李倩倩，趙秋實(shí)，蔣宏寶，耿皆飛，劉錄祥，張曉燕，謝彥周，王成社

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

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小麥白斑突變體I30的特征特性及遺傳分析

李倩倩1，趙秋實(shí)1，蔣宏寶1，耿皆飛1，劉錄祥2，張曉燕1，謝彥周1，王成社1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

類(lèi)病斑突變體是研究植物程序性死亡和抗病性的理想材料。為了豐富小麥斑點(diǎn)突變體的研究，對(duì)疊氮化鈉誘變小麥品種陜農(nóng)33產(chǎn)生的穩(wěn)定遺傳的白斑突變體I30進(jìn)行了特征特性研究和遺傳分析。結(jié)果表明，突變體I30從三葉期開(kāi)始表現(xiàn)白色塊斑和長(zhǎng)條紋。錐蟲(chóng)藍(lán)染色和DAB染色顯示，I30斑點(diǎn)處出現(xiàn)細(xì)胞死亡和H2O2積累現(xiàn)象。透射電子顯微鏡觀察表明，I30的葉綠體形狀發(fā)生改變，數(shù)目減少，基粒垛疊高度無(wú)序，部分甚至降解。農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，I30的株高、單株有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)率與野生型間無(wú)顯著差異，但千粒重、穗粒重、單株產(chǎn)量、旗葉長(zhǎng)度和寬度顯著低于野生型。遺傳分析表明，I30由1對(duì)隱性核基因控制。利用BSA + 660K基因芯片技術(shù)，將該基因定位于小麥6D染色體上，位于SSR分子標(biāo)記Xcfd190和6DS-5之間，遺傳距離分別為6.4 cM和9.1 cM。

小麥；突變體；特征特性；農(nóng)藝性狀；基因定位

斑點(diǎn)突變是一種特殊的葉色突變，通常稱之為類(lèi)病斑突變(lesion mimic mutant)[1]，通常伴隨葉綠體的降解、光合作用的減弱、光合色素含量的變化，直接減少了植株的光合面積，影響作物產(chǎn)量。研究表明，許多斑點(diǎn)突變體在抗病性方面強(qiáng)于其親本，對(duì)真菌病原體的抗性尤為如此[2-3]。類(lèi)病斑突變體的表型類(lèi)似過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response,HR)[4]，即植物在沒(méi)有任何逆境和病原菌侵染的條件下，葉片自發(fā)表現(xiàn)出病斑，這種病斑與植株受病原菌侵染產(chǎn)生的病斑相似，所以稱之為類(lèi)病斑突變體或類(lèi)病變突變體[5]。類(lèi)病斑突變體斑點(diǎn)的顏色有白色、黃色、灰白色和褐色，形狀大多都是圓點(diǎn)，也有無(wú)規(guī)則的條紋斑。根據(jù)斑點(diǎn)處是否壞死把類(lèi)病斑突變體分為類(lèi)病斑壞死突變體和普通斑點(diǎn)葉突變體[6]。存在壞死癥狀的斑點(diǎn)突變體是研究植物抗病性機(jī)制和細(xì)胞程序性死亡的理想材料[5]。類(lèi)病斑突變的產(chǎn)生主要與過(guò)敏反應(yīng)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(PCD)和活性氧累積有關(guān)[4,7-8]，也與活性氧累積過(guò)程的中間產(chǎn)物(reactive oxygen intermediates,ROIs)、水楊酸(salicylicacid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯(ethylene,ET)相關(guān)[2]。此外，植物生長(zhǎng)過(guò)程的環(huán)境條件，如光照[9]、濕度[10]、溫度[11]和營(yíng)養(yǎng)狀況也對(duì)類(lèi)病斑的產(chǎn)生有影響。

