宋丹+肖曠+鄭勇斌

[摘要] Smad4作為抑癌基因，其編碼的Smad4蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）家族各類信號(hào)傳導(dǎo)過程中共同需要的介質(zhì)，調(diào)控著細(xì)胞的增殖分化與凋亡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Smad4在結(jié)直腸癌中扮演重要的角色，其低表達(dá)與腫瘤的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。國內(nèi)外對(duì)Smad4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其功能的研究有很大進(jìn)展，本文就目前最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；Smad4；抑癌基因；轉(zhuǎn)化生長因子β

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（b）-0028-04

Research progress of Smad4 in colorectal cancer

SONG Dan XIAO Kuang ZHENG Yongbin▲

Department of Gastrointestinal Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China

[Abstract] Smad4 protein，encoded by tumor-suppressing gene Smad4， is a signal transduction medium of TGF-βsignaling pathway， regulating the proliferation，differentiation and apoptosis of cells. It is reported that Smad4 plays an important role in colorectal cancer and low expression of Smad4 is negatively related to the colorectal cancer development. This paper mainly review the research progress on the expression and function of Smad4 in colorectal cancer at home and abroad.

[Key words] Colorectal cancer； Smad4； Anti-oncogene； TGF-β

結(jié)直腸癌在西方國家一直是最常見的惡性腫瘤疾病之一，近十年來，包括中國、韓國、新加坡在內(nèi)的許多亞洲國家結(jié)直腸癌患病率較之前增長了2～4倍[1]。本文主要回顧Smad4在結(jié)直腸癌中的作用。Smad4作為抑癌基因，在結(jié)直腸癌中扮演重要的角色，同時(shí)，Smad4的低表達(dá)與腫瘤的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)。Smad4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其功能的研究有助于闡明腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移方面的機(jī)制，同時(shí)在治療方面將取得更大的突破。

1 Smad4基因的結(jié)構(gòu)功能

Smad4基因位于核染色體18q21.1，核苷酸序列保存在GenBank的U44378中。該基因轉(zhuǎn)錄子長2680 bp，其編碼的Smad4蛋白由552個(gè)氨基酸殘基組成。Smad4蛋白是Smads蛋白家族的成員之一，根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能分3個(gè)亞型：受體活化型（Receptor-activated Smads，R-Smads）、共享型（Common-mediator Smads，Co-Smads）、抑制型（Inhibitory Smads，I-Smads），其中Co-Smads即為Smad4。其一級(jí)結(jié)構(gòu)分為3個(gè)區(qū)：N端區(qū)、C端區(qū)和中間連接區(qū)，N端區(qū)和C端區(qū)分別稱MH1和MH2，中間連接區(qū)富含脯氨酸。MH2缺失磷酸化結(jié)構(gòu)SSXS，單獨(dú)存在不足以行使信號(hào)傳導(dǎo)功能，只有在部分中間連接區(qū)（Smad4的活性區(qū)）存在時(shí)方可傳遞信號(hào)[2-7]。

2 Smad4基因與TGF-β

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞存活、血管生成、免疫監(jiān)視過程中是一個(gè)普遍存在且非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。TGF-β信號(hào)通路中不同元素突變或刪失，以及抗TGF-β調(diào)節(jié)的抑制性增生?？蓪?dǎo)致各種腫瘤的發(fā)生。盡管TGF-β信號(hào)通路普遍被認(rèn)為具有抑癌作用，但其通過對(duì)腫瘤細(xì)胞本身以及間質(zhì)細(xì)胞的影響也可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8]。Sun等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中Smad4的缺失可使TGF-β的抑癌作用轉(zhuǎn)化為促癌作用，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

Smads家族蛋白在TGF-β信號(hào)通路中具有不可替代性，在將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，且不同的Smad蛋白介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物，激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，Smad4作為TGF-β超家族受體的直接底物，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有重要影響。

3 Smad4基因與CRC

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)包括遺傳與環(huán)境等多因素相互作用的結(jié)果。在所有因素中，染色體不穩(wěn)定性（chromosome instability，CIN）是影響結(jié)直腸癌進(jìn)展的主要通路之一，其中主要包括APC、p53和DCC/Smad4等的缺失[10]。特別是Smad4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的抑癌機(jī)制不可忽視，因此，探索Smad4基因?qū)τ诮Y(jié)直腸癌的診斷及治療均有重要的作用。

