王劍蓉，王耀輝，高麗麗，王潔

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京210029)

潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜組織中CPS1和S100P蛋白表達(dá)變化及意義

王劍蓉，王耀輝，高麗麗，王潔

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京210029)

目的 觀察潰瘍性結(jié)腸炎(UC)腸黏膜組織中結(jié)腸癌相關(guān)蛋白氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)和S100鈣結(jié)合蛋白P(S100P)的表達(dá)變化,并探討其臨床意義。方法 收集20例UC急性期及其對(duì)應(yīng)緩解期、30例UC伴上皮內(nèi)瘤變腸鏡活檢標(biāo)本，采用免疫組化法檢測各組織中CPS1和S100P蛋白，并分析其相關(guān)性。結(jié)果 在UC緩解期與急性期腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，均低于UC伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)量(P均<0.01)。在UC緩解期、急性期、伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中，CPS1和S100P表達(dá)均無相關(guān)性(r分別為0.197、0.146、0.042，P均>0.05)。結(jié)論 在UC伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)增加，二者可能獨(dú)立參與UC腸黏膜上皮內(nèi)瘤變過程，而在UC急性期病程發(fā)展中無明確作用。

潰瘍性結(jié)腸炎；上皮內(nèi)瘤變；氨甲酰磷酸合成酶1；S100鈣結(jié)合蛋白P

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚不明確的非特異性腸道炎癥性疾病，是我國消化系統(tǒng)常見病，長期反復(fù)的慢性病程導(dǎo)致患癌概率增加[1]。UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腸道正常菌群的免疫反應(yīng)異常是其發(fā)病的主要因素[2]。氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)和S100鈣結(jié)合蛋白P(S100P)均為結(jié)腸癌相關(guān)蛋白，與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用免疫組化法檢測UC腸黏膜組織中的CPS1和S100P，分析其在UC發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2015年12月江蘇省中醫(yī)院診治的UC患者50例，其中20例均具有急性期及其對(duì)應(yīng)緩解期的腸鏡活檢標(biāo)本，男10例、女10例，平均年齡43.2歲；UC急性期活檢部位選擇病變最顯著腸段，對(duì)應(yīng)緩解期選擇既往受累腸段。30例UC伴上皮內(nèi)瘤變，男17例、女13例，平均年齡47.3歲；低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變26例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變4例。

1.2 CPS1和S100P檢測方法 采用免疫組化法。應(yīng)用即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒(福州邁新生物公司)，S100P抗體(Abcam公司，ab133554)，CPS1抗體(Abcam公司，ab128942)。取組織石蠟標(biāo)本，4 μm厚切片；與體積分?jǐn)?shù)3%H2O2孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。檸檬酸高壓2 min，修復(fù)抗原。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；滴加1∶100稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，2 min×3次。滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑(二抗)，37 ℃溫孵育15 min；PBS沖洗，2 min×3次。滴加新鮮配制的顯色劑(DAB)，顯微鏡下控制顯色時(shí)間(5 min)；自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，熱水返藍(lán)；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下閱讀切片，細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)均勻一致黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野(×400)，由2位病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲判讀。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組化染色評(píng)分，兩者乘積為蛋白相對(duì)表達(dá)量。陽性細(xì)胞比例：﹤5%為0分，5%～﹤25%為1分，25%～﹤50%為2分，50%～﹤75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度：無色0分，淺黃色1 分，棕黃色2分，棕褐色3分。

2 結(jié)果

2.1 UC腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)比較 在UC緩解期腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)量分別為2.15±0.67、1.05±0.22，急性期黏膜組織中分別為2.20±0.77、1.20±0.41，二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；在UC伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中CPS1和S100P表達(dá)量分別為10.7±1.81、7.97±1.75，與急性期或緩解期腸黏膜表達(dá)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.01)。

2.2 CPS1和S100P在UC腸黏膜組織表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，CPS1和S100P在UC緩解期、急性期、伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中表達(dá)均沒有相關(guān)性(r=0.197，P=0.404；r=0.146，P=0.539；r=0.042，P=0.825)。