類(lèi)病斑突變體最早在玉米中發(fā)現(xiàn)[12]，隨后在擬南芥[13]、大麥[14]、水稻[15]等作物上也有報(bào)道，對(duì)小麥類(lèi)病斑突變體的研究相對(duì)較晚。水稻作為模式植物，被發(fā)現(xiàn)的類(lèi)病斑基因較多，多數(shù)已經(jīng)被成功定位和克隆，如 spl5[16]、 spl7[17]、 spl11[18]、 Oslsd1[19]和 spl28[20]。近幾年，小麥類(lèi)病斑基因的報(bào)道也逐漸增多。Li等[21]用Ning 7840/Chokwang的重組自交系將控制Ning 7840黃色病斑性狀的隱性基因lm定位在小麥1BL染色體上。Yao等[22]用2個(gè)正常的親本Yanzhan 1/Zaosui 30雜交，得到1個(gè)類(lèi)病斑突變體，該突變體的單株產(chǎn)量和千粒重均比親本低，由2對(duì)命名為 lm1和 lm2的隱性基因控制。Wang等[23]在F1群體中得到1個(gè)白斑突變體lm3，該突變體表現(xiàn)為小而離散的白斑，對(duì)白粉病有較好的抗性，該基因已經(jīng)定位到 3BL上。Kamlofski等[24]用化學(xué)誘變劑EMS(甲基磺酸乙酯)得到突變體HLP (hypersensitive-like phenotype)，該突變體生長(zhǎng)到第5或6葉時(shí)出現(xiàn)小而散的白色病斑，農(nóng)藝性狀與其親本無(wú)顯著差異，但對(duì)條銹病抗性較好。斑點(diǎn)葉突變體C591(M8)為顯性突變體，當(dāng)斑點(diǎn)蔓延至整個(gè)葉片和葉鞘時(shí)其葉綠素含量顯著低于野生型，但其產(chǎn)量與野生型無(wú)顯著差異[25]。Kinane等[26]研究發(fā)現(xiàn)，斑點(diǎn)突變體M66的產(chǎn)量雖低，但抗病性廣且強(qiáng)。類(lèi)病斑突變體的表型可以從類(lèi)似過(guò)敏反應(yīng)到大量的葉綠體缺失或壞死[21]。AIM9是一個(gè)葉片萎黃的類(lèi)病斑突變體，通過(guò)透射電鏡對(duì)其葉綠體結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，該突變體的葉綠體形狀由橢圓形變成了圓形，并發(fā)生了不可逆的向心運(yùn)動(dòng)[27]。杜麗芬等[28]發(fā)現(xiàn)，小麥斑點(diǎn)突變體LF2010在三葉期就表現(xiàn)黃色非壞死斑點(diǎn)，斑點(diǎn)受光照和溫度誘導(dǎo)；遺傳分析表明，LF2010由1對(duì)隱性核基因控制。雖然小麥類(lèi)病斑突變體的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但還不能滿足小麥育種研究的需要。

突變體I30是由疊氮化鈉誘導(dǎo)小麥品種陜農(nóng)33獲得的1個(gè)突變體，具有白斑葉特點(diǎn)，遺傳特性穩(wěn)定。本研究擬對(duì)其形態(tài)特征、生理和遺傳特性進(jìn)行分析，旨在為其突變基因及其性質(zhì)的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為穩(wěn)定遺傳的突變體I30及其野生型陜農(nóng)33、中國(guó)春。于2014年10月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗(yàn)田，行長(zhǎng)1.2 m，行寬0.3 m，株距10 cm，各種植3行。

1.2 表型觀察

田間條件下，全生育期內(nèi)對(duì)突變體I30與陜農(nóng)33的表型進(jìn)行觀察并拍照。對(duì)突變體I30白斑出現(xiàn)的時(shí)間、部位、顏色、形狀和大小進(jìn)行詳細(xì)記錄。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉片細(xì)胞活性的檢測(cè)

小麥幼苗在光照培養(yǎng)箱中長(zhǎng)至三葉期時(shí)，隨機(jī)選取已經(jīng)表現(xiàn)斑點(diǎn)性狀的突變體和陜農(nóng)33第1葉片，浸泡在煮沸的錐蟲(chóng)藍(lán)染液[29]中，染色 10 min，室溫放置 14 h，再用 2.5 g· mL-1水合氯醛(10 mL水中加入25 g水合氯醛)脫色 3～4 d，觀察葉片是否被染成藍(lán)色并拍照。染色后的葉片在50%甘油中保存。重復(fù)3次。

1.3.2 葉片中H2O2的檢測(cè)

參考Thordal-Christensen等[30]的方法檢測(cè)類(lèi)病斑突變體葉片中H2O2的積累。將溫室中表現(xiàn)類(lèi)病斑的突變體I30的葉片及陜農(nóng)33的葉片浸泡在1 mg· mL-1的DAB( pH 3.8)中，置于25 ℃下光照8 h后，取出葉片置于96 %的乙醇中煮沸10 min，脫色后將葉片浸泡在新鮮的乙醇中4 h(25 ℃) ，觀察葉片中是否出現(xiàn)紅褐色沉淀并拍照記錄。重復(fù)3次。

