李凌漢+何虹+林勇

[摘要] 目的 探討膝骨性關(guān)節(jié)炎患者不同中醫(yī)證型患者外周血Th17細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-17、IL-1β和IL-6）的水平與盤龍七片療效的關(guān)系。 方法 選取淤血阻滯、陽(yáng)虛寒凝、腎虛髓空三種中醫(yī)證型患者各25、24和26例，正常對(duì)照組24例，患者采用盤龍七片治療，每日3次，每次3片，治療前和治療6周后，留取正常對(duì)照組和患者外周血，采用流式細(xì)胞術(shù)和ELIS法檢測(cè)Th17細(xì)胞和血清細(xì)胞因子IL-17、IL-1β和IL-6濃度，并進(jìn)行療效評(píng)估。 結(jié)果 腎虛髓空、陽(yáng)虛寒凝、瘀血阻滯三種中醫(yī)證型患者Th17細(xì)胞比例和細(xì)胞因子濃度均高于正常對(duì)照組，且呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；三種中醫(yī)證型有效治療者，Th17細(xì)胞比例和細(xì)胞因子濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；三種中醫(yī)證型患者療效呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，腎虛髓空型高于另外兩種證型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 膝骨性關(guān)節(jié)炎患者外周血Th17細(xì)胞比例和細(xì)胞因子IL-17、IL-1和IL-6濃度與盤龍七片的療效有關(guān)，可作為中醫(yī)證型和預(yù)后的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 骨關(guān)節(jié)炎，膝；Th17細(xì)胞；白細(xì)胞介素-6；IL-1β；盤龍七片

[中圖分類號(hào)] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）13-09-04

[Abstract] Objective To explore the levels of peripheral blood Th17 cells and related cytokines including IL-17，IL-1βand IL-6 for different Traditional Chinese Medicine（TCM）Syndromes of patients with knee osteoarthritis and the relationship between Panlong Seven effect. Methods Knee osteoarthritis patients were divided into symptoms as blood stasis type （n=25），Yang deficiency cold coagulation type （n=24），kidney deficiency type（n=26） three groups.24 healthy persons served as control.All patients were administrated with Panlong Seven tablets，3 times a day，3 tablets each time.Before treatment and 6 weeks after treatment，peripheral blood in normal control group and all patients were collected.Flow cytometry and ELISA were used to detect the Th17 cells and theconcentrations of IL-17，IL-1β and IL-6 in serum，meanwhile to evaluate the therapeutic effect of Panlong Seven. Results The levels of Th17 cells and related cytokines in three TCM syndrome types patients of kidney deficiency type，Yang deficiency cold coagulation，blood stasis were higher compared with the normal control group.There were statistically significant difference（P<0.05）.The levels of them showed a gradually increasing trend.The percentage of Th17 cells and the concentration of cytokines were significantly decreased in effective patients in three TCM syndroms.There were statistically significant difference（P<0.05）.The curative effect showed gradually increasing trend.kidney deficiency type were higher than other two types，and there were statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion The effect of Panlong Seven is related to the levels of Th17 cells and cytokines IL-17，IL-1β and IL-6 in peripheral blood of patients with knee osteoarthritis，and they can be used as reference for TCM syndrome and prognosis.

[Key words] Knee osteoarthritis；Th17 cell；Interleukin-6；Interleukin-1β；Panlong seven

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是全球范圍內(nèi)的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，國(guó)內(nèi)研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，55歲以上人群X線顯示有OA表現(xiàn)者約60%。隨著人口老齡化，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一種逐年上升的趨勢(shì)。目前尚沒(méi)有一種根治方法。疼痛和發(fā)病的機(jī)制與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌過(guò)多的IL-1、IL-6、前列腺素E1并釋放入血液有關(guān)，關(guān)節(jié)液中玻璃酸鈉的分子量、濃度均降低導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)發(fā)炎[1-2]。臨床上辯證分型有肝腎虧虛、精血虧虛、瘀血阻滯三種。治則：滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)氣活血、化瘀止痛。盤龍七片在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床實(shí)踐中已經(jīng)初步顯示出較好的療效和減少副作用[3-6]。本研究就盤龍七片對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎三種不同的中證型的療效及其與外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