3.1 Smad4與CRC的發(fā)生及發(fā)展

抑癌基因Smad4是TGF-β信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在結(jié)直腸癌等消化道腫瘤中常常發(fā)生基因變異，包括染色體片段丟失、基因突變以及基因的表達(dá)異常。Demagny等[11]發(fā)現(xiàn)Smad4 Pro130Ser與Asn351His的突變可加強(qiáng)糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的磷酸化，從而抑制Smad4的活性及穩(wěn)定性，同時(shí)GSK-3活性被抑制可恢復(fù)細(xì)胞中TGF-β信號(hào)，說明抑癌基因Smad4的點(diǎn)突變可通過GSK-3的磷酸化作用從而可逆地使TGF-β信號(hào)失活。闡明了Smad4在TGF-β信號(hào)通路中的作用，同時(shí)提示GSK-3抑制劑可提高Smad4點(diǎn)突變蛋白的穩(wěn)定性，并恢復(fù)有類似突變癌細(xì)胞的TGF-β正常信號(hào)，為出現(xiàn)一種新的治療方式提供可能。Inamoto等[12]對(duì)333例早期結(jié)直腸癌標(biāo)本的研究以及在原位異種移植模型上探討Smad4缺失與腫瘤生長的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Smad4缺失的CRC細(xì)胞分泌的趨化因子（CCL15）可募集趨化因子受體（CCR1）+的細(xì)胞，導(dǎo)致早期腫瘤出現(xiàn)侵襲性生長。免疫組化結(jié)果表明Smad4與CCL15的表達(dá)顯著相關(guān)，在CRC入侵之前，分泌CCL15+的早期CRC細(xì)胞所募集的CCR1+的細(xì)胞大約是分泌CCL15-的2.2倍。重要的是，這些CCR1+的細(xì)胞主要是骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）（CD11b+、CD33+、HLA-DR-）。大多數(shù)CCR1+細(xì)胞表現(xiàn)為粒細(xì)胞樣的MDSC（CD14+），也有部分為單核細(xì)胞樣的MDSC（CD14+）。同時(shí)，研究中發(fā)現(xiàn)CRC患者血清CCL15水平顯著高于對(duì)照組。據(jù)此，阻斷MDSCsCCR1+的募集可能是一種新奇的分子靶向治療方法，血清CCL15的濃度也可作為CRC新的生物標(biāo)志物。Voorneveld等[13]在細(xì)胞水平及動(dòng)物模型上對(duì)BMP信號(hào)通路與Smad4的關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，激活Smad4缺失細(xì)胞的BMP信號(hào)通路能改變標(biāo)志上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的蛋白及mRNA水平，并能增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲能力以及細(xì)胞偽足的形成。體外敲出Smad4缺失細(xì)胞的BMP受體可降低其侵襲能力，因此發(fā)現(xiàn)Smad4缺失與患者不良預(yù)后的這種關(guān)系依賴于BMP受體的表達(dá)而非TGF-β受體的表達(dá)，因此尋求一種干擾非依賴Smad4的BMP信號(hào)通路的藥物可作為治療CRC的新手段。近年來，關(guān)于microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中潛在作用的探究越來越成為熱點(diǎn)，為了闡明CRC患者中microRNA-130a/301a/454家族與samd4之間的關(guān)系，Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)相比于鄰近正常黏膜，CRC組織中microRNA-130a/301a/454家族被上調(diào)。在CRC HCT116與SW480細(xì)胞中，microRNA-130a/301a/454可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)關(guān)于miRNAs的抑制因素與細(xì)胞的生存狀況關(guān)系密切。值得注意的是，microRNA-130a/301a/454在CRC細(xì)胞中的生物學(xué)功能是通過抑制Smad4來調(diào)節(jié)的，在人CRC中，microRNA-130a/301a/454的上調(diào)與Smad4的下調(diào)相聯(lián)系。除此以外，Cheng等[15]通過轉(zhuǎn)染等各種技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在人CRC細(xì)胞中，miR-20a-5p通過調(diào)節(jié)Smad4基因的3′UTR也可使Smad4蛋白表達(dá)降低。miR-20a-5p不僅可以增強(qiáng)CRC細(xì)胞在體外的增值能力及在體的肝轉(zhuǎn)移能力，還可以通過下調(diào)Smad4的表達(dá)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí)，通過對(duì)544例CRC患者標(biāo)本的組織微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miR-20a-5p在人CRC組織中表達(dá)上調(diào)，特別是在轉(zhuǎn)移組織中。高水平miR-20a-5p被證實(shí)預(yù)示CRC患者的不良預(yù)后。