1.3.3 葉綠體的超微結(jié)構(gòu)觀察

在小麥抽穗期氣溫較低的清晨，分別選取突變體I30含有白斑的葉片及其陜農(nóng)33的旗葉，參考侯典云[31]的方法制備透射電鏡樣品、觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。

1.3.4 光合色素含量和光合參數(shù)的測(cè)量

選取分蘗期、起身期和抽穗期突變體I30及陜農(nóng)33的旗葉，采用95%的酒精研磨過(guò)濾法[32]測(cè)定光和色素含量。采用便攜式光合測(cè)定儀LI-6400測(cè)量抽穗期突變體I30和陜農(nóng)33的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.3.5 農(nóng)藝性狀分析

成熟期隨機(jī)選取10株突變體I30和陜農(nóng)33，考察其株高、旗葉長(zhǎng)和寬、有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、穗粒重、有效分蘗數(shù)和千粒重等農(nóng)藝性狀。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

1.3.6 突變體I30的抗病性分析

選取大小一致的10粒I30和陜農(nóng)33種子，在培養(yǎng)箱(20 ℃，光照12 h)中培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)到2葉期時(shí)，用已經(jīng)感染白粉病的小麥苗作為病源人工抖接混合白粉菌，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～12 d使其充分發(fā)病，觀察發(fā)病情況。

1.4 遺傳分析與基因定位

2015年10月分別將突變體I30與中國(guó)春、陜農(nóng)33雜交的F1種子播種于田間并觀察其表型。于2015年11月觀察F1自交所得F2的表型，統(tǒng)計(jì)F2群體的分離比例。從I30與中國(guó)春雜交得到的F2群體中選取12株正常植株和12株突變植株，CTAB法[33]提取基因組DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否存在DNA降解和RNA污染。把DNA濃度稀釋到100 ng· μL-1，等量混合構(gòu)成正常池和突變池[34]，進(jìn)行660K基因芯片檢測(cè)。利用Joinmap 4.0和Map Draw V2.1[35]制作遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片的表現(xiàn)特征

從三葉期開(kāi)始，突變體I30的葉片表面先出現(xiàn)形狀無(wú)規(guī)則的白色條紋斑，部分葉片是白色條紋，有些是2～3 cm長(zhǎng)的斑塊，主要集中在葉基部和中部，葉尖不表現(xiàn)。越冬前隨著溫度的降低白斑處呈萎蔫狀，生長(zhǎng)后期白斑延伸到葉鞘和莖稈(圖1)。該突變體的病斑表現(xiàn)為條紋斑和斑塊，與前人報(bào)道的斑點(diǎn)突變類(lèi)型不同，說(shuō)明I30突變體可能是一個(gè)新的白斑突變類(lèi)型。

2.2 葉片的細(xì)胞活性分析

由圖2可知，突變體I30經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色后，白斑部位明顯呈深藍(lán)色，說(shuō)明突變體I30斑點(diǎn)處的細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞死亡(圖2a)。陜農(nóng)33經(jīng)DAB染色后著色很淺，而突變體I30經(jīng)DAB染色后葉片產(chǎn)生明顯的棕紅色，斑點(diǎn)所在處顏色更深(圖2b)，表明突變體I30葉片中H2O2積累較多。H2O2積累過(guò)多可能是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因。

2.3 葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較

圖3顯示，陜農(nóng)33的葉綠體是正常的橢圓形，具有高度分化的基粒類(lèi)囊體、清晰的片層結(jié)構(gòu)和連接片層的基質(zhì)類(lèi)囊體膜(圖3a)。突變體I30白斑部位的葉綠體完全降解，只存在較少的線粒體(圖3c)。突變體I30綠色部位葉綠體的形態(tài)表現(xiàn)不一，部分葉綠體形態(tài)較為正常，但是其形狀發(fā)生改變；有類(lèi)囊體基粒片層結(jié)構(gòu)，但類(lèi)囊體排列紊亂(圖3d)；部分葉綠體形狀由橢圓形變?yōu)閳A形，類(lèi)囊體基粒層結(jié)構(gòu)不清晰甚至降解(圖3b)。說(shuō)明突變體I30綠色部分的葉綠體也受到了不同程度的影響。

