李廷芳，吳淑華，季英華，趙文浩，周益軍，郭青云

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014； 3.青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016)

?

青海BYDV-GAV青稞分離物基因組克隆及結(jié)構(gòu)特征分析

李廷芳1,2,3，吳淑華2，季英華2，趙文浩2，周益軍2，郭青云1,3

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014； 3.青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016)

大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses，BYDVs)病是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生危害的禾谷類作物病毒病害。2014年筆者在對(duì)青海重要作物病毒病調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)田間青稞作物上有疑似BYDVs危害的癥狀，利用BYDVs引物對(duì)田間采集的9份典型癥狀病樣進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果均擴(kuò)增到目的條帶(約300 bp)，隨機(jī)抽選樣品進(jìn)行序列測(cè)定，BLAST分析結(jié)果顯示其與BYDV-GAV同源性最為接近(99.2%)。為進(jìn)一步明確該分離物的分類地位及基因組結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)已測(cè)定的BYDV-GAV序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，利用分段法克隆了其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng)為5 683 bp，具有典型的黃癥病毒屬的特征，編碼6個(gè)ORF，有4個(gè)非編碼區(qū)(UTR)。基因組序列聚類進(jìn)化分析結(jié)果顯示，其與BYDV-GAV聚類于同一分支，與中國(guó)陜西渭南小麥分離物親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果說(shuō)明，該分離物是BYDV-GAV的一個(gè)分離物，這是青海BYDV-GAV青稞分離物全基因組的首次報(bào)道。

大麥黃矮病毒；青稞；BYDV-GAV；青海

大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses，BYDVs)是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生危害的植物病毒，主要由蚜蟲以持久非增殖方式傳播，可侵染小麥、大麥、燕麥、玉米等150多種禾本科植物，伴隨葉片黃化和植株矮縮等發(fā)病癥狀，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。由BYDVs危害麥類作物引起黃矮病早在1951年于美國(guó)加州被報(bào)道過，而在我國(guó)于20世紀(jì)60年代在陜西、甘肅小麥上才開始出現(xiàn)該病危害，后陸續(xù)擴(kuò)散蔓延，目前已成為北方麥類作物上的流行性病害，受害小麥常減產(chǎn)40%左右[4-5]。根據(jù)病毒血清學(xué)、基因組結(jié)構(gòu)及傳播介體的?；缘忍卣?，BYDVs分為BYDV-PAV、-MAV、-PAS、-GAV、-RPV、-GPV、-RMV、-SGV等種[6-7]，分類上它們都屬于黃癥病毒科的成員，其中BYDV-PAV、-MAV和-PAS屬于黃癥病毒屬(Luteovirus)的確定種，BYDV-GAV屬黃癥病毒屬暫定種，BYDV-RPV(新名稱Cereal yellow dwarf virus-RPV，CYDV-RPV)屬于馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的確定種，BYDV-GPV、-RMV和-SGV屬黃癥病毒科成員，暫時(shí)未列入任何屬[8]。目前，我國(guó)報(bào)道的有4種，分別為BYDV-GAV、-GPV、-PAV和-RMV[9-11]。其中，BYDV-GPV在血清學(xué)上與其他病毒不相關(guān)[11-12]，是我國(guó)特有種[9, 13-14]，主要由禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi)和麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)以持久非增殖方式傳播[15]。BYDV-GAV主要由麥二叉蚜(S.graminum)和麥長(zhǎng)管蚜(Sitobionavenae)傳播[16]，與BYDV-MAV血清學(xué)相關(guān)[10]。

青稞是禾本科大麥屬的一種裸大麥(HordeumvulgareL.var.nudumHook-.F.)，在青海、甘肅、四川、西藏、云南等高原地區(qū)有廣泛種植，青海種植面積已達(dá)到39.3×103hm2，是當(dāng)?shù)刂匾Z食作物之一[17-19]。近年來(lái)，黃矮病在青稞上的危害在各種植區(qū)屢有報(bào)道，造成青稞產(chǎn)量減少，局部地區(qū)甚至有絕收的報(bào)道[18]。但我國(guó)針對(duì)青稞黃矮病的研究還相對(duì)較少，目前尚未有針對(duì)該類病毒的全基因組序列相關(guān)報(bào)道。我國(guó)BYDVs的種類較多，開展此類工作有利于明確病毒種類、指導(dǎo)生產(chǎn)防控。筆者對(duì)2014年在青海地區(qū)青稞作物上采集的9份典型病樣利用BYDVs引物進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，經(jīng) BLAST分析結(jié)果顯示其與BYDV-GAV同源性最為接近(99.2%)。為進(jìn)一步明確該分離物的基因組結(jié)構(gòu)特征及分類地位，利用分段法克隆其全基因組序列后對(duì)序列結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