3 討論

UC為臨床較常見疾病,其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有遺傳學(xué)說、環(huán)境學(xué)說、微生物學(xué)說、免疫學(xué)說等多種學(xué)說，而機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腸道正常菌群的免疫反應(yīng)異常是其發(fā)病的主要因素。UC病情遷延、反復(fù)發(fā)作不易根治，病程上分為急性期和緩解期。雖然UC相關(guān)病理學(xué)描述很多，但是沒有特異的診斷標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的分子機(jī)制也不明確，在實(shí)際工作中病理醫(yī)生診斷困難，臨床醫(yī)生必須結(jié)合臨床表現(xiàn)、 影像、消化內(nèi)鏡和組織病理學(xué)結(jié)果綜合評(píng)價(jià)[1]。因UC的具體病因不明，故無法采取針對(duì)病因的治療措施。免疫反應(yīng)為發(fā)病中的重要機(jī)制，作用于免疫反應(yīng)各個(gè)環(huán)節(jié)的新藥是治療的一個(gè)新發(fā)展方向。隨著細(xì)胞因子在UC發(fā)病中作用的深入研究，生物和基因治療成為研究的熱點(diǎn)，如腫瘤壞死因子抗體依那西普等可誘導(dǎo)緩解多數(shù)激素依賴型慢性活動(dòng)性UC[3]。UC患者更容易發(fā)生結(jié)直腸癌，病程10、20、30年后患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)分別為2%、8%、18%；UC相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生經(jīng)歷了炎癥、不典型增生、癌癥的病理過程，組織學(xué)形態(tài)常比散發(fā)結(jié)腸癌分化更低，可能與腫瘤的發(fā)生機(jī)制不同有關(guān)[4,5]。多種細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子參與白細(xì)胞激活、趨化和遷移，在炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，與UC癌變相關(guān)[6]。

S100蛋白家族的S100P首先從胎盤中分離出來，其能夠促進(jìn)腫瘤的增殖、血管的生成和轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。S100P廣泛分布于人類各個(gè)器官如心、腦、肺，肝臟等，表達(dá)定位在細(xì)胞膜、胞質(zhì)及胞核[8]。S100P無論基因或蛋白水平在結(jié)腸癌組織中比正常組織顯著高表達(dá)，是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)蛋白[9]，并與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者不良預(yù)后相關(guān)[10]。CPS1是一種線粒體基質(zhì)酶，負(fù)責(zé)催化肝臟鳥氨酸循環(huán)的第一步，CPS1 基因缺陷會(huì)導(dǎo)致一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病。CPS1通常定位于細(xì)胞線粒體膜，在胞質(zhì)中也有分布；其多表達(dá)于肝和腸上皮細(xì)胞，參與肝癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[11,12]。UC相關(guān)腫瘤的發(fā)生涉及到整個(gè)結(jié)直腸黏膜基因組領(lǐng)域的缺陷，甚至包括非異型增生的黏膜。Brentnall等[13]發(fā)現(xiàn)，伴發(fā)高級(jí)別異型增生或癌的UC患者的結(jié)腸黏膜CPS1及S100P蛋白均呈高表達(dá)，并認(rèn)為CPS1及S100P在預(yù)測UC是否會(huì)向不典型增生或癌變發(fā)展的特異性和敏感性分別為80%、94%和79%、82%，提示檢測UC患者結(jié)直腸黏膜CPS1及S100P可能是識(shí)別UC患者發(fā)生癌變的有效預(yù)測標(biāo)記物。有學(xué)者[14]也發(fā)現(xiàn)，CPS1在預(yù)測UC患者癌變中具有相似的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CPS1和S100P在UC伴上皮內(nèi)瘤變的腸黏膜組織中均顯著表達(dá)，與急性期或緩解期腸黏膜比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示CPS1和S100P在UC相關(guān)的上皮內(nèi)瘤變，以及后續(xù)可能發(fā)生的癌變過程中有明顯作用。但是，因?yàn)楸狙芯恐懈呒?jí)別上皮內(nèi)瘤變只有4例，未能分析CPS1和S100P在低、高級(jí)別中的差異，需要進(jìn)一步收集標(biāo)本分析。而CPS1和S100P在UC急性期腸黏膜低表達(dá)，與對(duì)應(yīng)緩解期表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示二者在沒有上皮內(nèi)瘤變的UC腸黏膜中低表達(dá)，并且和UC的急性期病程發(fā)展沒有相關(guān)性。Planell等[15]也發(fā)現(xiàn)，雖然S100P在UC急性期和緩解期腸黏膜比正常腸黏膜表達(dá)增高，但是兩者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前，CPS1和S100P在UC病程進(jìn)展中是否有協(xié)同作用以及相關(guān)分子通路還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，CPS1和S100P在UC緩解期、急性期、伴上皮內(nèi)瘤變腸黏膜組織中表達(dá)均沒有相關(guān)性，提示CPS1和S100P在UC的病程中可能是獨(dú)立的作用因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CPS1、S100P可能參與UC腸黏膜上皮內(nèi)瘤變的過程，而與UC急性期病程的發(fā)展沒有相關(guān)性，但是CPS1和S100P蛋白促進(jìn)UC相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及相互作用的靶蛋白還不明確，需要進(jìn)一步的研究。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組.我國炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見[J].中華內(nèi)科雜志,2012,51(10):818-831.