2.4 葉片光合色素含量及其光合參數(shù)比較

由表1可知，突變體I30在3個(gè)調(diào)查階段的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均低于陜農(nóng)33，總?cè)~綠素含量較陜農(nóng)33在分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期分別降低了25.6%、13%、0.5%，在分蘗期差異極顯著。

a:I30苗期；b:陜農(nóng)33苗期；c:I30拔節(jié)期；d:陜農(nóng)33拔節(jié)期；e:I30灌漿期；f:陜農(nóng)33抽穗期；g:I30莖稈；h:陜農(nóng)33莖稈；i:陜農(nóng)33(左)和I30(右)葉片；箭頭指向白斑部位。
a:Seedling stage of I30; b:Seedling stage of Shaannong 33; c:Jointing stage of I30; d:Jointing stage of Shaannong 33; e:Grain filling stage of I30; f:Heading stage of Shaannong 33; g:Stems of I30; h:Stems of Shaannong 33; I:Leaf blade of Shaannong 33(left) and I30(right);The white parts are pointed with arrows.
圖1 不同的生育階段突變體I30和陜農(nóng)33的表型
Fig.1 Phenotype of mutant I30 and Shaannong 33 at different growth stages

a:錐蟲(chóng)蘭染色；b:DAB染色；WT：野生型。
a:Trypan staining; b:DAB staining; WT:Wild type.
圖2 突變體I30和陜農(nóng)33葉片的組織化學(xué)染色
Fig.2 Histochemical staining of the mutant I30 and Shaannong 33

抽穗期對(duì)突變體I30和陜農(nóng)33光合參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果(表2)表明，與陜農(nóng)33相比，突變體I30的凈光合速率降低了27.48%，差異顯著；胞間CO2濃度增加7.22%，差異顯著；氣孔導(dǎo)度下降4.49%，蒸騰速率提高1.85%，差異均不顯著。說(shuō)明突變體I30的光合特性與其野生型有較大差異。

2.5 主要農(nóng)藝性狀比較

從表3可知，突變體I30和陜農(nóng)33的株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、有效分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率之間無(wú)顯著性差異，但在旗葉長(zhǎng)度和寬度、穗粒重、單株產(chǎn)量和千粒重之間存在顯著差異。結(jié)合2.4結(jié)果，說(shuō)明I30突變體的白斑主要影響了葉片的大小和光合能力，進(jìn)而影響植株的光合產(chǎn)物積累和作物的產(chǎn)量形成。

2.6 抗病性比較

由圖4可知，突變體I30和陜農(nóng)33的葉片均感染了白粉菌，但是突變體I30葉片上的病斑較少，說(shuō)明突變體I30的白粉病抗性強(qiáng)于其野生型。

2.7 突變體I30的遺傳分析及基因定位

由表4可知，I30×中國(guó)春和I30×陜農(nóng)33兩個(gè)組合的正反交F1表現(xiàn)一致，說(shuō)明該突變基因是核基因變異；F1未表現(xiàn)突變性狀，表明該突變基因?qū)儆陔[性突變；F2群體中突變型與野生型的分離比符合3∶1的比例，說(shuō)明該突變性狀由一對(duì)基因決定。由此可見(jiàn)，I30突變體的白斑性狀是由一對(duì)隱性核基因控制的。

染色體定位結(jié)果表明，突變基因 I30位于小麥于6D染色體上。用18對(duì)均勻分布6D染色體上的SSR引物對(duì)2個(gè)親本和混合池進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)SSR標(biāo)記(Xcfd33、Xbarc196、Xbarc273、Xgwm325和Xbarc175)在親本間存在多態(tài)性。用I30×中國(guó)春的214 株F2單株驗(yàn)證這些標(biāo)記，結(jié)果表明， I30基因位于Xbarc196和Xgwm325之間(圖5)，遺傳距離分別為11.6 cM和12.1 cM。 由于這兩個(gè)標(biāo)記在6D染色體的短臂上，由此推斷 I30基因也位于6D染色體的短臂上。在Xbarc196和Xgwm325兩個(gè)標(biāo)記之間進(jìn)一步搜索和設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記，加密到遺傳距離6.4 cM(Xcfd190)和9.1 cM(6DS-5)。遺傳圖譜見(jiàn)圖6，最終得到的8個(gè)遺傳標(biāo)記引物見(jiàn)表5。

a:陜農(nóng)33；e:a的放大部分；c:I30的白斑部位；b和d:I30的正常部位。CP:葉綠體；PG:質(zhì)體小球；CW:細(xì)胞壁；G:基粒；S：基質(zhì)；ST:基質(zhì)類(lèi)囊體；Mt:線粒體。
a:Shaannong 33; e:An enlarged image showing partial of a; c:White stripe of I30; b and d:Green parts of I30; CP:Chloroplast; PG:Plastoglobule; CW:Cell wall; G:Grana; S:Stroma; ST:Stroma thylakoid; Mt:Mitochondrion.
圖3 突變體I30和陜農(nóng)33的葉綠體觀察
Fig.3 Chloroplast ultrastructure of mutant I30 and Shaannong 33

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)期突變體I30和陜農(nóng)33的葉綠素含量Table 1 Chlorophyll content of mutant I30 and Shaannong 33 at different growth stages

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。**:突變體與野生型之間存在極顯著差異(P<0.01)。下同。
Data are shown as mean±SD of 3 replicates. **:Highly significant difference between mutant and the wild type at 0.01 level.The same below.