2014年6月采集青海省海東市田間表現(xiàn)為葉片黃化、植株輕微矮縮的發(fā)病青稞葉片，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學(xué)試劑

Trizol Reagent購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTMRT Master Mix和DNA LATaq酶購(gòu)自大連寶生物公司；其他常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA的提取

取典型癥狀樣品0.1 g，采用Trizol法提取總RNA。將RNA溶于35 μL 0.1%DEPC水中，檢測(cè)RNA的含量和質(zhì)量后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BYDVs的RT-PCR檢測(cè)

樣品RNA反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa)進(jìn)行，反應(yīng)體系：5×PrimeScriptTMRT Master Mix buffer 2 μL，500 ng樣品RNA，最終DEPC水定容10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物(PAVL1/PAVR1)及反應(yīng)體系參照Deb等[20]。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，培清JS-680D全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，編號(hào)為14Qh1-1和14Qh8-1的陽(yáng)性樣品送金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 BYDVs青海分離物基因組的克隆

根據(jù)1.2.2中BYDVs檢測(cè)結(jié)果及相應(yīng)的序列分析結(jié)果設(shè)計(jì)BYDVs青海分離物的全基因組擴(kuò)增引物，利用分段克隆法擴(kuò)增其全基因組，其中BYD-1sbF(5′-GGCCTGCAGGTAGTGAAG ATTGACCATCTCACAAAAG-3′)與BYD-1R(5′-GCGGTTATTTCTACGGCCTACT-3′)組合(退火溫度54 ℃)擴(kuò)增第一個(gè)片段14Qh8-1F(2 888 bp)，BYD-2bsF(5′-GGTGTACATTAG CTCTCTCCTACTTYAT-3′)與BYD-2xmR(5′-CCCCCGGGGGGTTGCCGAACTGCTCTTT-3′)組合(退火溫度55 ℃)擴(kuò)增第二個(gè)片段14Qh8-1R(2 892 bp)。PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max 12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，最終DEPC水定容至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，54/55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸3.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，由Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化，回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans10，挑選陽(yáng)性克隆，送金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 序列分析

測(cè)序結(jié)果BLAST分析由NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)完成，序列拼接及同源性分析分別由DNASTAR軟件的Seqman、MegAlign完成，序列多重比對(duì)、聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件的臨近法(Neighbor-Joining)完成，進(jìn)化樹的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株癥狀

田間發(fā)病青稞植株葉尖多表現(xiàn)明顯的黃化，有些甚至出現(xiàn)紅化(圖1)，早期侵染的植株會(huì)伴有矮化癥狀，影響青稞抽穗，對(duì)產(chǎn)量影響較大。在調(diào)查過程中還發(fā)現(xiàn)，雖然田塊間發(fā)病程度存在差異，但各調(diào)查田塊中均有植株發(fā)病，矮化癥狀也零星見到，暗示該病害在當(dāng)?shù)厍囡弦殉食０l(fā)態(tài)勢(shì)。

圖1 青海省海東市受BYDVs侵染的青稞病株癥狀Fig.1 Symptom of the hulless barley infected by BYDVs in Haidong, Qinghai province

2.2 病樣的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

參照Deb等[20]的方法對(duì)田間采集的9份典型癥狀樣品中的BYDVs進(jìn)行了RT-PCR分子檢測(cè)，結(jié)果(圖2)顯示，BYDV-PAV引物擴(kuò)增到了約300 bp的目的片段，與預(yù)期目的條帶大小符合。為了進(jìn)一步明確檢測(cè)到的BYDVs種類，隨機(jī)抽選樣品(14Qh1-1和14Qh8-1)進(jìn)行序列測(cè)定，序列BLAST分析結(jié)果顯示，它們與BYDV-GAV(EU402390)的同源性最高，相似性達(dá)99.2%。

