戴樂楊 孔秋月 李楠 丁正年

熱休克蛋白A12B對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用

戴樂楊 孔秋月 李楠 丁正年

目的 探討熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷中的作用。 方法 本實驗采用8～10周齡、雄性高表達HSPA12B轉基因鼠(HSPA12B transgenic mice,Tg鼠),一窩所生的雄性野生型(wild type,WT)鼠作為對照,隨機分配后行假手術或I/R手術，結扎冠狀動脈左前降支45 min (缺血)、松開結扎線4 h (再灌注)。 通過聚合酶鏈式反應(PCR)檢測WT鼠I/R手術與假手術后4 h,心肌HSPA12B mRNA的表達水平;通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定I/R手術后4 h,WT鼠與Tg鼠的心肌梗死面積;通過免疫印跡法檢測WT鼠與Tg鼠分別行I/R手術與假手術的4組心肌中Bcl-2和Bax蛋白水平。 結果 I/R損傷引起WT鼠心肌HSPA12B mRNA表達水平增高。在共同經(jīng)歷I/R損傷后,Tg鼠較WT鼠的心肌梗死面積縮小,并且Tg鼠心肌組織抗凋亡能力(Bcl-2/Bax比值)明顯高于WT鼠。 結論 高表達HSPA12B可能通過減少細胞凋亡,減輕心肌I/R損傷,發(fā)揮心肌保護的功能,提示HSPA12B可能是干預心肌I/R損傷的潛在靶點。

熱休克蛋白A12B; 心肌缺血/再灌注損傷; 細胞凋亡

心肌缺血是臨床常見疾病,盡早恢復缺血心肌的血流是治療心肌缺血的根本手段[1]。然而,在血流恢復的早期會額外加重原有缺血心肌的損傷,這種現(xiàn)象被稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷。熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)是近年在動脈粥樣斑塊中克隆到的新型熱休克蛋白[2],課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HSPA12B能夠減輕腦I/R損傷[3],并對永久缺血誘發(fā)的心臟重塑有保護作用[4],但HSPA12B在心肌I/R損傷中的作用尚不清楚,本研究將探討HSPA12B是否對心肌I/R損傷具有保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 采用BAC/PAC系統(tǒng),構建人HSPA12B基因的表達載體。限制性內切酶酶切后獲得線性化的人HSPA12B基因表達序列,顯微注射到C57BL/6小鼠受精卵原核中。通過提取鼠尾基因并與轉基因特異性引物進行PCR來確定首建鼠的基因型。首建鼠與所有的后代均與C57/BL6小鼠回交。通過免疫印跡法驗證高表達HSPA12B小鼠轉基因成功[5]。本實驗采用8～10周齡、雄性高表達HSPA12B的轉基因鼠(HSPA12B transgenic mice,Tg鼠),一窩所生的雄性野生型(wild type,WT)鼠作為對照。實驗動物飼養(yǎng)于南京大學模式動物研究所SPF級動物房。

1.2 方法

1.2.1 心肌I/R模型:小鼠1.5%～2%異氟烷吸入麻醉后,開胸、暴露心臟,結扎冠脈左前降支引起心肌缺血,45 min后解除結扎進行血流再灌注。假手術(Sham)組除不結扎血管外,其他步驟與I/R手術一致[6]。

1.2.2 定量聚合酶鏈反應(PCR):收集I/R術后4 h的心室肌組織,提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,以HSPA12B相應引物進行定量PCR,其上游、下游引物分別為GGCCTGCAAGGGCTGTATATC、ATGTGGTTCCAAAGTCGATGG。檢測心肌組織中HSPA12B mRNA的表達水平。

1.2.3 免疫印跡:收集I/R術后4 h的心室肌組織,提取可溶性蛋白質,先行10%SDS-PAGE膠分離蛋白，再轉至PVDF膜(Millipore)上,5%脫脂牛奶封閉1 h,抗HSPA12B(1∶1000,Santa Cruz,美國)、抗Bax(1∶1000,Cell Signaling Technology,美國)、抗Bcl-2(1:1000,Cell Signaling Technology,美國)抗體孵育過夜(4 ℃),繼而用辣根過氧化物酶標記二抗4 ℃孵育2 h,ECL(Pierce,美國)顯色。以抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶1000,Bioworld,美國)的免疫印跡作為上樣量的內參[4]。顯色條帶用AlphaEaseFC(Alpha Innotech,美國)進行灰度定量。檢測HSPA12B、Bax、Bcl-2的蛋白水平。

1.2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色:I/R術后4 h,斷頸處死小鼠,快速取出心臟,生理鹽水漂洗血液后切片,置于1.5%的TTC溶液中37℃孵育15 min。檢測梗死面積(白色)占心室面積的百分比,以此表示心肌損傷的程度。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6進行統(tǒng)計分析,結果以均數(shù)±標準差表示,2組間比較采用成組t檢驗,多組間比較采用雙因素方差分析(two-way ANOVA),組間多重比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 I/R損傷對WT小鼠心肌HSPA12B mRNA表達的影響 與WT小鼠Sham組相比,I/R組的小鼠心肌組織中HSPA12B mRNA水平增高了157.8%(0.9±0.2比0.4±0.1,P<0.01,n=6)。

2.2 鑒定HSPA12B轉基因小鼠 與WT鼠相比,Tg鼠心肌組織HSPA12B蛋白水平升高了591.4%(6.9±0.5比1.0±0.1,P<0.01,n=4)。表明轉基因鼠構建成功。見圖1。

