陳大旗,付 華,殷祝平,吳 峰,薛 香,盧神州,b

(蘇州大學(xué) a.紡織與服裝工程學(xué)院；b.現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123)

研究與技術(shù)

絲素蛋白取向水凝膠的研制

陳大旗a,付 華a,殷祝平a,吳 峰a,薛 香a,盧神州a,b

(蘇州大學(xué) a.紡織與服裝工程學(xué)院；b.現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123)

采用絲素蛋白(SF)為原料，將枯草菌脂肽鈉(SS)與絲素蛋白混合以縮短絲素蛋白溶液凝膠時間，并在凝膠過程中對SF/SS共混溶液施加機械剪切力，制備一種取向的SF/SS水凝膠。結(jié)果表明：在剪切速率為55 s-1下，當剪切時間為0～20 min時，SF/SS混合體系中分子構(gòu)象呈現(xiàn)大量的無規(guī)卷曲，而在20 min至凝膠完全時，分子構(gòu)象由無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變；剪切誘導(dǎo)形成的SF/SS水凝膠具有顯著的取向網(wǎng)狀形貌，其取向方向的壓縮強度是非取向方向、未剪切水凝膠的3.5倍，其垂直于取向方向的耐切割性能是未剪切、取向方向的2倍。SF/SS取向水凝膠可用于神經(jīng)細胞、骨細胞的培養(yǎng)，以及缺陷肌肉、韌帶組織的修復(fù)。

絲素蛋白；枯草菌脂肽鈉；剪切力；取向性；水凝膠；機械性能

水凝膠具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部呈多孔狀，大孔徑達0.1～1 μm，小孔徑達10～100 nm[1]，能夠吸納大量水分，含水率高于90%[2-4]。水凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是通過分子鏈糾纏、次價鍵交聯(lián)在一起，次價鍵包括離子鍵、氫鍵或疏水作用[5-7]。由于水凝膠具有一定強度、形狀穩(wěn)定，具有良好的生物相容性、水透氣性、細胞黏附性和生物可降解性，可以應(yīng)用于人工皮膚、組織工程支架材料、藥物釋放、微針系統(tǒng)、光學(xué)器件和生物傳感器薄膜等[8-10]。

家蠶絲素蛋白(silk fibroin,SF)可以應(yīng)用于生物醫(yī)用材料，其安全可靠性已被深入研究[11]。蠶絲用作手術(shù)縫合線已經(jīng)被使用了近一個世紀，其對機體無過敏或免疫反應(yīng)[12-13]。絲素蛋白水凝膠是再生絲素蛋白溶液在一定條件下發(fā)生凝膠化制備而成。其凝膠化過程主要受絲素蛋白溶液的濃度、溫度、pH值、金屬離子、表面活性劑和剪切作用等因素的影響，可以通過增加絲素蛋白溶液濃度、升高溫度、降低pH值、添加金屬離子、表面活性劑及施加剪切力等促進其凝膠化過程[14]。在無外界因素作用下，純絲素蛋白溶液凝膠時間可長達一個月[15]，且強度較差，因此極大限制其應(yīng)用范圍。陰離子表面活性劑與再生絲素蛋白溶液共混后，誘發(fā)絲素蛋白分子鏈快速伸展，并自組裝成穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)[16]。絲蛋白分子受到剪切作用，其大分子由無規(guī)線團轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)β-折疊結(jié)構(gòu)，相鄰大分子鏈上形成氫鍵，使大分子鏈進一步形成β-折疊片，然后形成一種不溶于水的三維β-折疊結(jié)構(gòu)(β層晶)并完全纖維化[17-18]?？莶菥拟c(sodium surfactin,SS)是一種生物表面活性劑，無毒，可生物降解，且具有良好的生物相容性，能快速誘導(dǎo)絲素蛋白形成凝膠[19]。雖然添加表面活性劑可以促進其凝膠化的進程，但是其水凝膠結(jié)構(gòu)主要靠離子鍵、氫鍵作用維持，沒有形成一個穩(wěn)定的取向結(jié)晶結(jié)構(gòu)。雖然超聲波能夠使絲素蛋白溶液分子構(gòu)象瞬時轉(zhuǎn)變形成凝膠[20-21]，但同樣很難形成具有取向性的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，其水凝膠力學(xué)性能不能顯著得到提高。

本研究采用枯草菌脂肽鈉促使再生絲素蛋白溶液凝膠，通過對溶液施加剪切作用，使得絲素蛋白凝膠產(chǎn)生取向，最終制得取向性水凝膠。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