M:核酸分子量標(biāo)準(zhǔn) DL4500;14Qh1-1至14Qh1-9為9份感病青稞樣品; CK為健康青稞樣品；箭頭所指為目的片段。下同。
M: DNA marker DL4500; 14Qh1-1-14Qh1-9 indicated nine samples of infected hulless barley; CK indicated samples of healthy hulless barley;The target fragments is pointed with an arrow;The same in Fig.3.
圖2 引物PAVL1/PAVR1的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 Results of PCR amplified with primers PAVL1/PAVR1

2.3 全基因組序列克隆結(jié)果

以典型樣品14Qh8-1總RNA為模板，利用分段的兩對(duì)引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR進(jìn)行RT-PCR，分別擴(kuò)增到兩條大小約2.8 kb的特異性目的片段(圖3)。片段回收純化后連接pMD18-T載體，PCR法篩選陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司測(cè)定序列。

14Qh8-1-F和14Qh8-1-R: 用引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR擴(kuò)增出的片段。
14Qh8-1-F and 14Qh8-1-R indicated the target fragments amplified with BYD-1sbF/BYD-1R and BYD-2bsF/BYD-2xmR, respectively.
圖3 引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 Results of PCR amplified with primers BYD-1sbF/BYD-1R and BYD-2bsF/BYD-2xmR

2.4 基因組結(jié)構(gòu)分析

利用Seqman軟件將2.3測(cè)定的序列進(jìn)行拼接，獲得14Qh8-1的全基因組序列。序列分析結(jié)果顯示，14Qh8-1的基因組全長(zhǎng)為5 683 bp，編碼6個(gè)ORF，ORF1(140～1 159 bp)編碼一個(gè)含339個(gè)氨基酸、分子量約39 kDa的蛋白P1；ORF2與ORF1會(huì)通讀(140～2 742 bp)，編碼一個(gè)含867個(gè)氨基酸、分子量約99 kDa的融合蛋白P1-P2，是病毒復(fù)制酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF3(2 856～3 455 bp)編碼一個(gè)含199個(gè)氨基酸、分子量約22 kDa的蛋白P3，是病毒的外殼蛋白(Coat protein，CP)；ORF3內(nèi)部含有一個(gè)較小的閱讀框ORF4(2 893～3 357 bp)，編碼一個(gè)含154個(gè)氨基酸、分子量約17 kDa的蛋白P4，是病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein，MP)；ORF3、ORF4、ORF5(2 856～4 832 bp)會(huì)以通讀的方式編碼一個(gè)含659個(gè)氨基酸、分子量約72 kDa的蛋白P3-P5，是病毒的蚜傳相關(guān)蛋白(Aphid transmission protein)；ORF6(1 939～5 070 bp)編碼一個(gè)含43個(gè)氨基酸、分子量約4.3 kDa的蛋白P6。除6個(gè)ORF外，14Qh8-1還含有4個(gè)非編碼區(qū)(Untranslated regions)，其中3′和5′末端各一個(gè)，一個(gè)位于RdRp與CP之間，另一個(gè)位于蚜傳蛋白與P6之間。

2.5 同源性及聚類進(jìn)化分析

對(duì)14Qh8-1進(jìn)行BLAST分析可知，其與BYDV-GAV的同源性最高(98.9%)。將14Qh8-1與已報(bào)道的黃癥病毒屬相關(guān)病毒及其分離物(結(jié)合黃癥病毒屬分類標(biāo)準(zhǔn)[8])及BYDVs在我國(guó)的發(fā)生種類進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，14Qh8-1與中國(guó)報(bào)道的BYDV-GAV同源性最高(97.0%～98.9%)。將14Qh8-1與黃癥病毒屬的成員聚類進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果也顯示，14Qh8-1聚類到BYDV-GAV分支中(圖4)。說(shuō)明14Qh8-1是BYDV-GAV的一個(gè)分離物。