[2] Sartor RB. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn′s disease and ulcerative colitis[J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol, 2006,3(7):390-407．

[3] Lobatón T, Ferrante M, Rutgeerts P, et al. Efficacy and safety of anti-TNF therapy in elderly patients with inflammatory bowel disease[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2015,42(4):441-451.

[4] Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis[J]. Gut, 2001,48(4):526-535.

[5] Mikami T, Yoshida T, Numata Y, et al. Invasive behavior of ulcerative colitis associated carcinoma is related to reduced expression of CD44 extracellular domain: comparison with sporadic colon carcinoma[J]. Diagn Pathol, 2011,4(7):1186-1195.

[6] Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation[J]. Nature, 2008,454(7203):436-444.

[7] Prica F, Radon T, Cheng Y, et al. The life and works of S100P - from conception to cancer[J]. Am J Cancer Res, 2016,6(2):562-576.

[8] Jin G, Wang S, Hu XG, et al. Characterization of the tissue-specific expression of the S100P gene which encodes an EF-hand Ca2+-binding protein[J]. Mol Biol Rep, 2003,30(4):243-248.

[9] Shen Z, Deng H, Fang Y, et al. Identification of the interplay between SOX9 and S100P in the metastasis and invasion of colon carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(24):20672-20684.

[10] Shen ZY, Fang Y, Zhen L, et al. Analysis of the predictive efficiency of S100P on adverse prognosis and the pathogenesis of S100P-mediated invasion and metastasis of colon adenocarcinoma[J]. Cancer Genet, 2016,209(4):143-153.

[11] Liu H, Dong H, Robertson K, et al. DNA methylation suppresses expression of the urea cycle enzyme carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) in human hepatocellular carcinoma[J]. Am J Pathol, 2011,178(2):652-661.

[12] Abu-Zeid RM, Farid RM. Role of hepatocyte paraffin 1 antigen in the course of colorectal carcinogenesis[J]. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol, 2013,5(5):177-183.

[13] Brentnall TA, Sheng P, Bronner MP, et al. Proteins that underlie neoplastic progression of ulcerative colitis[J]. Proteomics Clin, 2009,3(11):1326-1335.

[14] May D, Pan S, Crispin DA, et al. Investigating neoplastic progression of ulcerative colitis with label-Free comparative proteomics[J]. J Proteome Res, 2011,10(1):200-209.

[15] Planell N, Lozano JJ, Mora R, et al. Transcriptional analysis of the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis in remission reveals lasting epithelial cell alterations[J]. Gut, 2013,62(7):967-976.

江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(012062003010)；江蘇省中醫(yī)院院級(jí)課題(Y14078)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.015

R574.6

B

1002-266X(2017)10-0047-03

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