Smad4缺失即為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）較為典型的情況，早有學(xué)者提出MSI是腫瘤形成的機(jī)制之一[16]，Isaksson-Mettavainio等[17]研究了Smad4的表達(dá)量對(duì)MSI型CRC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)Smad4的高表達(dá)可以明顯提高M(jìn)SI型CRC患者的生存率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Smad通路與非Smad通路還存在相互調(diào)控作用，張梅慶等[18]通過對(duì)53 例臨床病理標(biāo)本的免疫組化分析，探討Smad與蛋白激酶B（PKB）通路的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Smad4 表達(dá)下降還可能通過激活PKB通路促進(jìn)CRC的進(jìn)展，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。

在腫瘤生長過程中，腫瘤組織本身的營養(yǎng)供給狀況在腫瘤的發(fā)展中占有主要地位，在對(duì)腫瘤組織的血管及淋巴管生成的研究中， Yang等[19]發(fā)現(xiàn)PSG9/Smad4復(fù)合體可募集細(xì)胞質(zhì)中Smad2/3使其成為復(fù)合體，從而促進(jìn)Smad4在胞核中滯留，PSG9/Smad4復(fù)合體還可增強(qiáng)與血管生成相關(guān)的多重基因（IGFBP-3，PDGF-AA，GM-CSF，和VEGFA）的表達(dá)。另外通過對(duì)140例CRC患者與125例正常組的血清PSG9水平的對(duì)比以及對(duì)74組腫瘤組織及其相鄰正常組織PSG9水平的檢測發(fā)現(xiàn)，CRC患者的血清及腫瘤組織中，PSG9都顯著升高。且其升高水平與患者預(yù)后及微脈管密度負(fù)相關(guān)。體外研究證實(shí)PSG9的過表達(dá)明顯促進(jìn)HCT-116與HT-29細(xì)胞的增值與轉(zhuǎn)移，同時(shí)，PSG9的水平降低可抑制SW-480細(xì)胞的增殖。通過在人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞上研究促血管發(fā)生實(shí)驗(yàn)證實(shí)PSG9還可促進(jìn)血管生成。其后的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了PSG9與Smad4的這一相關(guān)性。Smad4作為TGF-β信號(hào)通路中重要的下游調(diào)節(jié)因子，對(duì)CRC的抑癌作用明顯，但其對(duì)CRC的淋巴管生成影響一直未明。Liu等[20]研究了Smad4對(duì)淋巴管生成的潛在抑制作用以及在結(jié)腸癌中與VEGF-C分泌的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)，Smad4可抑制VEGF-C的分泌，并抑制淋巴管的生成，從而降低腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲能力。

3.2 Smad4與CRC的轉(zhuǎn)移

早前Tian等[21]在體外細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Smad4的sw480癌細(xì)胞株在培養(yǎng)過程中細(xì)胞遷移率明顯減少，而近十年來，國內(nèi)外出現(xiàn)了較多對(duì)Smad4缺失在CRC轉(zhuǎn)移中具體機(jī)制的探討。Itatani等[22]通過對(duì)人CRC細(xì)胞中Smad4調(diào)節(jié)CCL15表達(dá)的能力的研究以及對(duì)141例CRC肝轉(zhuǎn)移標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，在人CRC細(xì)胞中，Smad4的缺失不僅可以上調(diào)CCL15的表達(dá)，而且在表達(dá)CCL15的肝轉(zhuǎn)移組織中含有更高水平的CCR1+細(xì)胞，這些發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的病人出現(xiàn)更低的生存率。提示可以阻斷CCL15募集CCR1+細(xì)胞的藥物來防止CRC的肝轉(zhuǎn)移。Yamamoto等[23]對(duì)小鼠模型的研究以及對(duì)107例CRC肺轉(zhuǎn)移臨床標(biāo)本的檢測發(fā)現(xiàn)，缺失Smad4可通過CCL15-CCR1軸積累CCR1+腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞來促進(jìn)CRC細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移能力。同時(shí)根據(jù)劉巖青等[24]對(duì)112例CRC患者的最新臨床研究以及陳小會(huì)等[25]對(duì)99例CRC患者的臨床標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，CRC中Smad4低表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，且是CRC肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素，可作為預(yù)測CRC肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。