表2 突變體I30和陜農(nóng)33的光合參數(shù)比較Table 2 Comparation of photosynthetic parameters of mutant I30 and Shaannong 33

*:突變體與野生型之間存在顯著差異(P<0.05)。下同。
*：Significant differences between mutant and the wild type at 0.05 level.The same in table 2.

表3 突變體I30和陜農(nóng)33農(nóng)藝性狀的比較Table 3 Comparison of main agronomic traits of the mutant I30 and Shaannong 33

圖4 突變體I30和陜農(nóng)33的白粉病抗性檢測(cè)Fig.4 Resistance to powdery mildew of mutant I30 and Shaannong 33

表4 突變體I30與中國(guó)春(CS)及陜農(nóng)33(SN33)雜交后代遺傳分析Table 4 Genetic analysis of the hybrid generations of mutant I30 crossed with Chinese Spring(CS) and Shaannong 33(SN33)

M:Marker；1:I30；2:中國(guó)春；3:突變型混池；4:野生型混池；5～9:F2群體的突變型植株；10～14:在F2群體中野生型植株。
M:Marker; 1:I30; 2:Chinese Spring;3:Mutant pool; 4:Wild type pool; 5-9:The mutant type plants in F2population;10-14:The wild type plants in F2population.
圖5 部分材料標(biāo)記Xgwm325的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.5 PCR products amplified with Xgwm325 from part of materials

表5 定位 I30基因所用到的SSR分子標(biāo)記Table 5 SSR markers used for mapping I30

表6 小麥類(lèi)病斑突變體的研究情況匯總Table 6 Summary of wheat lesion mimic mutants

WLN：病斑處是否存在壞死；WLS：病斑是否擴(kuò)散；IOY：對(duì)產(chǎn)量的影響；Pm：白粉??；- ：未報(bào)道。
WLN:Whether the lesion is necrotic; WLS:Whether the lesion spreads; IOY:Influence on the yield; Pm:Powdery mildew;-:Not reported.

圖6 突變基因I30 在小麥6D染色體上的遺傳連鎖圖Fig.6 Genetic linkage map of I30 on wheat chromosome 6D

3 討 論

3.1 I30是一個(gè)新的類(lèi)病斑突變基因

本研究中，突變體I30的白斑呈不規(guī)則條狀或塊狀，這與水稻條紋斑突變體lms1[36]的表型相似，而與其他小麥類(lèi)病斑突變體LF2010[28]、HLP[24]、Yanzhan/Zaosui30[22]、C59l(M8)[25]、lm3[23]、M66[26]、Ning7480[21]等均為斑點(diǎn)葉突變和AIM9[36]為嚴(yán)重葉綠體缺失不同(表6)。此外，遺傳分析及基因定位表明，突變基因 I30位于小麥6DS染色體。而其他已定位的小麥類(lèi)病斑突變基因分別定位于3BS( lm1)、4BL( lm2)、3BL( lm3)、1BL( Ning7840)。因此，推斷突變體I30是一種新的小麥條紋類(lèi)病斑突變體， I30是一個(gè)新的類(lèi)病斑突變基因。此外，突變體I30在白粉病抗性方面優(yōu)于其野生型，可以作為育種中間材料，但是對(duì)其他病害的抗性和抗病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.2 I30突變體是研究小麥光合作用的重要材料

本研究中，突變體I30從苗期開(kāi)始出現(xiàn)白色條紋斑(圖1)，一直延續(xù)于整個(gè)生育期，而且在生長(zhǎng)后期，白斑擴(kuò)散到葉鞘和莖稈，屬于擴(kuò)散型類(lèi)病斑突變體[4,36]。白斑的出現(xiàn)使葉片的綠色面積減少，直接影響了突變體I30的葉綠素含量和光合作用。與野生型相比，突變體I30的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量在各個(gè)生長(zhǎng)階段均下降，尤其是苗期，與親本間存在極顯著差異，說(shuō)明突變基因影響了小麥苗期葉綠素的合成和積累。在拔節(jié)期和抽穗期，葉綠素含量與親本沒(méi)有顯著差異，可能是因?yàn)樾←湴喂?jié)期生長(zhǎng)速度較快，突變體的白斑在葉片中所占比例較小所致。