材料：家蠶繭殼(蘇州先蠶絲綢生物科技有限公司)，無水碳酸鈉、碳酸氫鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，溴化鋰(天成化工有限公司)，枯草菌脂肽鈉(安徽帝元生物科技有限公司)，環(huán)己烷(江蘇強盛化工有限公司)，透析袋(上海普宜生物技術(shù)有限公司，截留分子量8 000～10 000D)，液氮(樂山東亞機電工貿(mào)有限公司)，實驗用水均為去離子水。

儀器：DF-101S集熱式磁力恒溫攪拌器(河南鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)，DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(廣東醫(yī)療器械廠)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司)，VIRTIS Genesis 25-LE型冷凍干燥機(美國VIRTIS公司)，Synergy HT型多功能酶標儀(美國Bio-Tek Instruments公司)，F(xiàn)ormd. VLT.FYeezy 700型超低溫冰箱(Thermo Electron公司)，TM3030臺式掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，Nicolet 5700型傅立葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)，全自動X′PERT PRO MPD型X射線衍射儀(荷蘭帕納科公司，PANalytiacl Company)，DCAT-21型表面張力儀(德國DataPhysics公司)，F(xiàn)M4P-TCSPC熒光光譜儀(英國Edinburgh公司)，XB320C型精密電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)，TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀(美國Food Technology Corporation)，DM4000M型偏光顯微鏡(Leica公司)。

1.2 材料制備與性能測試

1.2.1 再生絲素蛋白溶液和枯草菌脂肽鈉溶液的制備

稱取80 g家蠶繭殼，放入4 000 mL的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液中(兩者的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.75 g/L)，在98～100 ℃條件下微沸30 min后，取出繭殼并用去離子水搓洗干凈，再重復(fù)兩次上述操作。然后將脫膠后的絲素蛋白纖維取出，并置于60 ℃的烘箱中烘干(至少6 h)，即得純絲素纖維。將純絲素纖維在(65±2) ℃下溶解于摩爾濃度9.3 moL/L的溴化鋰溶液中，浴比為20：100，溶解時間約1 h，待其冷卻后取出裝入截留分子量8 000～10 000 D的透析袋中，置于去離子水中透析3～4 d，用脫脂棉過濾得到純絲素蛋白溶液，放在4 ℃冰箱備用[22]。制備流程如圖1所示。

將枯草菌脂肽鈉配制成100 mg/mL水溶液，同樣置于4 ℃冰箱備用。

圖1 再生絲素蛋白水溶液的制備Fig.1 Preparation of regenerated silk fibroin solution

1.2.2 凝膠時間的測定

將絲素蛋白溶液(SF)與SS溶液按一定的比例混合，取300 μL置于24孔板中并用100 μL環(huán)己烷密封，每組6個平行樣，然后置于Synergy HT型多功能酶標儀上，在37 ℃、波長為550 nm條件下測試。

1.2.3 取向與非取向絲素蛋白水凝膠的制備

在凝膠制備前，先將再生絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)制為42 mg/mL，然后與質(zhì)量濃度為100 mg/mL的枯草菌脂肽鈉溶液按20：1的比例混合均勻，并轉(zhuǎn)移至直徑為80 mm圓柱型玻璃皿中。經(jīng)抽真空后，置于37 ℃恒溫水域中，并用直徑為75 mm圓盤攪拌頭施加剪切作用，轉(zhuǎn)速為145 r/min，30 min后即可制得取向絲素蛋白水凝膠。同時將另一組經(jīng)抽真空處理后的混合溶液，置于37 ℃恒溫箱中靜置約50 min形成凝膠，作為對照組。水凝膠制備的流程如圖2所示。

圖2 取向與非取向絲素蛋白水凝膠的制備Fig.2 Preparation of orientational and non-orientational SF hydrogels

1.2.4 凝膠過程中絲素蛋白分子構(gòu)象的變化

將枯草菌脂肽鈉溶液與再生絲素蛋白溶液混合后，施加轉(zhuǎn)速為145 r/min的剪切作用，按剪切0、10、20、30 min進行取樣，再迅速將樣品置于液氮冷凍并干燥。將上述凍干后的不同時間點的凝膠樣品研磨成粉末，直徑小于80 μm，采用KBr壓片法制樣，并在Nicolet 5700智能型傅立葉變換紅外光譜儀上進行測試，掃描400～4 000 cm-1內(nèi)的吸光度，即可得到紅外吸收光譜。將凝膠樣品研磨成粉后壓入樣品架內(nèi)，采用全自動X′PERT PRO MPD型X射線衍射儀分析樣品的廣角X射線衍射圖譜[23]。測試條件：CuKα射線，管電流35 mA，管電壓40 kV，掃描速度為8°/min，掃描2θ=5°～45°間的衍射強度曲線[24]。

