朱國霞+哈玲津+王金娥+劉海學(xué)+白東清

摘 要：本項目組成員在科研中測定飼料粗蛋白時，分別利用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法進(jìn)行比較，得到可以用杜馬斯燃燒法替代以凱氏定氮法的結(jié)論，并嘗試將其引入飼料分析實驗課中，避免凱氏定氮法的安全隱患及廢液污染等問題，使學(xué)生既具備扎實的實驗基礎(chǔ)，又能應(yīng)用到現(xiàn)代儀器，提高就業(yè)競爭力。

關(guān)鍵詞：飼料；粗蛋白；杜馬斯燃燒法；凱氏定氮法；實驗教學(xué)改革

粗蛋白含量是衡量飼料原料和動物產(chǎn)品營養(yǎng)價值的一個重要指標(biāo)，因此，準(zhǔn)確測定動物飼料及其產(chǎn)品中的粗蛋白是動物飼養(yǎng)和營養(yǎng)的核心內(nèi)容之一。本項目組成員除了實驗課上指導(dǎo)學(xué)生做利用凱氏定氮法測定大量的飼料粗蛋白的實驗外，還承擔(dān)部分科研及對外檢測的測定飼料粗蛋白的任務(wù)。凱氏定氮法是經(jīng)典的測定飼料粗蛋白的方法，但由于其測定時間長，需要使用危險化學(xué)試劑，容易造成環(huán)境污染，因而隨著人們對安全和環(huán)境問題的日益關(guān)注，分析設(shè)備的不斷改進(jìn)，本項目組嘗試采用杜馬斯燃燒法逐漸替代傳統(tǒng)凱氏定氮法的可行性。我們經(jīng)過在科研生產(chǎn)中大量的實驗摸索，比較兩種方法對實驗結(jié)果及對操作人員和環(huán)境的影響，得出結(jié)論，杜馬斯法可以作為飼料粗蛋白測定的優(yōu)選方法替代凱氏定氮法。本文從飼料分析實驗課教學(xué)改革角度分析杜馬斯燃燒法替代凱氏定氮法測定飼料粗蛋白的必要性與可行性。

一、粗蛋白測定方法的發(fā)展趨勢

飼料分析實驗課是畜牧專業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)的一門重要的專業(yè)基礎(chǔ)實驗課，具有很強(qiáng)的實踐性和操作性，內(nèi)容廣，實應(yīng)性強(qiáng)。飼料企業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)用人單位對畢業(yè)生的需求量逐年增加，為了適應(yīng)人才市場對高級專門人才的需求，本項目嘗試對飼料分析實驗課的實驗項目進(jìn)行開發(fā)與調(diào)整，在保留經(jīng)典實驗項目的基礎(chǔ)上，將儀器引入到課程里，讓學(xué)生既能掌握基礎(chǔ)的實驗方法，又能接觸到最新的實驗技術(shù)。隨著飼料行業(yè)的迅速發(fā)展，飼料的品質(zhì)控制和安全已成為飼料生產(chǎn)廠家必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，飼料粗蛋白的測定是飼料分析實驗課的一個重要的實驗項目，也是飼料生產(chǎn)與科研中必不可少的檢測項目，本項目將原有的凱氏定氮法轉(zhuǎn)變?yōu)槎篷R斯燃燒法，旨在減少環(huán)境污染及安全隱患，順應(yīng)科技發(fā)展，培養(yǎng)具備就業(yè)競爭力的農(nóng)業(yè)院校畢業(yè)生。這僅是飼料分析實驗課的一個嘗試，今后還將繼續(xù)摸索實驗教學(xué)改革，力爭將傳統(tǒng)的飼料分析實驗課程轉(zhuǎn)變成適應(yīng)行業(yè)發(fā)展需求的綜合創(chuàng)新型實驗課。