植物的氣孔導(dǎo)度與光合速率呈正相關(guān)關(guān)系。在本試驗(yàn)中，突變體的氣孔導(dǎo)度與野生型無(wú)顯著差異，但是凈光合速率減少了27%，說(shuō)明本試驗(yàn)中光合作用的減弱不是氣孔導(dǎo)度導(dǎo)致的。Farquhar等[37]研究認(rèn)為，應(yīng)結(jié)合胞間二氧化碳濃度(Ci)來(lái)分析光合速率的變化原因；當(dāng)Pn、Ci同時(shí)降低時(shí)，是氣孔導(dǎo)度的降低使光合速率下降；而Pn下降、Ci升高時(shí)，導(dǎo)致光合速率降低的是葉肉細(xì)胞光合活性下降。本試驗(yàn)中，突變體I30的Pn下降、Ci升高，說(shuō)明光合作用的減弱不是氣孔因素導(dǎo)致的，而是葉肉細(xì)胞光合活性的下降。

綠色植物獲取能量的主要途徑是葉片光合作用。研究認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)，凈光合速率與葉綠素含量呈正相關(guān)[38]。本研究中，突變體I30葉綠素含量較野生型降低，導(dǎo)致凈光合速率下降27.48%。研究認(rèn)為，葉綠體類(lèi)囊體基粒片層垛疊越多，葉綠體的光合作用越強(qiáng)[39]。突變體I30的白斑部位葉綠體結(jié)構(gòu)完全降解，沒(méi)有片層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其光合作用降低，這與前人研究結(jié)果一致。突變體I30特定部位葉綠體的缺失，類(lèi)囊體片層結(jié)構(gòu)的破壞可能是導(dǎo)致其出現(xiàn)白斑的主要原因。葉色突變體可以用于葉綠體合成相關(guān)新基因的定位和克隆，從而為進(jìn)一步探究小麥葉色形成的分子機(jī)制、葉綠體發(fā)育與葉綠素生物合成、光合作用機(jī)制提供基礎(chǔ)材料，為以后利用基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥高光效育種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

小麥白斑突變體I30是一類(lèi)新的小麥類(lèi)病斑突變體；突變體I30的白斑性狀受1對(duì)隱性核基因控制，位于小麥6D染色體上；白斑處出現(xiàn)細(xì)胞壞死和活性氧累積，產(chǎn)量與野生型相比顯著下降。

[1]GREENBERG J T,GUO A,KLESSIG D F,etal.Programmed cell death in plants:A pathogen-triggered response activated coordinately with multiple defense functions [J].Cell,1994,77:551.

[2]李小白,王雪艷,舒小麗,等.植物類(lèi)病斑突變體的信號(hào)途徑與抗病性研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2009,23(4):635.

LI X B,WANG X Y,SHU X L,etal.Research advances on signal transduction of plant lesion mimic mutants and its disease resistance [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2009,23(4):635.

[3]DIETRICH R A,DELANEY T P,UKNES S J,etal.Arabidopsis mutants simulating disease resistance response [J].Cell,1994,77:565.

[4]王忠華.植物類(lèi)病變突變體的誘發(fā)與突變機(jī)制[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志,2005,27(5):530.

WANG Z H.Induction and mutation mechanism of plant lesion mimic mutants [J].ChineseJournalofCellBiology,2005,27(5):530.

[5]孫惠敏,張春嬌,李保同,等.水稻類(lèi)病斑突變體的研究進(jìn)展[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,30(3):142.

SUN H M,ZHANG C J,LI B T,etal.Advances of study on rice lesion mimic mutants [J].ActaAgriculturaeShanghai,2014,30(3):142.

[6]黃奇娜,楊 楊,施勇烽,等.水稻斑點(diǎn)葉變異研究進(jìn)展[J].中國(guó)水稻科學(xué),2010,24(2):108

HUANG Q N,YANG Y,SHI Y F,etal.Recent advances in research on Spotted-Leaf mutants of rice(OryzaativaL.) [J].ChinaRiceScience,2010,24(2):108.

[7]姜 麗,劉國(guó)慶,韓建民,等.植物類(lèi)病變壞死突變體及其基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2003,23(1):36.

JIANG L,LIU G Q,HAN J M,etal.The progess on the studies plant lesion mimic mutants and genes [J].JouralofChineseBiotechnology,2003,23(1):36.