1.2.5 水凝膠的形貌觀察

將制備的取向絲素蛋白水凝膠在距離中心O點37 mm處沿b、c方向制取凝膠樣品，尺寸為9 mm(直徑)×9 mm(高)的圓柱體，再分別將凝膠樣品沿平行于圓形截面切成0.5 mm的薄片，如圖3所示。同樣將非取向水凝膠切成0.5 mm的薄片，將濕態(tài)薄片樣品置于DM4000M型偏光顯微鏡上測試；電鏡測試薄片樣品分別置于液氮中冷凍，經(jīng)真空機干燥后的凝膠樣品，表面噴金90 s后取出，采用日立TM3030型掃描電子顯微鏡[25]，觀察其截面形貌。剪切速率可按下式[26]計算得到，其中參數(shù)示意如圖4所示：

(1)

式中：γ為剪切速率，s-1；n為圓盤轉(zhuǎn)速，r/min；r為圓盤半徑，mm；d為間隙寬，mm。

圖3 測試凝膠樣品制取示意Fig.3 Hydrogel sample making

圖4 參數(shù)示意圖和圓柱型凝膠樣品取樣Fig.4 Diagrammatic sketch of parameters and taking of cylindroid hydrogel samples

1.2.6 壓縮力學(xué)性能測試

將制備的取向絲素蛋白水凝膠和對照組水凝膠，如圖4所示用打孔模具沿a、b、c方向?qū)⑵渲瞥沙叽绱笾聻? mm(直徑)×9 mm(高)的圓柱型凝膠樣品，并于室溫在TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀上進行壓縮力學(xué)測試。其壓縮檢測速度為10 mm/min，25 mm(直徑)的圓柱型擠壓檢測探頭，壓縮量為90%，感應(yīng)力為0.05 N，檢測精度為0.015%，每種樣品作六個平行樣，得到位移-載荷數(shù)據(jù)。壓縮強度可按下式計算得到：

(2)

式中：σc為壓縮強度，MPa；F為最大破壞載荷，N；d為試樣直徑，mm。

1.2.7 切割性能測試

同理，按圖4制成圓柱型凝膠樣品，并于室溫在TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀上進行切割測試。其切割檢測速度為10 mm/min，刀鋒角度為44°的切割檢測單刀剪切探頭，切割量為95%，感應(yīng)力為0.05 N，檢測精度為0.015%，每種樣品作六個平行樣，得到位移-載荷數(shù)據(jù)。同樣按式(2)計算每個樣品的壓縮強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SF/SS混合溶液的凝膠時間

根據(jù)Synergy HT型多功能酶標儀測得的OD值隨時間變化曲線，取OD值變化最快時間作為凝膠時間。在37 ℃條件下，不同終濃度的SS(0、2、4 mg/mL)與絲素蛋白(終濃度均為40 mg/mL)混合溶液的凝膠時間如表1所示。

表1 不同SS質(zhì)量濃度下共混溶液的凝膠時間Tab.1 Gelation time taken by blended solution of different SS mass concentrations

注：SF的終濃度為40 mg/mL，轉(zhuǎn)速為145 r/min，OD值檢測溫度37 ℃。

從表1可知，隨著SS質(zhì)量濃度的增加，SF/SS混合溶液的凝膠時間相應(yīng)縮短，且剪切作用使其凝膠時間縮短。當SS的終濃度為0時，純絲素蛋白溶液24 h內(nèi)未能形成凝膠，凝膠時間通常需要1周至1月[27]。當SS加入后，SF/SS混合溶液的凝膠時間瞬間縮短，且隨SS質(zhì)量濃度的增加，可在1 h內(nèi)形成凝膠；相對未施加剪切作用的混合溶液，剪切作用縮短了凝膠時間，這是由于剪切提高了SF溶液膠凝轉(zhuǎn)變的動力學(xué)性能。

