公司，批號20160301)，邊加邊攪拌，至無機抗菌劑恰好完全溶解，加入甘油(湖北邁源化工有限公司，20160410)及丙二醇(陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司，20160215)，攪勻，得溶液B。將B液緩緩加人A液中并不斷攪拌，加純化水至100g，用0.1mol/L氫氧化鈉(徐州金川藥用輔料有限公司，20160509)溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5-7.0，繼續(xù)攪拌均勻，得無機抗菌凝膠劑。同時制備不含無菌抗菌劑的空白載體。

1.2 陽性對照組試劑鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派力奧，新時代株式會社，注冊證號：H20100244，批號20160421)?；钚猿煞?0mg/支，占2%。

1.3 抑菌試驗[4,5]

試驗菌株本試驗菌株為國際標準菌株。P.g. (ATCC33277)、P.i.(ATCC25611)、F.n.(ATCC10953)、A.a.(ATCC43718)均購自四川大學華西口腔醫(yī)院國家重點微生物實驗室。

1.3.1 抑菌片的制備取無菌并干燥的濾紙片，制成直徑為5mm，厚不超過4mm圓片，每5片一組。每片滴加實際使用濃度無機抗菌劑溶液(實驗組A組)、鹽酸米諾環(huán)素軟膏溶液(陽性對照B組)或空白載體凝膠液(空白對照C組)20μl，然后將濾紙片平放于清潔的無菌平皿內(nèi)，開蓋置溫箱(37℃)中烤干后備用。

1.3.2 試驗菌的接種將4種試驗菌常規(guī)復蘇，傳代培養(yǎng)，取少量菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)24h，取100μL菌液，用Vitek細菌比濁儀稀釋至濃度106CFU/mL待用。取300μL稀釋菌液于CDC瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板轉(zhuǎn)動60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好培養(yǎng)皿，置室溫干燥5min。

1.3.3 抑菌劑樣片貼放每種細菌培養(yǎng)皿貼放1個染菌平板，平板內(nèi)貼放3片試驗樣片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距20mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好培養(yǎng)皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)16h觀察結果。

1.3.4 用游標卡尺測量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄。試驗重復5次。測量抑菌環(huán)時，應選均勻而完全無菌生長的抑菌環(huán)進行。測量其直徑應以抑菌環(huán)外沿為界。

1.4 結果判定[6]

抑菌環(huán)直徑小于8mm為無抑菌作用，抑菌環(huán)直徑大于等于8mm小于12mm為低度敏感，抑菌環(huán)直徑大于等于12mm小于16mm為中度敏感，抑菌環(huán)直徑大于等于16mm為高度敏感。

1.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，采用方差分析比較納米載銀抗菌凝膠和鹽酸米諾環(huán)素軟膏對4種牙周致病菌的抑菌環(huán)直徑，結果以(x±sd)表示，檢驗水準α=0.05。

2.結果

2.1 各組抑菌環(huán)數(shù)據(jù)見表1。

表1 各實驗組抑菌環(huán)直徑(mm)比較結果(x±sd)

實驗菌株對納米載銀抗菌凝膠均為中度敏感。納米載銀抗菌凝膠對同一種實驗菌株的抑菌環(huán)直徑與鹽酸米諾環(huán)素凝膠相比沒有明顯統(tǒng)計學差異，而明顯優(yōu)于空白對照。

2.2 各組培養(yǎng)皿抑菌環(huán)圖片見圖1-圖4。

圖1 P.g.組培養(yǎng)皿抑菌環(huán)圖片

圖2 P.i.組培養(yǎng)皿抑菌環(huán)圖片

圖3 F.n.組培養(yǎng)皿抑菌環(huán)圖片

圖4 A.a.組培養(yǎng)皿抑菌環(huán)圖片

3.討論

人群中牙周炎癥的患病率高達90%以上[1]，局部給藥在牙周疾病治療中有其獨特優(yōu)勢，用藥次數(shù)少、局部藥物濃度高、持續(xù)時間長、可減少全身用藥的不良刺激和反應。