[8]LORRAIN S,VAILLEAU F,BALAGU C,etal.Lesion mimic mutants:Keys for deciphering cell death and defense pathways in plants? [J].TrendsinPlantScience,2003,8(6):263.

[9]FUSET,IBA K,SATOH H,etal.Characterization of a rice mutant having an increased susceptibility to light stress at high temperature [J].PhysiolPlant,1993,89(4):799.

[10]JAMBUNATHAN N,SIANI J M,MCNELLIS T W.A humidity-sensitiveArabidopsiscopine mutant exhibits precocious cell death and increased disease resistance [J].ThePlantCell,2001,13:2225.

[11]HU G,RICHTER T E,HULBERT S H,etal.Disease lesion mimicry caused by mutations in the rust resistance gene rp1[J].ThePlantCell,1996,8:1367.

[12]JOHAl G S,HULBERT S,BRIGGS S P.Disease lesion mimic mutations of maize:A model for cell death in plants [J].BioEssays,1995,17:685.

[13]BOWLING S A,CLARKE J D,LIU Y D,etal.The cpr5 mutant ofArabidopsisexpresses both NPRl-dependent and NPRl-independent resistance [J].ThePlantCell,1997,9:1573.

[14]WOLTER M,HOLLRICHER K,SALAMINI F,etal.Themloresistance alleles to powdery mildew infection in barley trigger a developmentally controlled defense mimic phenotype [J].Molecular&GeneralGenetics,1993,239:122.

[15]TAKAHASHI A,KAWASAKI T,HENMI K,etal.Lesion mimic mutants of rice with alterations in early signaling events of defense [J].PlantJournal,1999,17(5):535.

[16]CHEN X,HAO L,PAN J,etal. SPL5,a cell death and defense-related gene,encodes a putative splicing factor 3b subunit 3(SF3b3) in rice [J].MolecularBreeding,2012,30(2):939．

[17]YAMANOUCHI U,YANO M,LIN H,etal.A rice spotted leaf gene Spl7,encodes a heat stress transcription factor protein [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUnitedStatesofAmerica,2002,99:7530．

[18]ZENG L R.Spotted leaf 11,a negative regulator of plant cell death and defense,encodes a U-Box/Armadillo repeat protein endowed with E3 ubiquitin ligase activity [J].ThePlantCell,2004,16(10):2795.

[19]WANG L J,PEI Z Y,TIAN Y C,etal.OsLSD1,a rice zinc finger protein,regulates programmed cell death and callus differentiation [J].TheAmericanPhytopathologicalSociety,2005,18(5):375.

[20]QIAO Y L,JIANG W Z,LEE J H,etal.SPL28 encodes a clathrin-associated adaptor protein complex 1,medium subunit l1(AP1M1) and is responsible for spotted leaf and early senescence in rice(Oryzasativa) [J].NewPhytologist,2010,185:258.

[21]LI T,BAI G.Lesion mimic associates with adult plant resistance to leaf rust infection in wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2009,119(1):13.

[22]YAO Q,ZHOU R,FU T,etal.Characterization and mapping of complementary lesion-mimic genes lm1 and lm2 in common wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2009,119(6):1005．

[23]WANG F,WU W,WANG D,etal.Characterization and genetic analysis of a novel light-dependent lesion mimic mutant,lm3,showing adult-plant resistance to powdery mildew in common wheat [J].PlosOne,2016,11(5):e155358.

[24]KAMLOFSKI C A,ANTONELLI E,BENDER C,etal.A lesion-mimic mutant of wheat with enhanced resistance to leaf rust [J].PlantPathology,2007,56(1):46.

[25]NAIR S K,TOMAR S.Genetical and anatomical analyses of a leaf flecking mutant inTriticumaestivumL. [J].Euphytica,2001,121(1):53.

[26]KINANE J T,JONES P W.Isolation of wheat mutants with increased resistance to powdery mildew from small induced variant populations [J].Euphytica,2001,117(3):251．

[27]LUO P G,REN Z L.Wheat leaf chlorosis controlled by a single recessive gene [J].JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2006,32(3):330.

[28]杜麗芬,李明飛,劉錄祥,等.一個(gè)化學(xué)誘變的小麥斑點(diǎn)葉突變體的生理和遺傳分析[J].作物學(xué)報(bào),2014,40(6):1020.

DU L F,LI M F,LIU L X,etal.Physiological characteristics and genetic analysis on a spotted-leaf wheat derived from chemical mutation[J].ActaAgronomicaSinica,2014,40(6):1020.