KOA患者共75例，為2013年1月～2014年12月在廣州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科住院或者門診的患者，正常對(duì)照組為體檢健康者。KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007年版）》[7]?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）化膿性膝關(guān)節(jié)炎的患者；（2）并發(fā)病影響到關(guān)節(jié)者，如骨腫瘤、骨結(jié)核或有明顯急性外傷史而造成半月板損傷、韌帶斷裂及血管神經(jīng)損傷者；（3）膝關(guān)節(jié)局部有軟組織感染者；（4）妊娠或哺乳期婦女，伴有精神病，嚴(yán)重心、肺、腎及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)》[8]，KOA分3型：①淤血阻滯；②陽(yáng)虛寒凝；③腎虛隨虧。我們按照上述分型進(jìn)行分組。KOA的一般臨床資料，包括三種中醫(yī)證型性別、年齡、病程、膝關(guān)節(jié)病變的部位，以及正常對(duì)照組資料，見(jiàn)表1。三組和正常對(duì)照的性別和年齡上有可比性，KOA三種中醫(yī)證型的病程和膝關(guān)節(jié)病變部位有可比性，見(jiàn)表1。治療方案：予以口服盤龍七片（陜西盤龍制藥有限公司），每次3片，每日3次，飯后溫開(kāi)水送服。治療后6周進(jìn)行療效評(píng)估和抽取外周血進(jìn)行細(xì)胞因子和Th17細(xì)胞檢測(cè)。

1.2 療效評(píng)定

療效標(biāo)準(zhǔn)療效判定標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥的臨床研究指導(dǎo)原則》，療效判定為治愈、顯效、有效和無(wú)效，總有效率=（治愈+顯效+有效）/總例數(shù)×100%[9]。

1.3 Th17細(xì)胞和細(xì)胞因子的檢測(cè)

1.3.1 外周血標(biāo)本采集 正常對(duì)照組和患者在治療前、治療后6周空腹分別采集外周靜脈血標(biāo)本5Ml，F(xiàn)icoll-Hypaque 密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞（MNC）和血清，血清-30℃冰箱保存。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞 外周血Th17細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法參照我們的既往檢測(cè)方法和試劑盒說(shuō)明[10]。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)IL-17、IL-1β、IL-6濃度 血清IL-17、IL-1β、IL-6 濃度的檢測(cè)按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS16.2統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；多組間均值比較采用單因素方差分析，若方差齊總體均值比較采用F檢驗(yàn)，組間均值兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，若方差不齊，總體均值比較采用welch檢驗(yàn)，組間均值兩兩比較采用Dunnetts t3檢驗(yàn)；治療前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種中醫(yī)證型患者與正常對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較

三種中醫(yī)證型KOA患者在治療前，外周血Th17細(xì)胞比例、細(xì)胞因子濃度，三種證型均高于正常對(duì)照組（ΔP<0.05），淤血阻滯和陽(yáng)虛寒冷凝組高于腎虛髓空組（#P<0.05），淤血阻滯組高于陽(yáng)虛寒冷凝組（*P<0.05）。Th17細(xì)胞：腎虛髓空組、陽(yáng)虛寒冷凝組、陽(yáng)虛寒冷凝組與對(duì)照組比較， q=3.77、3. 89和3.93；陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.70、3.88；淤血阻滯組與陽(yáng)虛寒冷凝組比較，q=3.71；IL-17：腎虛髓空組、陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對(duì)照組比較，q=4.31、4.62、4.73；陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.72、4.18；淤血阻滯組與陽(yáng)虛寒冷凝組比較，q=3.78；IL-1β：腎虛髓空組、陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對(duì)照組比較，q=3.77、3.82、3.88；陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.75、3.88；淤血阻滯組與陽(yáng)虛寒冷凝組比較，q=4.97；IL-6：腎虛髓空組、陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對(duì)照組比較，q=3.79、3.84、4.18；陽(yáng)虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.74、3.83；淤血阻滯組與陽(yáng)虛寒冷凝組比較，q=3.77。見(jiàn)表2。