3.3 Smad4與CRC患者的預(yù)后

目前，CRC患者的預(yù)后主要根據(jù)臨床病理分期判定，這對(duì)預(yù)后的評(píng)價(jià)的合理性有待于提高，因此越來越多的研究從分子機(jī)制層面探討某些分子標(biāo)志物與患者預(yù)后的關(guān)系。其中，Smad4基因在CRC預(yù)后方面的研究一直是科研中的熱點(diǎn)，為了證明Smad4的表達(dá)情況與CRC患者結(jié)局是否相關(guān)，Kozak等[26]在2005～2009年連續(xù)收集了241例CRC患者的標(biāo)本及其臨床病理記錄，對(duì)其癌組織及其正常組織通過微陣列進(jìn)行分析，并通過免疫組化檢測Smad4的表達(dá)情況。結(jié)果241例腫瘤中有21例Smad4表達(dá)陰性。后期對(duì)患者的跟蹤調(diào)查進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Smad4陰性相對(duì)于Smad4陽性患者有著不良預(yù)后。早前Voorneveld等[27]對(duì)137個(gè)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)歸納分析也進(jìn)一步證明，免疫組化檢測Smad4表達(dá)情況可作為患者預(yù)后情況的標(biāo)志。傳統(tǒng)醫(yī)療過程中，常以臨床病理結(jié)果來評(píng)價(jià)CRC肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率，其預(yù)后與相關(guān)的分子標(biāo)記物的關(guān)系并不清楚，López-Gómez等[28]對(duì)121例患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，Smad4和TS的表達(dá)情況與CRC肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，此發(fā)現(xiàn)有利于更科學(xué)的彌補(bǔ)在以臨床病理為基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)體系中的不足。Wang等[29]通過免疫組化及微陣列對(duì)112例標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，COUP-TF Ⅱ的高表達(dá)與Smad4陰性均提示CRC患者的不良預(yù)后。Chun等[30]通過對(duì)201例直腸癌（三期）標(biāo)本通過免疫組化檢測了TGF-β1、TGF-βⅡ型受體，Smad3、Smad4以及Smad7蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1低表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。王星權(quán)等[31]對(duì)134例CRC患者的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CRC組織中具有Smad4高表達(dá)的患者，其術(shù)后總體生存期較低表達(dá)組患者為好。Smad4缺失不僅影響CRC的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移及預(yù)后，同時(shí)影響著CRC的化療效果，Zhang等[32]研究發(fā)現(xiàn)了Smad4調(diào)節(jié)5-FU的化療敏感性的新機(jī)制，即通過抑制PI3K/Akt/CDC2/凋亡抑制蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)阻礙細(xì)胞周期。最近相關(guān)研究也證明LY294002逆轉(zhuǎn)Smad4低表達(dá)的CRC患者的化療敏感性的潛在療效。因而關(guān)于這方面的研究將有利于提高CRC患者的預(yù)后。以上均提示，Smad4的缺失預(yù)示著患者的不良預(yù)后，所以Smad4蛋白有望作為評(píng)價(jià)CRC患者預(yù)后的重要蛋白標(biāo)志物。

4 展望

目前，Samd4在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的分子生物學(xué)方面的研究還在不斷深入，同時(shí)Smad4作為CRC患者評(píng)價(jià)預(yù)后的分子標(biāo)志物越來越得到大家的認(rèn)可。但目前尚缺乏一個(gè)Smad4缺失并模擬人體散發(fā)性癌灶的CRC動(dòng)物模型，從而更詳盡地研究Smad4在CRC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的機(jī)制，以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程中，Smad4與腫瘤局部免疫狀況的關(guān)系及其在致瘤中的地位，因此有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-03-27 本文編輯：李岳澤）