2.2 水凝膠形貌觀察

掃描電鏡(SEM)是常用于觀察SF/SS水凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形貌的一種測試手段，偏光顯微鏡是一種用于觀察材料取向結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法。制備取向SF/SS水凝膠，其中SF和SS的終濃度分別為40、5 mg/mL，剪切速率為55 s-1。圖5(a)(b)分別為未經(jīng)剪切作用的SF/SS共混水凝膠橫截面、縱截面。圖6(a)(b)和(c)分別為經(jīng)剪切作用形成的SF/SS共混水凝膠的表面、平行于取向方向的截面、垂直于取向方向的截面；圖6(d)為平行于取向方向截面的偏光照片。

由圖5(a)(b)可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)剪切作用形成的水凝膠橫截面和縱截面，層次清晰，有褶皺，孔的形狀比較規(guī)則，且尺寸大致均勻。由圖6(a)可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)剪切作用誘導(dǎo)形成的水凝膠，表面有明顯的互相平行排列的層狀結(jié)構(gòu)，且孔的形狀被拉伸成扁平狀。由圖6(b)(c)可以看到，垂直于取向方向的截面孔形狀相對規(guī)則，且沒有顯著的取向3D結(jié)構(gòu)；而在平行于取向方向上的截面，其孔的形狀有明顯的剪切拉伸變形，且具有取向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這是由于剪切作用使絲素蛋白分子鏈產(chǎn)生拉伸，形成連續(xù)取向網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不連續(xù)的纖維結(jié)晶結(jié)構(gòu)，再從局部取向的結(jié)晶結(jié)構(gòu)到形成整體的取向結(jié)構(gòu)[28-29]。再由圖6(d)可以發(fā)現(xiàn)，在剪切力的作用下，形成相互平行排列、粗細均勻且定向取向的纖維結(jié)構(gòu)，與電鏡照片結(jié)果一致。結(jié)果表明，有規(guī)律性地剪切作用于枯草菌脂肽鈉和絲素蛋白混合溶液形成的水凝膠，不僅使得蛋白分子鏈有明顯的取向性，還有可能顯著提高水凝膠的力學(xué)性能。此外，由于細胞可以沿水凝膠表面的纖維呈現(xiàn)取向黏附，形成接觸引導(dǎo)[30]，為組織工程修復(fù)取向性組織提供一種可行性支架材料。

圖5 SF/SS未取向水凝膠的電鏡照Fig.5 Electronic microscope photos of non-orientational SF/SS hydrogels

圖6 水凝膠取向形態(tài)觀察Fig.6 Morphological observation of orientation of hydrogels

2.3 凝膠過程中構(gòu)象的變化

圖7(a)(b)分別表示SF/SS溶液在剪切0、10、20 min和30 min后絲素蛋白對應(yīng)的傅立葉紅外吸收光譜(FTIR)和X射線衍射曲線(XRD)，SF/SS共混溶液中SF和SS終濃度分別為40、5 mg/mL，溶液溫度為37 ℃，剪切速率為55 s-1。由圖7(a)所示，SF溶液和SS溶液共混后，剪切0～20 min，在1 649 cm-1(酰胺Ⅰ)，1 548 cm-1(酰胺Ⅱ)附近具有無規(guī)卷曲特征峰[31]；剪切時間30 min后，在1 627 cm-1(酰胺Ⅰ)，1 529 cm-1(酰胺Ⅱ)附近出現(xiàn)典型的β-折疊結(jié)構(gòu)[31]；0～30 min在1 234 cm-1(酰胺Ⅲ)，694 cm-1(酰胺Ⅳ)附近始終有典型β-折疊峰的出現(xiàn)。說明在剪切0～20 min內(nèi)，絲素蛋白分子中呈現(xiàn)大量的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而20 min后，蛋白分子構(gòu)象由無規(guī)卷曲逐漸向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。由圖7(b)可以看出，0～30 min內(nèi)，均在10°～30°的衍射角范圍內(nèi)有一個寬峰；0～20 min內(nèi)，在20.5°均沒有明顯的吸收峰，而在21.4°附近有吸收峰，即表現(xiàn)為無規(guī)卷曲[32]。20 min后，在20.5°附近呈現(xiàn)明顯的尖峰，說明凝膠的形成伴隨著β-折疊結(jié)構(gòu)的增加。此外，剪切30 min后，在24.2°附近也呈現(xiàn)了較弱的特征峰，同樣表現(xiàn)為β-折疊結(jié)構(gòu)[32]。結(jié)合XRD和FTIR的結(jié)果表明，在剪切作用下，SF/SS共混溶液凝膠化過程中，凝膠形成前表現(xiàn)為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，開始形成凝膠至完全凝膠，絲素蛋白分子構(gòu)象由無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，具備典型的SilkⅡ結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