[29]YIN Z C,CHEN J,ZENG L R,etal.Characterizing rice lesion mimic mutants and identifying a mutant with broad-spectrum resistance to rice blast and bacterial blight [J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2000,13(8):875.

[30]THORDAL-CHRISTENSEN H,ZHANG Z G,WEI Y D,etal.Subcellular localization of H2O2in plants:H2O2accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley powdery mildew interaction [J].ThePlantJournal,1997,11(6):1192.

[31]侯典云.小麥返白系葉綠體基因組分析及葉綠體超微結(jié)構(gòu)和差異表達(dá)蛋白質(zhì)研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技,2009:32.

HOU D Y.Genomic analysis and ultrastructure and differential expression proteins study of chloroplast in wheat albinism line [D].Yangling:Northwest A&F University,2009:32.

[32]高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版,2006:75.

GAO J F.Experimental Guide of Plant Physiology [M].Beijing:Higher Education Press,2006:75.

[33]ROGERS S O,BENDICHA J.Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues [J].PlantMolecularBiology,1985,5(2):69.

[34]MICHELMORE R W,PARAN I,KESSELI R.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1991,88(21):9828.

[35]劉仁虎,孟金陵.MapDraw在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏[J].遺傳,2003,25(3):317.

LIU R H,MENG J L.MapDraw:A microsoft excel macro for drawing genetic linkage maps based on given genetic linkage data [J].Heraditas,2003,25(3):317.

[36]馬健陽(yáng),陳孫祿,張建輝,等.一個(gè)水稻類(lèi)病條紋斑突變體的鑒定和遺傳定位[J].中國(guó)水稻科學(xué),2011,25(2):150.

MA J Y,CHEN S L,ZHANG J H,etal.Identification and genetic mapping of a lesion mimic stripe mutant in rice [J].ChineseJournalRiceScience,2011,25(2):150.

[37]FARQUHAR G D,SHARKEY T D.Stomatal conductance and photosynthesis [J].AnnualReviewofPlantPhysiology,1982,33:318.

[38]汪 斌,蘭 濤,吳為人,等.水稻葉綠素含量的QTL定位[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(12):1127.

WANG B,LAN T,WU W R,etal.Mapping of QTLs controlling chlorophyll content in rice [J].ActaGeneticaSinica,2003,30(12):1127.

[39]ANDERSON J M,GOODCHILD D J,BOARMAN N K,etal.Composition of the photosystems and chloroplast structure in extreme shade plant [J].BiochimBiophyActa,1973,325:573.

Characteristics and Genetic Analysis of Wheat Mutant I30 with White Stripe Pattern

LI Qianqian1,ZHAO Qiushi1,JIANG Hongbao1,GENG Jiefei1,LIU Luxiang2,ZHANG Xiaoyan1,XIE Yanzhou1,WANG Chengshe1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100081,China)

Lesion mimic mutant is an ideal material for research on plant programmed cell death and disease resistance. In order to enrich the research on wheat spotted mutants,a stable inherited white stripe mutant I30 was generated from Shaannong 33 by chemical mutagen sodium azide,and its characteristics and genetic analysis were conducted. The mutant I30 showed white spots and long stripes from the 3rd leaf stage to maturity stage. Trypan blue staining and DAB staining showed that I30 appeared cell death and the accumulation of H2O2. Observation of the chloroplasts structure of I30 with transmission electron microscopy indicated that the shape of chloroplast changed,and the number was decreased and grana stacks in the stroma were highly disordered,and even partly degraded. It was demonstrated that there was no significant difference between I30 and wild type in plant height,effective spikes per plant,spike grain number,ear length and seed setting rate,but the 1 000-grain weight(TKW),grain weight per spike,grain yield per plant,flag leaf length and width of I30 were significantly lower than those of the wild type. Genetic analysis showed that the mutant trait was controlled by a pair of recessive gene. The gene was located on the short arm of chromosome 6D revealed by BSA with 660K gene chip technology,situating between the SSR markers Xcfd190 and 6DS-5,the genetic distances were 6.4 cM and 9.1 cM,respectively.

Wheat(TriticumaestivumL.); Mutant; Characteristics; Agronomic trait; Gene mapping

時(shí)間：2017-07-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170707.1815.006.html

2017-03-02

2017-03-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0102101)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTZDNY01-01-02)；西北農(nóng)林科技大學(xué)南陽(yáng)小麥試驗(yàn)示范站建設(shè)項(xiàng)目；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

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