2.2 三種中醫(yī)證型患者治療前后比較

盤龍七片對(duì)3種中醫(yī)證型患者之間的總的療效有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=6.03，P<0.05），有效率呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)；有效治療者外周血Th17細(xì)胞比例、細(xì)胞因子濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而IL-1β在三組的有效治療前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。由于無(wú)效者例數(shù)少，未做治療前后比較。

2.3 三種中醫(yī)證型療效比較見(jiàn)表4。

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是引起中老年人膝關(guān)節(jié)疼痛的主要原因，本研究選擇年齡45歲以上的患者入組。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病屬“骨痹”范疇，臨床上辯證分型有三種[8]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)免疫因素在炎癥發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，并發(fā)現(xiàn)有許多中成藥包括盤龍七片在治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎方面有獨(dú)到之處。本研究發(fā)現(xiàn)，三種證型的患者外周血Th17細(xì)胞比例，IL-1β、IL-6和IL-17濃度均高于正常對(duì)照組；盤龍七片治療三種證型有效者，Th17細(xì)胞比例、IL-1β、IL-6和IL-17濃度均顯著降低，表明治療有效者通過(guò)抑制了Th17細(xì)胞的分化，減少Th17細(xì)胞分泌IL-17有關(guān)。

KOA的治療原則為：滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)氣活血、化瘀止痛，在臨床實(shí)踐中盤龍七片不失為治療骨痹的有效藥物，且與其降低患者外周血中IL-6和IL-17和IL-1β水平有關(guān)[3]。

眾所周知，IL-1β和IL-6及TNF-α與Th17細(xì)胞的分化發(fā)育和釋放的細(xì)胞因子密切相關(guān)，且Th1和Th17細(xì)胞通常在細(xì)胞免疫中相互作用，相互制約。最近研究表明Th17細(xì)胞在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中起到一定作用[11]，透明質(zhì)酸鈉注射液聯(lián)合塞來(lái)昔布膠囊降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清IL-1β、TNF-α水平，與臨床療效相關(guān)[12]。本研究的盤龍欺騙對(duì)Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子的作用，更加說(shuō)明了膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

RA和OA是滑膜炎為特征的慢性炎癥性疾病，人類滑膜組織中存在大量纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（ FLS），而在慢性關(guān)節(jié)炎的致病作用中起到主要的作用，F(xiàn)LS被TLR配體、炎癥因子，協(xié)調(diào)作用激活FLS，導(dǎo)致FLS損害關(guān)節(jié)的作用[13]。本組研究發(fā)現(xiàn)三組患者外周血中IL-6和IL-1β、IL-17高于正常對(duì)照組。KOA患者主要是IL-6、IL-1β濃度的增加促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，而Th17細(xì)胞分泌特征性的細(xì)胞因子IL-17進(jìn)一步加重KOA發(fā)展。而對(duì)于中醫(yī)三種證型患者IL-17濃度有顯著性差異，表明IL-17在不同證型中的作用不同 [14]。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)與此相對(duì)應(yīng)的三種證型的患者外周血Th17細(xì)胞的差異與IL-17差異相一致，治療有效者，Th17細(xì)胞比例、細(xì)胞因子濃度顯著降低，有可能作為預(yù)后的指標(biāo)之一。

本研究表明，外周血Th17、血清細(xì)胞因子含量在KOA各型中不同，瘀血阻滯型最高，陽(yáng)虛寒凝型次之，腎虛髓空型最低，各型之間存在顯著性差異，說(shuō)明腎虛髓虧型KOA多發(fā)生在早期階段，病情較輕；陽(yáng)虛寒凝型KOA多發(fā)生在中期階段，病情相對(duì)較重；血瘀阻滯型則多發(fā)生在晚期階段，病情程度嚴(yán)重[15]。在盤龍七片治療中，發(fā)現(xiàn)淤血阻滯、陽(yáng)虛寒冷凝和腎虛髓空型的總有效率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，且腎虛髓空型的療效顯著高于其他兩組，這可能與三種證型處于疾病發(fā)展不同階段有關(guān)，在臨床上提升若患者處于較晚期階段可以采用聯(lián)合用藥或物理治療等綜合治療，可望提高療效[5]。

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（收稿日期：2017-05-09）