圖1 Tg鼠和WT鼠心肌HSPA12B蛋白水平比較

2.3 HSPA12B縮小I/R損傷引起的心肌梗死面積 I/R 4 h后,與WT鼠相比,Tg鼠的心肌梗死面積縮小了52.3%(14.4%±1.5%比30.3%±4.4%,P<0.01，n=5)。該結果提示,高表達HSPA12B可以顯著減輕心肌I/R損傷。見圖2。

圖2 I/R 4 h后Tg鼠與WT鼠心肌梗死面積比較

2.4 HSPA12B使I/R損傷心肌抗凋亡蛋白水平升高 WT、Tg小鼠的Sham亞組之間Bcl-2/Bax比值的差異沒有統(tǒng)計學意義(1.0±0.1比1.0±0.1,P>0.05,n=4)。與WT、Tg小鼠組的Sham亞組相比,對應的I/R亞組Bcl-2/Bax比值分別增加了73.1%、259.0%(P<0.01)。與WT小鼠I/R亞組相比,Tg小鼠I/R亞組Bcl-2/Bax比值升高了103.1%(P<0.01)。見圖3。

圖3 4個亞組間小鼠心肌Bcl-2/Bax比值比較

3 討論

冠脈血管阻塞后,其負責供血的心肌區(qū)域被稱為缺血風險區(qū)。無血流時間達到一定長度,缺血風險區(qū)會出現(xiàn)壞死、凋亡,表現(xiàn)為心肌梗死、心功能下降。及早恢復血液灌注是挽救缺血心肌重要的治療手段[7]。然而,大量臨床資料和動物實驗表明,I/R損傷可能進一步擴大心肌梗死面積、損害心功能，甚至導致心律失常[8]。因此,如何減輕心肌I/R損傷,是一個嚴峻且亟待解決的臨床問題。在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)HSPA12B過表達的Tg小鼠經(jīng)歷I/R損傷后呈現(xiàn)的心肌梗死面積較WT鼠減少了50%以上。結果提示,HSPA12B能顯著減輕心肌I/R損傷,具有心臟保護作用。

心肌I/R損傷與心肌梗死的病理表現(xiàn)并不完全相同,前者表現(xiàn)為凋亡相關的介質增多(激活的caspase-3和細胞色素c),后者則表現(xiàn)為更加明顯的炎癥反應,血漿促炎因子白細胞介素6水平增高以及中性粒細胞在梗死相關區(qū)域滲透聚集。據(jù)此認為I/R主要與凋亡相關[9]。細胞凋亡主要通過三種方式進行,外源性死亡受體途徑、內源性線粒體途徑和內源性內質網(wǎng)應激途徑[10]。在內源性線粒體途徑中,Bax和Bcl-2參與細胞色素c的調釋放節(jié),其中前凋亡蛋白Bax促進(抗凋亡蛋白Bcl-2抑制)細胞色素c的釋放,形成凋亡體,激活下游的caspase-3,最終導致凋亡的產(chǎn)生[11-12]。因此,有學者提出Bcl-2/Bax決定了細胞的命運[13]。我們曾經(jīng)報道,高表達HSPA12B可以減輕腦I/R損傷后的神經(jīng)元凋亡[3]。在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)在心臟經(jīng)歷I/R損傷后,Tg鼠的Bcl-2/Bax比值比WT鼠升高了1倍。據(jù)此,我們推測,過表達HSPA12B增加了I/R損傷后Bcl-2/Bax的比值,發(fā)揮了抑制凋亡的作用,增加心肌細胞生存機會,從而保護心肌,減輕I/R損傷。

此外,HSPA12B還具有改善內皮細胞通透性[14]和下調炎癥粘附因子及炎癥因子的作用[15],而氧化應激引起的炎癥級聯(lián)放大反應則是心臟I/R損傷另外一種重要的機制[9]。在下一步研究中,我們將會繼續(xù)探索HSPA12B在心臟I/R損傷中是否具有調節(jié)血管通透性及炎癥反應的生物學作用。

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Protective effects of heat shock protein A12B on myocardial ischemia/reperfusion injury in mice

DAILe-yang,KONGQiu-yue,LINan,DINGZheng-nian.
DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the effect of heat shock protein A12B(HSPA12B) on myocardial ischemia/reperfusion injury in mice. Methods Male littermates of transgenic mice (Tg) with over expression of HSPA12B and wild type (WT) mice as the control aged 8-10 weeks were enrolled in the experiments. The mice were randomly devided into sham operation group and myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury group.The mice in I/R group

the intervention that left anterior descending (LAD) coronary artery was legated for 45 min (ischemia) and then the blood flow was restored for 4 h (reperfusion). The mRNA level of HSPA12B was measured by real time-PCR; the myocardial infarction size was determined by TTC staining; And the expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunoblot. Results I/R injury could induce the increase of the mRNA level of HSPA12B in WT mice. After I/R injury, the infarction area of Tg mice was smaller than that of WT mice, and the myocardial anti-apoptosis ability (the ratio of Bcl-2/Bax) of Tg mice was better than that of WT mice. Conclusions The over expression of HSPA12B can protect heart from I/R injury in mice through reducing the cell apoptosis and might be the potential target to the intervention of myocardial I/R injury.

heat shock protein; myocardial ischemia/reperfusion injury; apoptosis

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科

丁正年，Email：zhengnianding@njmu.edu.cn

R 542.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.08.008

2016-11-08)