在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上，BYDV-GAV分離物聚類到3個(gè)簇(圖4)：陜西渭南分離物(05WN2、05WN3、05WN5)、陜西咸陽(yáng)楊凌分離物(05YL6)、陜西寶雞扶風(fēng)分離物(FF1)及38W、30W等分離物聚類于一個(gè)簇(Cluster I)；陜西咸陽(yáng)楊凌分離物(YL4)單獨(dú)形成第二個(gè)簇(Cluster II)；陜西寶雞鳳翔分離物(04FX1)、陜西渭南分離物(05WN7、WN5)、陜西安康分離物(AK2)、甘肅天水分離物(TS1)聚類于第三個(gè)簇(Cluster III)。其中，14Qh8-1聚類于第一個(gè)簇(Cluster I)，與陜西渭南分離物(05WN5、05WN2、05WN3)分離物的同源性較近，與其他分離物的同源性相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討 論

大麥黃矮病毒是危害麥類作物的一類重要病毒病，目前我國(guó)報(bào)道的有四種[9]，其中，BYDV-GAV是根據(jù)Rochow[22]系統(tǒng)命名的一個(gè)中國(guó)分離物，分類上屬于黃癥病毒屬的暫定種。近年來(lái)的調(diào)查結(jié)果顯示，該病毒在我國(guó)很多地方上升為當(dāng)?shù)卮篼滭S矮病毒的優(yōu)勢(shì)種群[11]。本文對(duì)青海分離的一個(gè)青稞分離物14Qh8-1全基因組序列進(jìn)行了克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其為BYDV-GAV的一個(gè)分離物。參照Deb等[20]的方法對(duì)樣品進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)，采用的引物包括PAVL1/PAVR1(檢測(cè)BYDV-PAV)、MAVL1/MAVR1(檢測(cè)BYDV-MAV)、SGVL2/SGVR2(檢測(cè)BYDV-SGV)、RMVL1/RMVR2(檢測(cè)BYDV-RMV)和RPVL/RPVR(檢測(cè)CYDV-RPV)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAVL1/PAVR1和MAVL1/MAVR1都有檢出目的條帶(部分結(jié)果未呈現(xiàn))，而測(cè)序結(jié)果顯示序列既不是BYDV-PAV，也不是BYDV-MAV，而都與BYDV-GAV同源性最高，說(shuō)明這兩對(duì)引物在BYDV-GAV上也有匹配位點(diǎn)，而針對(duì)14Qh8-1序列的分析結(jié)果也印證了這一結(jié)論(圖5)。除Deb等[20]的方法外，筆者也采用馬鈴薯卷葉病毒屬[23]及黃癥病毒屬[24]的通用引物進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃癥病毒屬的通用引物也可以檢測(cè)到目的條帶，測(cè)序結(jié)果也顯示其與BYDV-GAV(EU402389)的同源性最高(99.8%)。

■：本試驗(yàn)測(cè)定的序列；各枝上的數(shù)字是1 000次Bootstrap自導(dǎo)復(fù)制的置信度。
■: The sequence studied in this research；Bootstrap confidence values of each branch are indicated above the branch.
圖4 根據(jù)病毒核苷酸序列一致性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence identities ofLuteovirus

圖5 14Qh8-1引物結(jié)合位點(diǎn)的分析Fig.5 Analysis of the possible binding sites of primers on 14Qh8-1

目前在我國(guó)發(fā)生的四種BYDVs中，已有多個(gè)全基因組序列得到了克隆[10-11, 25-26]，這些工作不僅為我國(guó)BYDVs的分類提供了基礎(chǔ)，也為針對(duì)病毒培育抗性品種及提出有針對(duì)性的防控策略奠定了基礎(chǔ)，但這些研究大多集中在小麥等作物上，青稞上的研究就相對(duì)較少，雖然也有報(bào)道顯示大麥黃矮病毒也可以侵染青稞[18-19]，但尚未見到相關(guān)基因組報(bào)道。14Qh8-1是第一個(gè)報(bào)道的BYDV-GAV青稞分離物基因組。在對(duì)其與國(guó)內(nèi)BYDV-GAV分離物聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，它們共同聚類于一個(gè)大的分枝，該分枝雖然可以分為三個(gè)簇，但各分離物在進(jìn)化關(guān)系上既沒有表現(xiàn)出地理相關(guān)性，也沒有表現(xiàn)出寄主相關(guān)性。分析可能的原因有兩個(gè)：第一，BYDV-GAV目前僅在我國(guó)有報(bào)道，其基因組序列相對(duì)保守(同源性超過97.0%)，可能未出現(xiàn)地理隔離或者寄主?；?；第二，目前有報(bào)道基因組的BYDV-GAV分離物數(shù)量有限，主要集中在陜西、甘肅等西北地區(qū)，而寄主目前主要集中在小麥上，樣本量小可能是導(dǎo)致規(guī)律不明顯的原因。在BYDV-GAV第一個(gè)簇中，14Qh8-1與陜西渭南分離物(05WN5、05WN2、05WN3)相對(duì)近緣，暗示了陜西渭南可能是該病毒的來(lái)源。