粗蛋白的測定方法主要有凱氏定氮法、杜馬斯燃燒法、分光光度法和滴定法等。分光光度法簡單迅速，靈敏度低。滴定法在操作過程中主要是靠實驗者肉眼進(jìn)行判斷，所以容易產(chǎn)生誤差。目前，國內(nèi)高校粗蛋白的檢測方法主要是經(jīng)典的凱氏定氮法（GB/T 6432—1994），也是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，通過測定總氮量來計算蛋白質(zhì)含量。傳統(tǒng)的凱氏定氮裝置需要人工進(jìn)行儀器洗滌、安裝、試劑添加、滴定等步驟，過程復(fù)雜，操作繁瑣，耗時耗力且誤差來源較多，尤其不利于大批量樣品的檢測。與傳統(tǒng)裝置相比，近代的凱氏定氮儀實現(xiàn)了部分測定的自動化，可通過編程操作，不僅提高了測定效率及測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，而且節(jié)省了人力物力，因而得到廣泛的應(yīng)用。但還是需要在樣品前處理消化過程中使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，操作復(fù)雜、費時，產(chǎn)生二氧化硫等對人體有害且污染環(huán)境的酸霧。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，開始尋求新的檢測方法代替凱氏定氮法，近年來杜馬斯法在我國也已被標(biāo)準(zhǔn)化，作為飼料原料、谷類豆類、糧食及制品等粗蛋白含量的測定方法[3-6]。但是，由于杜馬斯燃燒法需要較高的前期投資，而且人們已經(jīng)習(xí)慣原有的凱氏定氮法，利用杜馬斯法測定還沒有普及。杜馬斯燃燒法的測定原理是將待測樣本在純氧（≥99.99%）環(huán)境中高溫燃燒，將其所含的有機(jī)氮和無機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化成氮的氧化物后被還原劑還原成氮氣。最后，用TCD 檢測器檢測氮氣產(chǎn)量，在短時間內(nèi)準(zhǔn)確地測定出樣品的總氮含量。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對凱氏法與杜馬斯燃燒法進(jìn)行了大量的實驗，研究結(jié)果表明杜馬斯燃燒法不僅能夠代替凱氏法進(jìn)行實驗室分析，而且準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性都優(yōu)于凱氏法。杜馬斯燃燒法前處理簡單、省時，能夠自動連續(xù)大批量檢測，具有環(huán)境友好、安全等特點，是未來飼料粗蛋白測定的發(fā)展趨勢。

二、杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定飼料粗蛋白實驗方法的比較

Flash2000杜馬斯定氮儀（thermo），氦氣，二氧化碳（99.99%），氧氣（99.99%），氧化劑，吸附劑。

凱氏定氮儀（新嘉），硫酸，鹽酸，硼酸，硫酸銅，硫酸鉀，氫氧化鈉，甲基紅，溴甲酚綠。

1.杜馬斯燃燒法

開機(jī)，穩(wěn)定后校準(zhǔn)。稱取30mg樣品置于錫箔紙中，并緊密包裹、壓實，置于自動落樣器內(nèi)。在高溫燃燒管中充分燃燒，產(chǎn)物（NOx）被載氣運送至還原爐中，經(jīng)銅和鎢還原生成的氮氣除去水后經(jīng)檢測器（TCD）檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線計算定量。在儀器中，根據(jù)樣品的質(zhì)量和校正曲線形成的檢測信號，得出試樣中氮元素的含量，粗蛋白含量=總氮含量/樣品質(zhì)量×換算系數(shù)。

2.凱氏定氮法

稱取2g樣品于消化管中，加入催化劑和濃硫酸，在消煮爐中消化至消化液澄清。取出，按照凱氏定氮儀的要求裝好40%氫氧化鈉溶液、硼酸吸收液、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，待溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為滴定終點，記錄消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，由此計算樣品中粗蛋白的含量。

三、杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定飼料粗蛋白的實驗教學(xué)比較

凱氏定氮法需要使用濃硫酸和40%氫氧化鈉等危險化學(xué)試劑，在實驗準(zhǔn)備及實驗進(jìn)行當(dāng)中，無論是準(zhǔn)備人員還是操作者都不可避免地接觸藥品，濃硫酸具有高腐蝕性和脫水性，操作不夠熟練或者操作失誤容易將濃硫酸吸到移液管外面或者吸耳球里，不經(jīng)意地甩到周圍人的衣服上或接觸到皮膚上，不久就有可能發(fā)現(xiàn)衣服上有破洞或者手指皮膚灼痛。另外由于實驗過程中不可避免地將濃硫酸放置在外面，就會存在藥品遺失的安全隱患，這給實驗室的安全管理造成巨大的壓力。