圖7 凝膠過程中的結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Structure change during gelling process

2.4 取向水凝膠力學(xué)性能分析

在37 ℃下，SF/SS混合溶液在55 s-1剪切速率下制備水凝膠，其中SF和SS終濃度分別為40、5 mg/mL。在室溫下，采用TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀對水凝膠的力學(xué)性能進行測試。圖8(a)為枯草菌脂肽鈉/絲素蛋白共混水凝膠的對照組(未剪切)、a方向(非取向方向)、b方向(取向方向)、c方向(非取向方向)樣品的壓縮強度柱狀圖；圖8(b)為對照組、平行于取向方向、垂直于取向方向的樣品耐切強度柱狀圖。由圖8(a)可知，經(jīng)剪切作用后形成的水凝膠，其壓縮強度高于未剪切形成的水凝膠，且取向方向的強度明顯提高，其大小約為對照組的3.5倍，而兩個非取向方向的強度相差不大。由圖8(b)可知，經(jīng)剪切作用形成的水凝膠，其垂直于取向方向的耐切割強度比對照組和平行于取向方向都要大，且大約2倍；而對照組和平行于取向方向的耐切割性能相差不大。結(jié)合FTIR、XRD及凝膠電鏡形貌觀察和偏光圖片，結(jié)果表明：經(jīng)剪切作用使得絲素蛋白分子構(gòu)象由大量的無規(guī)卷曲向穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，最終形成各向異性的共混水凝膠，具有明顯的取向結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)相互平行排列的纖維結(jié)晶結(jié)構(gòu)，故相對未經(jīng)剪切形成的水凝膠而言，其壓縮力學(xué)性能得到明顯改善；正是由于剪切應(yīng)力的引入，水凝膠具有取向性纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[33]，沿著取向方向具有較高的力學(xué)性能，故垂直于取向方向所受的耐切割性能也相應(yīng)提高。

圖8 不同SF/SS水凝膠樣品機械性能Fig.8 Mechanical properties of different SF/SS hydrogel samples

3 結(jié) 論

較傳統(tǒng)高分子水凝膠而言，本研究采用物理機械剪切作用制備的取向絲素蛋白水凝膠，具有顯著的取向纖維排列結(jié)構(gòu)，并賦予其優(yōu)異的力學(xué)性能。規(guī)律性物理剪切作用，既縮短了SF/SS共混溶液的凝膠時間，又滿足組織工程支架材料的基本要求。SF/SS取向水凝膠，具有的高度取向纖維結(jié)構(gòu)，可以控制細胞在二維環(huán)境下取向生長，又因其具有規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)，有利于細胞滲透和遷移至內(nèi)部，從而誘導(dǎo)細胞三維生長。

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Preparationoforientationalsilkfibroinhydrogels

CHEN Daqia,FU Huaa,YIN Zhupinga,WU Fenga,XUE Xianga,LU Shenzhoua,b

(a.College of Textile and Clothing Engineering; b.National Engineering Laboratory for Modern Silk,Soochow University,Suzhou 215123,China)

In this study,silk fibroin (SF) was adopted as raw material,bacillus subtilis sodium surfactin (SS) was blended with silk fibroin to shorten the gelation time of SF solution,and mechanical shear force was exerted on the blended solution of SF/SS in the gelation process to prepare an orientational SF/SS hydrogel. The results suggest that the molecular conformation of the SF/SS blending system takes on random coil it is subject to shearing for 0 min to 20 min at the rate of 55 s-1,while the molecular conformation transforms from random coil into β-sheet conformers during the period that it is subject to shearing for 20 min until completely gelling; the shear-induced SF/SS hydrogels appears to be of obvious orientational gel skeleton/network morphology,its compressive strength in the direction of orientation is 3.5 times over that of unsheared hydrogel in the direction of non-orientation,and its cut resistance in the direction vertical to the direction of orientation is twice over that of unsheared hydrogel in the direction of orientation. SF/SS orientational hydrogels can be applied for culture of nerve cell and bone cell,and repairing of defect in muscle and ligament tissues.

silk fibroin; bacillus subtilis sodium surfactin; shear force; orientation; hydrogels; mechanical property

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.08.001

2016-11-19;

:2017-06-13

國家自然科學(xué)基金項目(51373114)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大資助項目(15KJA540001)

TS102.33；TB383

:A

:1001-7003(2017)08-0001-07 < class="emphasis_bold">引用頁碼

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