大麥黃矮病毒自1960年在陜西、甘肅的小麥上發(fā)現(xiàn)以來(lái)，給小麥的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失，成為制約小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素之一，因此，在生產(chǎn)上，BYDVs在小麥上的危害一直備受關(guān)注。但是在一些其他寄主作物上，則關(guān)注相對(duì)比較少。有研究結(jié)果顯示，BYDVs能侵染150多種禾本科植物，這些寄主植物一方面是BYDVs的潛在危害對(duì)象，另一方面又是BYDVs的中間寄主，在BYDVs周年循環(huán)中是重要的病毒侵染來(lái)源。本研究明確了侵染青海青稞的病毒為BYDV-GAV，翟 浩等[27]在2010年對(duì)青海麥類作物上BYDVs調(diào)查時(shí)也發(fā)現(xiàn)BYDV-GAV是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)的大麥黃矮病毒種群，而青稞在當(dāng)?shù)厥侵匾霓r(nóng)作物，因此，生產(chǎn)上應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注該病毒在青稞等作物上的危害，加大監(jiān)控力度，盡早開展青稞抗BYDV-GAV種質(zhì)資源篩選，防止BYDVs在青稞等作物上造成更大的危害。

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Genomic Cloning and Structural Characterization of an Isolate of BYDV-GAV Infecting Hulless Barley in Qinghai Province

LI Tingfang1,2,3，WU Shuhua2，JI Yinghua2，ZHAO Wenhao2，ZHOU Yijun2，GUO Qingyun1,3

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai 810016,China; 2.Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province -State Key Laboratory Breeding Base,Nanjing,Jiangsu 210014,China; 3.Qinghai Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining,Ministry of Agriculture/Qinghai Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management,Xining,Qinghai 810016,China)

Barley yellow dwarf viruses (BYDVs) cause substantial losses throughout the world wherever their hosts, mainly wheat, barley, and oats, occasionally rice and maize, are grown.In 2004, an investigation on crop virus was carried out in Qinghai province and a kind of yellow dwarf disease on hulless barley was found.Based on the symptom and the vector occurred in the fields, nine samples with typical symptom were collected and detected by RT-PCR using BYDVs primers.The result of RT-PCR showed there was a kind of BYDVs associated with the disease.The sequencing and BLAST analysis indicated the virus shared the highest similarity with BYDV-GAV (about 99.2%) and might be an isolate of BYDV-GAV.To further clarify the taxonomic status of the isolate and the characterization of its genome, three pairs of PCR primers were designed and the full genome of the isolate was cloned using three fragments strategy.The sequences were assembled and the complete genome sequence was determined (5 683 bp), which was composed of 6 ORFs and 4 UTRs, showing typical characters ofLuteovirus.Phylogenetic analysis with other members ofLuteovirusshowed the isolate clustered with BYDV-GAV in the same branch and shared the highest similarity with the isolates from Shaanxi, China.These results indicated that the virus associated with hulless barley yellow dwarf disease in Qinghai province is an isolate of BYDV-GAV.To our knowledge, this is the first report on complete genome of BYDV-GAV infecting hulless barley in Qinghai province.

Barley yellow dwarf viruses; Hulless barley; BYDV-GAV; Qinghai

時(shí)間：2017-07-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170707.1815.014.html

2017-02-21

2017-06-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572074)；江蘇省“333”高層次人才培養(yǎng)工程科研項(xiàng)目(BRA2013262)；江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(4911406)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303021)

E-mail：916716296@qq.com(李廷芳)；Wushuhau@jaas.ac.cn(吳淑華，與第一作者同等貢獻(xiàn))

郭青云(E-mail：guoqingyunqh@163.com)；周益軍(E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn)

S512.3；S330

A

1009-1041(2017)07-0900-07