凱氏定氮法測定粗蛋白由于消化過程是在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品，使蛋白質(zhì)和氨態(tài)氮（在一定處理條件下也包括硝態(tài)氮）都轉(zhuǎn)變成氨，并被濃硫酸吸收變?yōu)榱蛩徜@；而非含氮物質(zhì)，則以二氧化碳、水、二氧化硫的氣體狀態(tài)逸出。硫氧化物是大氣的主要污染物之一，它不僅危害人體健康，而且還會腐蝕通風(fēng)設(shè)備。如果長期用凱氏法做大量的飼料粗蛋白測定，無疑會對操作人員和環(huán)境造成危害。 凱氏定氮法嚴(yán)重的安全問題及環(huán)境污染是其自身無法克服的缺陷，如果還是固守原有的凱氏定氮法，與我們向?qū)W生傳達(dá)的環(huán)保、健康的理念相悖，與知識的更新、技術(shù)的發(fā)展是不協(xié)調(diào)的，隨著人們環(huán)保意識的逐漸增強(qiáng)，安全、綠色無污染的杜馬斯法將得到越來越廣泛的應(yīng)用。

實驗室儀器設(shè)備是高等學(xué)校從事教學(xué)、科研的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為了滿足新時期飼料企業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)用人單位對畢業(yè)生的需求，本著減少對環(huán)境的污染和對實驗人員健康的危害的原則，我們有必要摸索杜馬斯燃燒法替代原有的凱氏定氮法，這樣既能增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，開闊眼界，又能掌握更先進(jìn)的儀器分析技術(shù)。

凱氏法是丹麥科學(xué)家Kjeldahl于1883年提出的方法，雖經(jīng)改進(jìn)，但由于其前處理步驟多，不同類型的消化設(shè)備、蒸餾設(shè)備、滴定儀器都會導(dǎo)致測定值間的顯著性差異，最快120min/20個（爐），消化兩三個小時。杜馬斯燃燒法測定操作簡單，儀器自動化程度高，測定時間短（測定全過程只需4～6分鐘），能夠自動連續(xù)大批量檢測，該方法的重現(xiàn)性明顯優(yōu)于凱氏法。利用高效能的實驗儀器吸引學(xué)生，嘗試開放實驗室，可以提高儀器的使用率，使其更好地為教學(xué)、科研服務(wù)，還有助于學(xué)生接觸到先進(jìn)儀器與相關(guān)領(lǐng)域前沿科技手段，提高學(xué)生的科研能力與綜合素質(zhì)，將實驗教學(xué)和飼料營養(yǎng)與養(yǎng)殖生產(chǎn)密切結(jié)合，以生產(chǎn)實踐提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，將課程內(nèi)容延伸到學(xué)生的畢業(yè)論文、生產(chǎn)實習(xí)中，擴(kuò)展學(xué)生的眼界及解決問題的綜合能力。

通過以上的原理及方法介紹，可以看出凱氏定氮法需要有操作嫻熟的實驗人員才能夠勝任，對于初學(xué)者或者沒有分析化學(xué)基礎(chǔ)的實驗人員容易造成操作失誤甚而意外傷害。杜馬斯定氮法則不需要專業(yè)技巧及知識，操作簡單，可以實現(xiàn)快速、全自動。為了提高學(xué)生的科研素質(zhì)，培養(yǎng)綜合能力，我們從培養(yǎng)學(xué)生良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣入手，要求學(xué)生實驗課前不僅要對實驗原理、操作進(jìn)行預(yù)習(xí)，帶著問題上課，還要借助各種工具了解實驗所接觸的藥品的物理化學(xué)性質(zhì)，使用注意事項。實驗過程中不僅知其然，還要知其所以然，出現(xiàn)問題，能夠分析原因，排查隱患。這樣學(xué)生就不僅僅是實驗的操作者，而是一名科研工作者，具有維護(hù)儀器及實驗室安全的責(zé)任心。在實驗過程中，一接觸到儀器就有針對地記錄它各方面的數(shù)據(jù)資料，做好實驗記錄，出現(xiàn)情況及時解決。