目前市場上最常用的抗菌藥膏(膜)類劑型是鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派麗奧)[7]，但該制劑是抗生素制劑，長期使用有產(chǎn)生耐藥性的風險，臨床上有必要開發(fā)新型無耐藥風險的抗菌制劑。與抗生素相比，無機抗菌劑是一種廣譜高效的抗菌劑，金屬抗菌離子一般附載在緩釋性載體上,在使用過程中具有抗菌性能的金屬離子逐漸釋放,接觸細菌，破壞其細胞壁。在低濃度下金屬離子就有抗菌效果。而且它不會有耐藥性，儲藏條件寬松，與各種化學試劑不產(chǎn)生物理化學變化，將其制成合適的劑型在口腔科具有廣泛的用途。本課題組前期已經(jīng)制成了一種無機抗菌劑——納米載銀抗菌凝膠，具有良好的物理性能，具有制備簡單，應用方便，具水溶性，緩釋，無油膩性，質(zhì)量容易控制等特點。該制劑組方中卡波姆940添加0.5g、0.75g、1g、1.25g、1.5g后，觀察發(fā)現(xiàn)添加1g，所得凝膠的粘稠度與流動性更符合應用需求。添加甘油、丙二醇是穩(wěn)定劑與促進透皮吸收的作用。本實驗進一步觀察了納米載銀抗菌凝膠對常見牙周致病菌的體外抑菌作用，為其臨床應用提供理論依據(jù)。

本實驗結果表明，納米載銀抗菌凝膠對4種牙周致病菌具有抑菌作用，抑菌能力與鹽酸米諾環(huán)素軟膏相當。納米載銀抗菌凝膠的主要成分為納米級的載銀無機抗菌劑，它是在納米材料基礎上，由無機離子交換體與具有較強殺菌能力的銀離子化合制成[3]。本實驗所用納米載銀抗菌凝膠的有效成分濃度約為20mg/mL，有實驗表明，納米載銀無機抗菌劑對常見口腔病原菌的最小殺菌濃度較低，在2.5-40mg/mL之間[8]，本實驗進一步驗證了納米載銀抗菌凝膠對牙周致病菌的抑菌作用，要提高凝膠的抑菌作用，可以通過提高納米載銀無機抗菌劑的濃度來實現(xiàn)，但需要考慮到其潛在的毒性問題。雖然有文獻支持納米載銀無機抗菌劑具有良好的生物安全性[9,10]，但也有文獻指出，隨著劑量的增加，納米載銀無機抗菌劑可能對細胞/機體造成毒性[11,12]。彭暉等研究表明，納米銀可以引起EBF (人胚胎干細胞自然分化而來的成纖維細胞)的形態(tài)異常，表現(xiàn)為細胞皺縮，突觸收起，細胞間距增大。CCK-8和細胞周期檢測結果顯示，納米銀的細胞毒性呈時間和濃度依賴性[13]。因此，納米銀抗菌凝膠的臨床應用仍需要進一步研究其在臨床應用的可能性，同時探索出一個合適的藥物濃度，既滿足臨床需要，又能規(guī)避其可能存在的潛在毒性。

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The bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel to periodontal pathogens in vitro

DU Yan,ZHANG Lin-qi,LI Jin-sheng,ZHANG Tao(Department of Stomatology,PLA general Hospital,Beijing 100853, Chian)

Objective:To investigate the bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel to the common periodontal pathogens in vitro.Methods:The agar diffusion method was used to investigate the bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel(test group)to the common periodontal pathogens.The pathogens included werePorphyromanus gingivalis(P.g.),Prevotella intermedia(P.i.),Fusobacterium nucleatum(F.n.),Actinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.).minocycline gel and the blank vehicle was investigated as positive and negative control respectively at the same time.Results:The diameters of the bacterial inhibition ring of test group were14.4±1.14 mm, 15.2±0.84 mm,14.2±1.10 mm,14.8±0.84mmfor P.g.,P.i.,F.n.,A.a.,respectively.There were no significant difference between the test group and positive control.Conclusion:The nano-sliver based inorganic antibacterial gel have the similar baceriostasic activity to the common periodontal pathogens with minocycline.

nano-silver based inorganic antibacterial agent;minocycline;bacteriostasis;periodontal pathogens

R781.4

A

1672-2973(2017)04-0221-03

2017-03-21)

軍隊青年培育課題基金項目(項目編號：14QNP100)

杜巖解放軍總醫(yī)院口腔科主治醫(yī)師北京100853

張林祺通訊作者解放軍260醫(yī)院口腔科主任副教授河北050041

李金生解放軍260醫(yī)院藥劑科主任副主任藥師河北050041

張濤解放軍260醫(yī)院藥劑科藥師河北050041