杜馬斯燃燒法測定飼料粗蛋白時稱樣量在0.10～0.15g時，變異系數(shù)小，結(jié)果穩(wěn)定；采用標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別確定杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法的準(zhǔn)確度，兩種方法回收率在95.4%～100.1%之間，準(zhǔn)確度良好；杜馬斯法測定結(jié)果的變異系數(shù)與凱氏法測定值結(jié)果呈顯著線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.9988，P﹤0.001），不存在顯著差異（P>0.2），結(jié)果準(zhǔn)確，符合粗蛋白含量分析的要求。兩種方法之間的差異主要在測定硝態(tài)氮含量較高的飼料原料時，燃燒法的測定值高于凱氏法，可能是由于燃燒法能測出飼料原料中的總氮含量，植物體內(nèi)的氮主要包括蛋白氮、氨基酸氮、硝態(tài)氮和核酸氮，而凱氏法只能測定蛋白氮、氨基酸氮和部分硝態(tài)氮。因而杜馬斯燃燒法可以作為測定各種飼料粗蛋白的常規(guī)方法。

實驗教學(xué)是學(xué)生掌握實驗技能的重要途徑，利用現(xiàn)有的儀器設(shè)備，有助于學(xué)生鞏固課堂所學(xué)的知識，培養(yǎng)動手能力和科研能力。如果實驗手段還停滯在瓶瓶罐罐、玻璃儀器范疇，難以調(diào)動學(xué)生的積極性。儀器設(shè)備是高等學(xué)校從事教學(xué)與科研工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，將科研用途的杜馬斯定氮儀充分利用并投入到實驗教學(xué)領(lǐng)域，有利于拓展學(xué)生視野，掌握科研領(lǐng)域先進(jìn)的實驗手段，正好滿足他們渴求新知識新技術(shù)的求知欲，他們能夠迅速掌握先進(jìn)的儀器手段，成為生產(chǎn)和科研領(lǐng)域的生力軍。在提高儀器的使用率的同時，更好地為教學(xué)、科研服務(wù)，還有助于培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生的科研能力與綜合素質(zhì) 。

四、結(jié)語

與凱氏法相比，杜馬斯燃燒法結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，前處理簡單，時間短，成本低，能夠自動連續(xù)大批量檢測，且避免造成環(huán)境污染，適用于飼料樣品粗蛋白檢測。經(jīng)過本次嘗試，將在科研領(lǐng)域測定飼料粗蛋白的杜馬斯燃燒法引入到學(xué)生的實驗課程里替代原有的凱氏定氮法，以科研促進(jìn)教學(xué)，再將教學(xué)成果轉(zhuǎn)化成生產(chǎn)力應(yīng)用到生產(chǎn)實踐當(dāng)中，將實驗教學(xué)和飼料生產(chǎn)密切結(jié)合，一方面能夠以生產(chǎn)實踐提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，另一方面將課程內(nèi)容延伸到學(xué)生的生產(chǎn)實踐、畢業(yè)實習(xí)中，進(jìn)一步加強(qiáng)學(xué)生分析問題和解決問題的綜合能力。我們還將不斷摸索嘗試，在傳統(tǒng)實驗課基礎(chǔ)上增添環(huán)保、高科技的新實驗項目，培養(yǎng)出實驗操作技能扎實、具備先進(jìn)科研素質(zhì)的新型農(nóng)業(yè)人才，將傳統(tǒng)的飼料分析實驗課程轉(zhuǎn)變成適應(yīng)行業(yè)發(fā)展需求的綜合創(chuàng)新型實驗課。

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作者簡介：朱國霞（1975-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物營養(yǎng)。

基金項目： 天津農(nóng)學(xué)院實驗教學(xué)示范中心教學(xué)改革項目2015SY035；

天津農(nóng)學(xué)院高校教師教育改革創(chuàng)新引導(dǎo)發(fā)展項目20170210；